劉 萍，周 宏，伍雪橙，黃張建，孔 輝，解衛(wèi)平*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210029；2中國藥科大學(xué)新藥研究中心天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一類由多種病因引起的，以肺動脈壓力異常升高，同時合并不同程度右心功能衰竭為特征的肺血管疾?。?］。PH 在大于65 歲人群中的患病率高達10%，其中低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是最為常見的PH類型之一，常見于慢性缺氧（chronic hypoxia，CH）性肺病患者［2］。目前HPH的治療以原發(fā)病的治療為主，尚無推薦的靶向藥物［3］，無法逆轉(zhuǎn)慢性缺氧導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)和肺血管阻力進行性升高，HPH患者預(yù)后仍然較差，因此探索治療HPH的潛在靶點勢在必行。

研究表明，針對多靶點聯(lián)合用藥已成為治療PH的重要方向。ROCK 信號通路是目前研究PH 發(fā)病機制的熱點之一。ROCK選擇性抑制劑法舒地爾是一種細(xì)胞內(nèi)鈣離子拮抗劑，可阻斷肌球蛋白輕鏈磷酸化，抑制血管收縮、痙攣，被用于治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣、冠狀動脈疾病等［4］，在不同PH實驗動物模型中均有降低肺動脈壓力、抑制肺動脈重塑的功能［5-6］，近期一項臨床研究表明，法舒地爾在重度PH患者中也具有良好的治療效果［7］。此外，丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）信號通路也是PH研究的關(guān)注重點。PDK抑制劑二氯乙酸鹽（dichloroacetate，DCA）可活化細(xì)胞表面Kv1.5 通道，減少鈣離子內(nèi)流，抑制細(xì)胞收縮、增殖，同時可抑制PDK 恢復(fù)丙酮酸脫氫酶活性，改善線粒體能量代謝，維持細(xì)胞正常生理功能［8］，臨床上主要用于治療乳酸性酸中毒和代謝性疾病，也可用于抑制野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺血管重構(gòu)［9］，目前已進入臨床研究階段［10］。基于法舒地爾和DCA在PH動物模型及患者中的治療作用，我們發(fā)現(xiàn)法舒地爾鹽酸鹽解離出的游離胺基可以和二氯乙酸結(jié)合形成一種新型水溶性口服鹽類化合物——法舒地爾二氯乙酸鹽（fasudil dichloroacetate，F(xiàn)DCA）［11］。本研究主要目的在于探討FDCA 對慢性缺氧誘導(dǎo)的PH大鼠的治療作用并揭示其潛在機制，為HPH治療提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級成年健康雄性SD大鼠24只，體重（230±20）g，由南京醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。本研究所有實驗操作經(jīng)由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理審查委員會許可（IACUC-2005021）。

FDCA（中國藥科大學(xué)天然藥物國家重點實驗室制備），實驗動物缺氧箱（杭州艾普儀器設(shè)備有限公司），RIPA 裂解液、BCA 檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），大鼠白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司），肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）ELISA試劑盒、肌球蛋白輕鏈磷酸化酶（myosin light chain phosphorylase，MLCP）ELISA 試劑盒（南京翼飛雪生物科技有限公司），β-actin、ROCK1、ROCK2抗體（Proteintech公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 HPH動物模型的建立及給藥方案

SD大鼠隨機分為4組：對照組（CON組）、CON+FDCA組、CH組、CH+FDCA組，每組6只。將CH組及CH+FDCA組大鼠置于常壓低氧箱中，艙內(nèi)氧氣濃度維持在（10.0±0.1）%，同時放置鈉石灰吸收CO2，變色硅膠吸收水蒸氣。每天開箱1 h 更換飲用水、飼料、墊料、鈉石灰與變色硅膠，其余時間均保持低氧環(huán)境。CON 組與CON+FDCA 組置于正常環(huán)境中。缺氧第15 天開始，CON+FDCA 組及CH+FDCA 組予FDCA（43.3 mg/kg）灌胃治療，CON 及CH 組予等體積生理鹽水，每天1次，于開箱1 h內(nèi)完成，持續(xù)14 d?？?cè)毖鯐r間為28 d。

