李 昊，張林凱，張 晶

南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是困擾人類的一種頑癥，被定義為一種病因不明、發(fā)病機(jī)制不清的彌散性肺間質(zhì)疾?。?］。近年來，肺纖維化在國內(nèi)外的發(fā)病率呈顯著上升趨勢，已成為全球范圍內(nèi)關(guān)注的健康問題。IPF預(yù)后差，患者5年存活率僅為20%，目前尚無治愈方法［2］。目前認(rèn)為肺纖維化的發(fā)展主要分為2 個階段：①早期肺泡炎癥階段，肺部浸潤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞會分泌一系列細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、趨化因子CXC 等，促進(jìn)炎性細(xì)胞進(jìn)一步聚集；②后期纖維化階段，活化的間質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞）及炎癥細(xì)胞會分泌生長因子［如轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）］和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）等參與肺組織重構(gòu)，導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生。

TGF-β被認(rèn)為是肺纖維化進(jìn)程中最重要的細(xì)胞因子，作為關(guān)鍵性的致纖維化因子參與肺纖維化的損傷和修復(fù)過程，并且它能誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的一個關(guān)鍵步驟，肺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化為成纖維樣細(xì)胞是導(dǎo)致肺纖維化的重要原因［3］。文獻(xiàn)報道在IPF 患者的肺組織中檢測到c-FLIP（L）蛋白的異常表達(dá)［4-5］。c-FLIP（L）具有caspase-8 類似結(jié)構(gòu)，由DED 結(jié)構(gòu)域和caspase 樣結(jié)構(gòu)域組成，是一個無活性的蛋白酶樣蛋白質(zhì)。c-FLIP（L）作為caspase-8的抑制因子，能有效抑制死亡受體家族（death receptor，DR）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［6］。除了抗凋亡功能外，c-FLIP（L）還被報道參與了EMT介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞遷移與轉(zhuǎn)移，如在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，TNF-α和TGF-β信號能夠上調(diào)c-FLIP（L）表達(dá)，與細(xì)胞遷移密切相關(guān)［7］，黑色素瘤B16F10 細(xì)胞中c-FLIP（L）高表達(dá)促進(jìn)EMT 關(guān)鍵分子Snail 表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞運動［8］，以及環(huán)狀RNAcircPVT1 調(diào)控c-FLIP 表達(dá)，能增強(qiáng)EMT誘導(dǎo)骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［9］。

在肺纖維化過程中，c-FLIP（L）表達(dá)水平的變化影響了肺泡上皮細(xì)胞對凋亡的敏感性，那么它的表達(dá)是否還會影響肺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，成為肺纖維化發(fā)展的一個誘因呢？這是探究肺纖維化可能發(fā)病機(jī)制的新切入點，為靶向EMT的肺纖維化治療提供新的潛在靶點。本研究通過建立博來霉素（bleomycin，BLM）誘導(dǎo)的肺纖維化模型，探討c-FLIP（L）表達(dá)與EMT發(fā)生及肺纖維化的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 材料

C57BL/6 小鼠，8 周齡，雄性（體重18～20 g），健康SPF級，購于南京大學(xué)模式動物研究所。人源肺癌上皮細(xì)胞株A549購自美國ATCC。FLIP-A549穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株為實驗室保存。

戊巴比妥鈉（上海生工公司），BLM（化藥株氏會社，日本），Masson 染色試劑盒（福州邁新生物科技有限公司）；FLIP 抗體（3210s，C Signaling TechnologyTM）、Vimentin 抗體（BD 550513，BD PharmingenTM）和E-Cadherin 抗體（#610181，BD PharmingenTM）（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司）；Smad-luc報告基因（上海吉滿生物科技公司）；FLIP siRNA（5′-GCAGUCUGUUCAAGGAGCATT-3′）（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型的建立及鑒定

