熊展博，趙圣國，王加啟

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193

0 引言

脲酶（EC3.5.1.5）又稱尿素胺基水解酶，是一種高活性的非氧化還原金屬酶[1]，其具有催化尿素分解產(chǎn)生二氧化碳和氨的能力[2]。相較于非催化反應(yīng)，在脲酶催化作用下的尿素分解速度提高1.0×104～1.0×105倍，脲酶也被認(rèn)為是目前已知的催化效率最高的水解酶[3]。在畜牧業(yè)中，尿素作為脲酶底物，是一種重要的反芻動物非蛋白氮飼料原料，可替代30%左右的蛋白飼料[4]。由于脲酶活性過高，使得尿素快速分解生成二氧化碳和氨，尿素分解速度大于尿素被利用的速度，從而降低了尿素的利用率和微生物蛋白合成效率，而且尿素氮的過度排放，造成環(huán)境污染[5]。反芻動物瘤胃內(nèi)短期產(chǎn)大量氨氣提高血液中氨濃度，對動物機體的生產(chǎn)性能造成不利影響[6]。在環(huán)境生態(tài)方面，土壤中存在大量產(chǎn)脲酶微生物，脲酶高效的催化機制導(dǎo)致pH值的快速上升，導(dǎo)致氨揮發(fā)引發(fā)了大量土壤氮流失[7]。在人體健康方面，目前已知多種細(xì)菌脲酶是人類病原體的毒力因子，包括幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）和新生隱球菌（Cryptococcus neoformans）[8]。目前，脲酶抑制劑可以有效調(diào)控脲酶活性，減少產(chǎn)氨反應(yīng)。鑒于此，本文將按照細(xì)菌脲酶活性中心的結(jié)構(gòu)特征、尿素水解機制和抑制劑調(diào)控脲酶活性機制進(jìn)行闡述，研究細(xì)菌脲酶分解尿素的機制為有效調(diào)控脲酶活性提供理論基礎(chǔ)，探討化合物抑制脲酶活性的機制，以期對設(shè)計和合成新型環(huán)境友好脲酶抑制劑提供理論支持和參考。

1 細(xì)菌脲酶活性中心的結(jié)構(gòu)特征

1.1 蛋白復(fù)合體

不同細(xì)菌脲酶結(jié)構(gòu)蛋白的亞基數(shù)量與種類不同，但是不同細(xì)菌脲酶同一亞基具有同源性。第一個獲得三維脲酶結(jié)構(gòu)的產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶（Klebsiella Aerogenesurease，KAU）結(jié)構(gòu)蛋白由UreA、UreB、UreC基因編碼的γ、β、α亞基組成，大多數(shù)細(xì)菌脲酶中，四級結(jié)構(gòu)由三聚體（αβγ）3組成，三聚體有三個相同的活性位點均位于α亞基中，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌脲酶是由（αβγ）3低聚體組裝成四面對稱的十二聚合體[（αβγ）3]4空心球體結(jié)構(gòu)，幽門螺旋桿菌脲酶由4 個（αβ）3三聚體組成[（αβγ）3]4復(fù)合球體結(jié)構(gòu)[9]（圖1）。

圖1 不同細(xì)菌脲酶蛋白結(jié)構(gòu)的組裝方式[9]

1.2 活性中心結(jié)構(gòu)

隨著三維（3D）結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的日益成熟，高分辨率脲酶蛋白結(jié)構(gòu)被越來越多的發(fā)現(xiàn)。目前蛋白數(shù)據(jù)庫（PDB）中含有312 個細(xì)菌源脲酶結(jié)構(gòu)，其中來源于產(chǎn)氣克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）（31個），巴氏芽孢桿菌（Sporosarcina pasteurii）（26個），大腸桿菌（Escherichia coli）（34 個），缺陷短波單胞菌（Brevundimonas diminuta）（25 個），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（10 個），綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（9 個），幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）（4 個），炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）（2 個），小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）（2 個）等。

脲酶活性位點位于UreC編碼的α亞基中，每個活性位點含有兩個鎳離子（Ni2+），每個金屬離子都與2 個組氨酸殘基的咪唑N原子結(jié)合，并與遠(yuǎn)端的中性水分子結(jié)合[10]，存在活性口袋中的水分子不僅與蛋白質(zhì)主鏈或者氨基酸側(cè)鏈形成氫鍵，而且這些水分子之間相互形成氫鍵構(gòu)成一個水合網(wǎng)絡(luò)?；钚晕稽c附近具有一個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序（Helix-Turn-Helix），被稱作Flap區(qū)域（圖2），其功能是控制底物進(jìn)入催化部位和釋放產(chǎn)物[3]。Flap區(qū)域上組氨酸的質(zhì)子化狀態(tài)決定活性口袋的開放構(gòu)象和閉合構(gòu)象，并且受pH值的影響。例如在pH值6.5～7.0范圍內(nèi)，巴氏芽孢桿菌的αHis323以50%的質(zhì)子化和50%的中性形式存在；pH值＜6.5時，脲酶晶體結(jié)構(gòu)的鎳離子占有率比較低，F(xiàn)lap區(qū)域的電子密度弱，過酸條件破壞了活性中心的蛋白支架；而在pH值＞7.5條件下脲酶蛋白結(jié)晶困難。通過閉合活動瓣，使脲酶蛋白Flap區(qū)域上組氨酸殘基接近活性位點，達(dá)到穩(wěn)定活性口袋中尿素末端氨基的目的[11]（圖3）。

圖2 脲酶活性中心結(jié)構(gòu)[10]