1.2.2 右心導(dǎo)管檢查及右心室肥厚程度測定

所有大鼠稱重后予以2%戊巴比妥鈉溶液（60mg/kg）腹腔注射麻醉。將麻醉后大鼠仰臥固定于動物操作臺上，分離右頸總靜脈并做一“V”型切口，插入充盈肝素鈉溶液的聚乙烯導(dǎo)管。導(dǎo)管彎頭端經(jīng)上腔靜脈、右心房至右心室，另一端連接壓力換能器，應(yīng)用Powerlab 生物信號采集系統(tǒng)測定右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）。RVSP 測定結(jié)束后處死大鼠，收集大鼠心臟。沿室間隔邊緣游離出右心室（right ventricle，RV）及左心室+室間隔（left ventricle+septum，LV+S）。濾紙吸干水分后分別稱量RV 和LV+S 的重量，計算RV/（LV+S）比值，即為右心室肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RVHI）。

1.2.3 肺小動脈形態(tài)學(xué)分析

寶玉爹說，這本來是岳舞臺老生泰斗丁愛田老先生的絕活，一次偶然的機會，我找他的徒弟偷學(xué)了一點，也只不過學(xué)了一點皮毛而已。

分離左肺上葉，在4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋后制成5 μm 厚度切片并進行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、α-SMA 免疫組織化學(xué)染色及Masson染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肺小動脈病理變化。每張切片隨機拍攝至少20 張直徑30～100 μm 肺小動脈，計算肺小動脈中膜層肥厚程度（pulmonary artery medial thickness，PAMT）=（血管外徑-血管內(nèi)徑）/血管外徑×100%。根據(jù)肺小動脈α-SMA陽性表達部分占血管周徑的比例，將肺小動脈分為非肌化（＜25%）、部分肌化（25%～75%）和完全肌化（＞75%）3種類型，分別統(tǒng)計各類型血管所占百分比。使用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計Masson染色圖片中藍色區(qū)域膠原蛋白沉積面積與總面積的比值，評估肺小動脈外膜纖維化程度。

1.2.4 右心室形態(tài)學(xué)分析

分離右心室組織，在4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋后制成5 μm 厚度切片并進行HE 染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察右心室心肌細(xì)胞病理變化。使用Image J 軟件統(tǒng)計右心室心肌細(xì)胞橫截面積（cross-sectional area，CSA）。

1.2.5 ELISA法檢測肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α以及MLCK、MLCP水平

稱取100 mg 肺組織，剪碎加入1 mL PBS，勻漿后3次凍融使細(xì)胞破壞釋放出細(xì)胞內(nèi)成分，4 ℃離心機，3 000 r/min 離心20 min，收集上清。按照ELISA試劑盒說明書進行分析。肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量最終以pg/mL計算，MLCK、MLCP水平最終以U/L計算。

1.2.6 Western blot 檢測肺組織中ROCK1、ROCK2表達水平

稱取30 mg 大鼠肺組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，剪碎、勻漿，提取肺組織總蛋白。BCA 法測定蛋白含量。蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，加入抗ROCK1、ROCK2抗體（稀釋比例1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次后加入二抗（稀釋比例1∶5 000），室溫孵育1 h。TBST 洗滌3 次后加入ECL 化學(xué)發(fā)光液，置于化學(xué)發(fā)光儀中合適條件下曝光并保存圖像，結(jié)果用Image Lab軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組樣本間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，組間比較使用LSD-t檢驗法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FDCA對HPH大鼠RVSP和RVHI的影響

圖1 FDCA對HPH大鼠RVSP和RVHI的影響Figure 1 Effects of FDCA on RVSP and RVHI in rats with HPH

2.2 FDCA對HPH大鼠右心室心肌細(xì)胞肥大的影響

HE 染色結(jié)果顯示：CON 組與CON+FDCA 組右心室心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，CSA 較?。籆H 組右心室心肌細(xì)胞肥大；CH+FDCA 組心肌細(xì)胞較CH 組變小（圖2A）。右心室CSA 統(tǒng)計結(jié)果顯示：與CON 組及CON+FDCA 組相比，CH 組右心室心肌細(xì)胞CSA 顯著增加；CH+FDCA 組右心室心肌細(xì)胞CSA較CH組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖2B）。