C57BL/6小鼠采用隨機(jī)法分為對照組、BLM組，每組6 只。各組小鼠腹腔注射50 μL 的3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，仰臥固定在實驗臺上，將頸部皮膚鈍性分離暴露出氣管。注射針頭沿氣管輕輕注入0.1 mL BLM（2.5 mg/kg），對照組注入等量生理鹽水，注射完成后采用醫(yī)用縫合線進(jìn)行氣管及周圍皮膚的縫合。造模后28 d 處死小鼠，取肺組織置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，按試劑盒說明進(jìn)行Masson染色及HE染色，顯微鏡觀察肺組織結(jié)構(gòu)。

1.2.2 免疫組化染色

肺組織石蠟切片經(jīng)60 ℃烤片、常規(guī)脫蠟，抗原修復(fù)，3%H2O2室溫孵育15 min 等操作后進(jìn)行封閉，3%山羊血清室溫封閉30 min后，每張切片滴加適當(dāng)濃度的一抗溶液50 μL，4 ℃過夜。次日，將切片PBST 漂洗5 min×3 次，滴加50 μL 聚合物增強(qiáng)劑（A劑），室溫30 min后PBST漂洗5 min×3次。然后，滴加預(yù)備好的顯色劑DAB 工作液50 μL 觀察顯色，用流水沖洗終止顯色。最后，切片進(jìn)行分化、脫水、透明等一系列處理后，滴入中性樹脂進(jìn)行固定封片，光學(xué)觀察拍照。

1.2.3 Western blot分析

收集細(xì)胞樣品收集細(xì)胞用預(yù)冷PBS 洗兩次，加入RIPA 液（P0013，上海碧云天生物技術(shù)公司）裂解細(xì)胞，冰上放置20 min 后12 000 r/min離心10 min，收集上清。蛋白質(zhì)定量后加入上樣緩沖液煮沸5 min。取適量點樣進(jìn)行10% SDS-PAGE 凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜。樣品膜進(jìn)行5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，包被一抗溶液4 ℃過夜。次日PBST 洗膜5 min×4 次，包被二抗溶液室溫1 h，PBST 洗滌后滴加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，采用蛋白分析儀拍攝后進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.4 Q-PCR分析

收取細(xì)胞，采用TRIzol法提取RNA，使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)公司）獲得DNA。根據(jù)實驗需要，取適量上述逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 配制20 μL 體系，使用Real-time PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用Quantitation-comparative CT（Livak）法即ΔΔCT法測定進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有Q-PCR 引物購于南京金斯瑞公司。E-cadherin引物：上游5′-TGCACCAACCCTCATGAGTG-3′和下游5′-GTCAGTATCAGCCGCTTTCAG-3′；N-cadherin引物：上游5′-GTCAGTATCAGCCGCTTTCAG-3′和 下 游5′-ATTGATGCTGACGATCCCAATGCC-3′；Vimentin 引物：上游5′-TCAAGTCCAGCTGCCACTGTGATCA-3′和下游5′-TGCAGGCTCAGATTCAGGA-3′；GAPDH 引物：上游5′-GAGCAGGTCTTGGTATTCACG-3′和下游5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′。

1.2.5 Smad報告基因檢測

A549 細(xì)胞接種于24 孔板，次日轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA（含Smad-luc 報告基因質(zhì)粒和pRL 質(zhì)粒），24 h 后采用TGF-β1（10 ng/mL）處理12 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，然后每孔加入50 μL passive lysis buffer 裂解20 min，細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)入EP管4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清，采用雙熒光素酶試劑盒（E1910，Promega 公司，美國），按說明書操作，上樣測定熒光素酶的活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行結(jié)果分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c-FLIP（L）在肺纖維化中高表達(dá)與EMT相關(guān)

采用BLM構(gòu)建小鼠肺纖維化模型，造模28 d后處死小鼠，制備肺組織切片進(jìn)行HE 染色和Masson染色（圖1）。HE 染色顯示對照組肺泡結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)網(wǎng)孔狀分布，而BLM 組中肺泡結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，肺泡數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則。Masson染色顯示膠原沉積，它是成纖維細(xì)胞增生的指標(biāo)。對照組Masson染色肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔未見增厚和纖維化表現(xiàn)，BLM 組肺組織中可見大量膠原沉積，肺纖維化嚴(yán)重，說明造模成功。