圖3 巴氏芽胞桿菌脲酶活性中心Flap 區(qū)域的閉合（寶藍(lán)色）和開放（透明藍(lán)色）結(jié)構(gòu)圖[11]

2 尿素水解機制

尿素上的羰基氧與脲酶活性中心的Ni（1）螯合，然后在覆蓋活性中心的Flap區(qū)域的構(gòu)象發(fā)生改變，脲酶活性口袋形成閉合構(gòu)象，尿素上的氨基氮與Ni（2）進(jìn)行結(jié)合，使尿素的中心碳原子缺乏電子。鎳橋上的氫氧化物對尿素中心缺電碳原子更容易進(jìn)行親核攻擊，一個質(zhì)子從金屬橋聯(lián)的C-OH基團(tuán)轉(zhuǎn)移到氨基末端，產(chǎn)生的C-NH3+鍵斷裂后產(chǎn)生氨分子。Flap區(qū)域活動瓣打開后會釋放出氨和氨基甲酸鹽，后者會自發(fā)水解成一分子氨和碳酸氫鹽分子[2]（圖4）。

圖4 脲酶水解尿素的模式圖[2]

3 抑制劑調(diào)控脲酶活性機制

脲酶活性的調(diào)控依賴于抑制劑化合物，目前，常用的脲酶抑制劑為乙酰氧肟酸。

乙酰氧肟酸（AHA）（分子式為C2H5NO2）屬于異羥肟酸化合物，具有良好的金屬螯合能力，乙酰氧肟酸可以與脲酶活性中心的鎳離子進(jìn)行螯合，使其失去催化尿素分解的活性。在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用于脲酶抑制劑領(lǐng)域，通過降低反芻動物生產(chǎn)中氮排出，提高動物的尿素等非蛋白氮利用效率。此外，AHA也是重要的人體藥物。

關(guān)于乙酰氧肟酸在脲酶催化位點的作用機制已經(jīng)被充分證實，根據(jù)Zerner等[12]的研究表明，在正常pH值下天然刀豆脲酶的兩個鎳離子分別與1 個水分子和1 個氫氧根離子配位，活性中心是由與αAsp360連接的羧基[13]、αCys319硫醇的巰基[14]和組氨酸上的未知基團(tuán)組成[15]。在此模型下，AHA的共振形式與鎳離子雙齒方式配位，該形式下的AHA-Ni復(fù)合物由活性部位附近陰離子（未知的堿基）平衡電位。與鎳離子配位的氫氧根離子對AHA羰基氧的親核攻擊可能導(dǎo)致更穩(wěn)定復(fù)合物的形成，進(jìn)而導(dǎo)致脲酶失活。該機制被Morrison和Walsh歸類為經(jīng)典的快速結(jié)合競爭抑制機制[16，17]。

Stemmler 等[18]首次將乙酰氧肟酸與脲酶活性中心鎳離子結(jié)晶，并確定該復(fù)合物的X射線結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)乙酰氧肟酸通過羥肟酸鹽和羰基氧以雙齒形式與鎳離子結(jié)合，并且兩個鎳離子形成二聚肟橋。雖然已經(jīng)有大量二聚肟絡(luò)合物相關(guān)研究[19]，但是異羥肟酸氧與過渡金屬的橋聯(lián)雙齒形式是首次被觀察到[20]。廣泛認(rèn)可的機制是異羥肟酸酯的羰基氧與活性位點一個鎳離子結(jié)合，隨后橋聯(lián)鎳離子的羥基陰離子對異羥肟酸的羰基碳的親核攻擊，出現(xiàn)二聚肟橋結(jié)構(gòu)，從而形成更穩(wěn)定的脲酶-抑制劑復(fù)合物，這是一種類似底物結(jié)合的過渡態(tài)四面體，阻止活性中心與底物結(jié)合達(dá)到抑制效果。

Matthew 通過對位于產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶（Klebsiella Aerogenes Urease，KAU）活性部位的Flap區(qū)域上半胱氨酸319位點進(jìn)行定點突變，發(fā)現(xiàn)該氨基酸殘基在催化中不起重要作用，但是對脲酶穩(wěn)定性有影響。突變獲得多種變異體，發(fā)現(xiàn)變異體Cys319A具有接近野生型的活性和更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。Cys319A與AHA結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)表明：AHA與活性中心的兩個鎳離子結(jié)合，AHA的羰基氧與Ni（1）相互作用并且與His219的氮原子形成氫鍵，另一個氧原子橋聯(lián)兩個鎳離子。AHA取代活性位點中三個水分子（Wat-500、Wat-501和Wat-502）的空間位置，AHA的氮原子與Ala363主鏈羰基氧形成了額外的氫鍵。與AHA結(jié)合的Cys319A脲酶和天然Cys319A脲酶相比沒有明顯構(gòu)象變化（圖5）。AHA的甲基與His320的氮原子相互作用可能迫使Flap區(qū)域活性瓣遠(yuǎn)離活性位點，成為無序狀態(tài)[21]。

圖5 與AHA 結(jié)合的Cys319A 脲酶和天然Cys319A 脲酶結(jié)構(gòu)比較[21]

4 展望

脲酶分解尿素機制涉及到脲酶活性的關(guān)鍵位點和氨基酸殘基，通過對關(guān)鍵位點結(jié)構(gòu)分析，人工合成具有特異性的抑制劑化合物。目前研究者通過分子對接和化學(xué)修飾的方法獲得大量具有脲酶抑制作用的化合物，但用于動物生產(chǎn)和人類醫(yī)藥的化合物相對稀少。天然植物源的提取物具有天然安全、無毒害的特點，開發(fā)天然植物提取物作為脲酶抑制劑將是一個新思路。