圖2 FDCA對HPH鼠右心室心肌細(xì)胞肥大的影響Figure 2 Effects of FDCA on right ventricular cardiomyocyte hypertrophy in rats with HPH

2.3 FDCA 對HPH 大鼠肺小動脈中膜肥厚及炎癥浸潤的影響

HE 染色結(jié)果顯示：CON 組與CON+FDCA 組肺小動脈結(jié)構(gòu)正常，血管壁薄，血管周圍無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；CH組肺小動脈中膜層增厚，血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤；CH+FDCA組肺小動脈中膜層較CH 組變薄，炎癥細(xì)胞浸潤程度較CH 組減輕（圖3A）。PAMT統(tǒng)計結(jié)果顯示：與CON組及CON+FDCA組相比，CH組PAMT顯著增加；CH+FDCA組PAMT較CH組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖3B）。

圖3 FDCA對HPH大鼠肺小動脈中膜肥厚的影響Figure 3 Effects of FDCA on pulmonary arterial medial thickness in rats with HPH

2.4 FDCA對HPH大鼠肺小動脈肌化程度的影響

α-SMA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：CON組及CON+FDCA 組肺小動脈壁α-SMA 陽性區(qū)域較少；CH組肺小動脈壁α-SMA陽性區(qū)域增加；FDCA治療可以減少血管周圍α-SMA 陽性沉積（圖4A）。肌化血管類型統(tǒng)計結(jié)果顯示：CON組及CON+FDCA組肺小動脈以非肌化血管為主，CH組完全肌化血管比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與CH組相比，CH+FDCA可以顯著減少完全肌化血管比例，肌化程度以非肌化和部分肌化為主（P＜0.01，圖4B）。

圖4 FDCA對HPH大鼠肺小動脈肌化程度的影響Figure 4 Effects of FDCA on muscularization of pulmonary artery in rats with HPH

2.5 FDCA對HPH大鼠肺小動脈外膜纖維化的影響

Masson染色結(jié)果顯示：CON組與CON+FDCA組肺小動脈外膜層僅有少量藍色膠原沉積，CH 組肺小動脈外膜層藍色膠原沉積區(qū)域增加，CH+FDCA組藍染區(qū)域較CH組減輕（圖5A）。肺小動脈外膜纖維化程度統(tǒng)計結(jié)果顯示：與CON組及CON+FDCA組相比，CH 組肺小動脈外膜纖維化程度顯著增加；CH+FDCA 組肺小動脈外膜纖維化程度較CH 組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖5B）。

圖5 FDCA對HPH大鼠肺小動脈外膜纖維化的影響Figure 5 Effects of FDCA on fibrosis of pulmonary arteriolar adventitia in rats with HPH

2.6 FDCA 對HPH 大鼠肺組織中炎癥因子水平的影響

ELISA法檢測肺組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。統(tǒng)計結(jié)果顯示：CON 組及CON+FDCA 組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達均無明顯差異（P＞0.05，圖6）。與CON 組相比，CH 組肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α的表達均明顯增加；CH+FDCA 組肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α的表達較CH組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖6）。CH+FDCA組TNF-α的表達水平與CON組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖6C）。

圖6 FDCA對HPH大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α表達的影響Figure 6 Effects of FDCA on expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in pulmonary tissues of rats with HPH

2.7 FDCA對HPH大鼠肺組織中MLCK和MLCP表達水平的影響

ELISA 法檢測肺組織勻漿中MLCK 和MLCP 的水平。統(tǒng)計結(jié)果顯示：CON 組及CON+FDCA 組MLCK、MLCP的表達水平均無明顯差異（P＞0.05）。與CON 組相比，CH 組肺組織勻漿中MLCK表達水平明顯增加，MLCP 表達水平明顯降低；CH+FDCA 組與CH 組相比，肺組織中MLCK 表達水平降低，MLCP 表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖7）。CH+FDCA 組肺組織MLCK、MLCP 的表達水平與CON 組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖7 FDCA對HPH大鼠MLCK、MLCP表達的影響Figure 7 Effects of FDCA on expression of MLCK and MLCP in rats with HPH