圖1 BLM構(gòu)建肺纖維化模型的鑒定（×200）Figure 1 Identification of pulmonary fibrosis model constructed by BLM（×200）

E-Cadherin 是EMT 的特異性上皮標(biāo)志物，主要表達(dá)在肺泡上皮細(xì)胞表面。采用免疫組化染色來驗證c-FLIP（L）表達(dá)是否參與纖維化病程中EMT的發(fā)生。免疫組化染色結(jié)果顯示，E-Cadherin 在正常肺泡上皮細(xì)胞和柱狀氣管上皮細(xì)胞中大量表達(dá)，BLM 組纖維化的肺組織中E-cadherin 表達(dá)下調(diào)，而c-FLIP（L）染色結(jié)果與E-cadhesin變化相反，肺纖維化組織中c-FLIP（L）表達(dá)升高，并且在其相應(yīng)深染位置上E-cadherin表現(xiàn)為低表達(dá)（圖2A）。定量分析顯示，BLM組與對照組比較，E-cadherin下調(diào)以及c-FLIP（L）上調(diào)，差異都有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，n=3，圖2B），這些關(guān)聯(lián)提示c-FLIP（L）高表達(dá)參與肺纖維化過程中EMT的發(fā)生。

圖2 免疫組化染色觀察E-Cadherin及c-FLIP的表達(dá)分布Figure 2 Expression and distribution of E-Cadherin and c-FLIP observed by immunohistochemical staining

2.2 C-FLIP（L）高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞EMT表型

為了確定c-FLIP（L）表達(dá)參與肺上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生，在細(xì)胞水平上采用肺癌上皮細(xì)胞株A549為背景構(gòu)建c-FLIP-A549 穩(wěn)定表達(dá)株，對其細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察。與空載質(zhì)粒構(gòu)建的對照組相比，c-FLIP-A549穩(wěn)定株#1和#2細(xì)胞偏長梭形，細(xì)胞間黏附減少，顯示出類EMT 現(xiàn)象（圖3A），其c-FLIP（L）表達(dá)水平升高（圖3B）。進(jìn)一步對EMT 標(biāo)志分子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 進(jìn)行qRT-PCR 檢測，結(jié)果顯示c-FLIP-A549 穩(wěn)定株中E-cadherin mRNA 表達(dá)下調(diào)而N-cadherin mRNA 表達(dá)上調(diào)（P＜0.001，n=3），Vimentin mRNA 相應(yīng)升高（P＜0.05，n=3，圖3C）。這些標(biāo)志物的變化說明c-FLIP（L）高表達(dá)能促進(jìn)EMT發(fā)生。

圖3 c-FLIP（L）高表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象Figure 3 Overexpresion of c-FLIP（L）promotes EMT-like phenotype

2.3 c-FLIP（L）調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的EMT

采用TGF-β1 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞EMT 發(fā)生，檢測c-FLIP（L）高表達(dá)對TGF-β1 誘導(dǎo)EMT 過程的影響。Smads 是細(xì)胞內(nèi)重要的TGF-β1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子，報告質(zhì)粒Smad-luc 的luciferase 活性反映Smad 通路的激活狀態(tài)。在TGF-β1 刺激下，c-FLIP（L）過表達(dá)細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的luciferase 活性（P＜0.05，n=3，圖4），說明Smad通路的激活程度高，表明c-FLIP表達(dá)能促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的Smad信號通路的激活。

圖4 c-FLIP（L）過表達(dá)增強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)Smad通路的激活Figure 4 c-FLIP（L）enhances the activation of Smad pathway induced by TGF-β1