2.8 FDCA 對HPH 大鼠肺組織中ROCK1、ROCK2蛋白表達的影響

Western blot 半定量結(jié)果顯示：CON 組及CON+FDCA 組ROCK1、ROCK2的表達水平均無明顯差異（P＞0.05）。與CON 組相比，CH 組肺組織勻漿中ROCK1、ROCK2 表達水平均明顯增加；CH+FDCA組與CH 組相比，肺組織中ROCK1、ROCK2 表達水平均有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖8）；與CON 組相比，CH+FDCA 組肺組織ROCK1、ROCK2 的表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖8 FDCA對HPH大鼠ROCK1、ROCK2表達的影響Figure 8 Effects of FDCA on expression of ROCK1 and ROCK2 in rats with HPH

3 討論

HPH 是臨床上常見的一類PH，常繼發(fā)于慢性阻塞性肺疾病、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征、間質(zhì)性肺病、慢性高原病等慢性缺氧性疾?。?2］。HPH 的發(fā)生發(fā)展過程與肺血管結(jié)構(gòu)、功能異常密切相關(guān)。慢性缺氧可以引起炎癥反應(yīng)、肺血管收縮、肺動脈重構(gòu)（包括肺血管床內(nèi)膜損傷、中膜肥厚與外膜纖維化），導(dǎo)致遠端肺小血管閉塞，肺動脈管腔逐漸狹窄，肺血管阻力進行性升高，進而出現(xiàn)右心功能衰竭甚至死亡［13-15］。本研究采用慢性缺氧誘導(dǎo)的大鼠PH模型，探討FDCA對HPH的治療作用。結(jié)果顯示缺氧4 周大鼠RVSP 異常升高，右心室代償性肥厚，伴隨明顯的肺血管壁肥厚、肌化以及纖維化，提示成功構(gòu)建HPH大鼠模型。FDCA可緩解慢性缺氧誘導(dǎo)的大鼠肺血管重構(gòu)，調(diào)節(jié)血流動力學(xué)參數(shù)，減輕右心室肥厚，提示FDCA對HPH具有良好的治療作用。

缺氧誘導(dǎo)的肺血管重構(gòu)是HPH 重要的發(fā)病機制。肺血管重構(gòu)是遺傳因素、表觀遺傳因素以及環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。近年來，炎癥反應(yīng)在肺血管重構(gòu)中的作用備受關(guān)注［16］。研究發(fā)現(xiàn)PH動物模型及PH患者肺組織中均可見大量炎癥細(xì)胞在重構(gòu)的肺血管周圍積累并向血管內(nèi)浸潤。這些肺血管細(xì)胞和炎癥細(xì)胞可在局部產(chǎn)生大量細(xì)胞因子和趨化因子，主要包括IL-1β、IL-6、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和趨化因子-5等。這些促炎細(xì)胞因子和趨化因子表達增加，可進一步促進血管細(xì)胞過度收縮與增殖，導(dǎo)致肺血管重塑［17］。研究表明，促炎性細(xì)胞因子水平升高的PH 患者臨床預(yù)后較差，其中IL-6、IL-8、IL-10 等細(xì)胞因子的表達水平與PH 患者生存惡化相關(guān)［18-19］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)DCA可顯著抑制HPH 模型大鼠肺組織中重構(gòu)血管周圍的炎癥細(xì)胞浸潤及肺組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達，提示FDCA可減輕缺氧誘導(dǎo)的肺組織慢性炎癥反應(yīng)，這可能是其減輕肺小血管重構(gòu)的重要原因之一。