為了進(jìn)一步驗證c-FLIP（L）調(diào)控EMT 發(fā)生，采用c-FLIP siRNA 干擾片段敲減內(nèi)源性c-FLIP（L）的表達(dá)，結(jié)果顯示FLIP-2 siRNA 干擾片段能有效敲減內(nèi)源性c-FLIP（L）的表達(dá)水平（圖5A）。接著，采用FLIP-2 siRNA 轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，加入20 ng/mL TGF-β1 誘導(dǎo)細(xì)胞EMT 發(fā)生，Western blot檢測EMT 標(biāo)志蛋白表達(dá)變化。對照組NC siRNA中TGF-β1誘導(dǎo)的E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)及Vimentin表達(dá)水平上升（P＜0.001，n=3，圖5B），而FLIP-2 siRNA 有效抑制了TGF-β1 誘導(dǎo)的EMT 現(xiàn)象，抑制了E-cadherin 蛋白水平的下調(diào)，也減弱了Vimentin表達(dá)水平的上調(diào)，說明下調(diào)c-FLIP（L）表達(dá)水平能阻滯EMT的進(jìn)程。

圖5 敲減c-FLIP（L）能夠阻滯TGF-β1誘導(dǎo)的EMT發(fā)生Figure 5 Knockdown of c-FLIP（L）inhibits the process of EMT induced by TGF-β1

3 討論

越來越多的數(shù)據(jù)表明，在肺纖維化發(fā)展中，EMT是成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞的一個重要來源［2］。來源于肺組織的上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)時，在促纖維化因子TGF-β1的誘導(dǎo)下能夠轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞［10］。肺纖維化組織中TGF-β1高表達(dá)不僅能促進(jìn)EMT發(fā)生，還能促進(jìn)成纖維細(xì)胞過度增殖和分化，因此，TGF-β1是肺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因子。另有研究表明，炎性因子TNF-α能夠促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT發(fā)展［11］，但其作用機(jī)制并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)c-FLIP（L）能夠促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT 發(fā)生，而c-FLIP（L）是NF-κB 的靶基因，能被TNF-α誘導(dǎo)上調(diào)，這一發(fā)現(xiàn)為TNF-α促TGF-β1 誘導(dǎo)EMT 發(fā)生提供了可能的分子機(jī)制。肺纖維化發(fā)展的早期是肺泡炎癥，肺部浸潤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子是TNF-α，在IPF患者的肺組織中檢測到c-FLIP（L）蛋白的異常表達(dá)［4-5］，綜合這些報道，推測在肺纖維化過程中c-FLIP 高表達(dá)與EMT發(fā)生密切相關(guān)，是調(diào)控肺纖維化發(fā)展的重要誘因之一。

雖然C-FLIP（L）是重要的一種抗凋亡蛋白，但具有多種生物學(xué)功能。我們前期研究報道了c-FLIP（L）能夠進(jìn)入細(xì)胞核參與AP-1 轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控［13］。而文獻(xiàn)報道AP-1家庭成員c-Jun可以導(dǎo)致上皮細(xì)胞極性缺失，c-Fos 可降低細(xì)胞間的粘連，JunD 活性影響MMP 表達(dá)，這些都與EMT 關(guān)系密切［14］。此外，我們還發(fā)現(xiàn)c-FLIP（L）能進(jìn)入胞核參與catenin/TCF 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物調(diào)控β-catenin下游靶基因的表達(dá)［15］，而TGFβ1 信號能激活Wnt/catenin 通路與Smad 通路產(chǎn)生crosstalk促進(jìn)EMT轉(zhuǎn)化［16］。這些發(fā)現(xiàn)都為c-FLIP參與EMT發(fā)生提供了有力依據(jù)。

在BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，肺組織切片的免疫組化分析顯示c-FLIP（L）高表達(dá)與E-cadherin 低表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示c-FLIP（L）參與了肺纖維化過程中的EMT發(fā)生。在細(xì)胞水平，進(jìn)一步實驗證明c-FLIP（L）高表達(dá)能夠增強(qiáng)TGF-β1 誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程。盡管c-FLIP（L）調(diào)控EMT的作用機(jī)制以及參與肺纖維化的作用機(jī)制還有待闡明，但本研究提出了肺纖維化中c-FLIP（L）的異常表達(dá)可能是IPF 治療的潛在靶點，從新的角度探究肺纖維化的發(fā)病機(jī)制，靶向EMT調(diào)控為緩解肺纖維化疾病進(jìn)展提供新的可能途徑。