肺血管重構(gòu)機制復(fù)雜，涉及多個信號通路，其中ROCK通路是研究的熱門通路之一。ROCK蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，是小GTP酶Rho A下游的效應(yīng)分子，有ROCK1和ROCK2兩個同工型，在人體內(nèi)參與調(diào)控細(xì)胞形態(tài)、增殖、黏附和運動等重要的生物過程，在心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、代謝疾病及癌癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［20-21］。ROCK1 和ROCK2 結(jié)構(gòu)相似，具有高度的序列同源性，可以共享相同的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。這兩種亞型的ROCK分布廣泛，ROCK1 主要在肺組織、肝、腎、脾和炎癥細(xì)胞中大量表達，ROCK2主要分布在心臟、血管、肌肉（包括平滑?。?2］。ROCK蛋白在HPH患者及動物模型肺組織中表達上調(diào)，參與炎癥反應(yīng)、肺血管收縮、肺血管重構(gòu)等多個病理生理過程，但ROCK1和ROCK2的作用尚不完全明確。研究表明，在缺氧條件下，ROCK2通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、促進炎性細(xì)胞因子分泌調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，促進肺血管重構(gòu)［23-24］。在新生血管內(nèi)膜形成過程中，ROCK1參與炎癥細(xì)胞的募集、炎癥因子的釋放、血管細(xì)胞的增殖、內(nèi)皮黏附分子的表達以及血管平滑肌細(xì)胞遷移［20］。在心臟組織中，研究證明使用ROCK抑制劑可抑制小鼠病理性心肌肥大與心臟重塑［25］。本研究HPH模型大鼠肺組織中ROCK1和ROCK2的表達上調(diào)，F(xiàn)DCA可抑制慢性缺氧誘導(dǎo)的ROCK1和ROCK2的表達，提示FDCA可能部分通過抑制ROCK通路抑制炎癥反應(yīng)、減輕肺血管重構(gòu)和右心室肥厚。

缺氧誘導(dǎo)的肺血管舒縮功能失調(diào)是HPH 肺血管阻力持續(xù)性升高的重要病理生理機制。MLCK和MLCP通過調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈磷酸化水平來調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮的一組關(guān)鍵酶。MLCK 是一種鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶，可使肌球蛋白輕鏈磷酸化，觸發(fā)肺血管收縮；而MLCP 負(fù)責(zé)使磷酸化的肌球蛋白輕鏈脫磷酸，維持血管舒張，兩者處于動態(tài)平衡狀態(tài)。研究表明，缺氧可抑制離子通道Kv1.5，升高肺動脈平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度，上調(diào)MLCK 表達，誘導(dǎo)細(xì)胞收縮，即鈣依賴的細(xì)胞收縮。DCA 可抑制PDK 活性使Kv1.5 表達增加，減少肺動脈平滑肌細(xì)胞鈣離子內(nèi)流，從而抑制MLCK活性，改善肺血管收縮［26］。另一方面，缺氧激活ROCK通路，通過磷酸化MLCP的肌球蛋白結(jié)合亞基使MLCP失活，促進細(xì)胞收縮，即非鈣依賴的細(xì)胞收縮。法舒地爾可抑制ROCK恢復(fù)MLCP活性，使細(xì)胞恢復(fù)舒張狀態(tài)。在缺氧誘導(dǎo)的雙重收縮機制下，肺動脈持續(xù)收縮，肺血管阻力進行性升高［27-28］。本研究中，F(xiàn)DCA治療逆轉(zhuǎn)了HPH模型大鼠肺組織中MLCK表達的增加和MLCP表達的降低，提示FDCA可同時作用于鈣離子依賴的收縮機制和非鈣依賴的收縮機制，抑制肺血管收縮，這可能是FDCA治療HPH的另一重要機制。

綜上所述，F(xiàn)DCA 可同時靶向ROCK 通路和PDK通路，通過多個機制共同抑制慢性缺氧誘導(dǎo)的肺血管收縮與重構(gòu)，降低肺動脈壓力，緩解右心室肥大，在HPH 動物模型上的治療效果顯著。且FDCA的兩個基礎(chǔ)藥物法舒地爾與DCA 已在臨床廣泛使用，其安全性已被證實。然而，F(xiàn)DCA 作為一個分子，其相對于法舒地爾和DCA 的組合，在整體的組織分布和生物利用度方面有哪些優(yōu)勢，仍需要進一步研究來揭示潛在的機制。此外，DCA抑制PDK活性、恢復(fù)細(xì)胞能量代謝后對ROCK 通路是否有所影響，也需要深入的細(xì)胞分子生物學(xué)研究來闡明?？傊狙芯拷Y(jié)果表明，F(xiàn)DCA有望成為未來治療HPH的候選藥物之一。