趙夢波，金素鈺，黃 林，鄭玉才

西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041

0 引言

牛乳蛋白主要包括酪蛋白（Casein，CN）和乳清蛋白兩大類，前者分為αs1-酪蛋白（αs1-CN）、αs2-酪蛋白（αs2-CN）、β-酪蛋白（β-CN）和κ-酪蛋白（κ-CN）四種類型。牛β-CN有209 個氨基酸，由位于6號染色體上的CSN2基因編碼，約占牛乳總酪蛋白的40%，有著重要的生理功能[1～3]。目前β-CN已鑒定出13 種遺傳變異體，包括A1、A2、A3、A4、B、C、D、E、F、H1、H2、I和G，最常見的是A1和A2[4]，很多研究也主要涉及這兩種類型。牛β-CN的A1遺傳變異體在消化過程中會產(chǎn)生β-酪啡肽-7（BCM-7），具有很強的阿片活性，被認為與胃腸道炎癥、糖尿病、自閉癥、精神分離癥等發(fā)生有關(guān)，而A2遺傳變異體則基本不會產(chǎn)生BCM-7[5～7]。還有研究表明，β-CN的遺傳變異體還可能會影響牛乳的凝固特性、酪蛋白膠束大小等[8，9]。

牛β-CN不同遺傳變異體的等位基因頻率與牛品種等有關(guān)。有研究顯示，意大利荷斯坦牛β-CN的A1等位基因頻率為0.371 0，低于A2等位基因頻率（0.546 0）；荷蘭荷斯坦牛A1和A2等位基因頻率分別為0.402 0和0.598 0，而美國荷斯坦牛的A1等位基因頻率高于A2[10]。德國的瑞士褐牛β-CN的A1、A2等位基因頻率分別為0.108 0和0.705 0，西門塔爾牛A1、A2等位基因頻率分別為0.343 0和0.566 0，娟珊牛A1、A2等位基因頻率分別為0.093 0和0.721 0[11]。中國荷斯坦牛A1、A2等位基因頻率分別為0.694 0和0.289 0，娟姍牛分別為0.325 0和0.421 0[12]。還有報道顯示，水牛乳β-CN可能只有A2遺傳變異體，A4型只在韓牛中檢測到[13，14]。由此可見，牛乳β-CN的遺傳變異體的頻率在品種間存在很大差異。

九龍藏黃牛和九龍牦牛生活在高寒、低氧的特殊環(huán)境中，有關(guān)其β-CN多態(tài)性研究不多。本試驗對生活于同一地區(qū)兩種牛的β-CN的遺傳多態(tài)性進行分析，以期為九龍藏黃牛和牦牛乳的比較生化研究、遺傳育種等提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

九龍藏黃牛乳樣（n=42）和九龍牦牛乳樣（n=17）均采自四川省九龍縣，所選試驗牛均為常年放牧，無補飼。清晨手工擠乳，每頭牛采集乳樣約50 mL，冰凍帶回實驗室。參照文獻方法[15]制備酪蛋白，凍干后于-80 ℃保存。

1.2 β-CN 多態(tài)性檢測

參考文獻方法[16]，取10 mg試驗牛酪蛋白凍干粉溶于1 mL 6.6 mol/L尿素溶液中。在電泳前45 min，將5 μL的β-巰基乙醇和少量的堿性品紅溶液和蔗糖加入到15 μL上述酪蛋白溶液中；取2 μL處理后的樣品用7.5 %酸性尿素PAGE分離，180 V電泳1 h，之后用考馬斯亮藍G-250染色。根據(jù)電泳圖參考相關(guān)文獻確定β-CN變異體類型[17，18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

參考文獻[19]計算試驗牛β-CN的等位基因頻率和基因型頻率。

2 結(jié)果

2.1 β-CN 基因型

酸性尿素PAGE電泳結(jié)果顯示，藏黃牛β-CN的基因型有7 種，包括A1A1、A1A2、A1B、A2B、BB、A1C、BC基因型（圖1A），九龍牦牛β-CN的基因型有2 種，包括A1A2、A2A2基因型（圖1B）。另在圖1B中發(fā)現(xiàn)，與九龍藏黃牛相比，九龍牦牛的電泳圖譜各條帶位置略微靠上，即相同遺傳變異體的遷移率小些（圖1B中6、7、8泳道）。

圖1 九龍藏黃牛（A）和九龍牦牛（B）β-CN 的電泳圖譜

2.2 基因型頻率和等位基因頻率

九龍藏黃牛β-CN的7 種基因型頻率見表1。有4 種基因型僅存在于1 個個體中，其中A1A1為優(yōu)勢基因型，50%以上的個體都是這種基因型；A1為優(yōu)勢等位基因，頻率高達0.702 0，而A2等位基因的頻率僅為0.023 8。九龍牦牛β-CN的2 種基因型頻率接近（表1），但A2等位基因頻率具有明顯優(yōu)勢，頻率高達0.765。

表1 九龍藏黃牛和九龍牦牛β-CN 基因型頻率和等位基因頻率

3 討論

本試驗對九龍藏黃牛和九龍牦牛β-CN基因型進行分析，發(fā)現(xiàn)在九龍藏黃牛中，A1等位基因占明顯優(yōu)勢。這是首次有關(guān)九龍藏黃牛β-CN A1、A2遺傳變異體的報道；在九龍牦牛中A2等位基因占明顯優(yōu)勢，這與已有報道中A2為優(yōu)勢等位基因的結(jié)果一致[20]。在毛永江等[21]研究中，認為九龍牦牛β-CN無遺傳變異體，可能與試驗檢測方法不同有關(guān)。九龍藏黃牛產(chǎn)奶量較低，國內(nèi)對其β-CN的遺傳變異體的報道很少。在青海地區(qū)黃牛乳蛋白多態(tài)性研究中，發(fā)現(xiàn)β-CN有A、B兩個等位基因，其中A占絕對優(yōu)勢[22]。李玉萍等[23]研究發(fā)現(xiàn)，九龍藏黃牛β-CN的A等位基因頻率為0.965 0，B等位基因頻率為0.069 8，其結(jié)果與青海本地黃牛相似。本試驗檢測到九龍藏黃牛A1、A2遺傳變異體，但A2變異體的等位基因頻率很低。由于A2遺傳變異體可能有益于人體健康[1，24]，因此，如果從乳的開發(fā)利用角度進行九龍藏黃牛的育種，應(yīng)充分考慮這一點。另外本試驗結(jié)果表明，九龍藏黃牛和九龍牦牛雖然生活在相似的生態(tài)環(huán)境中，但兩者β-CN的優(yōu)勢等位基因卻差別很大，提示二者相對獨立的進化特征，這對認識高原地區(qū)藏黃牛和牦牛的生物多樣性具有參考價值。

含有β-CN的A1和A2遺傳變異體的乳被分別稱為A1型乳和A2型乳，二者只在β-CN第67位存在一個氨基酸差異，A1型為組氨酸，A2型為賴氨酸[25]，但其對人體健康的潛在影響卻不相同。有研究發(fā)現(xiàn)，A1型乳的消化特性會引起健康問題[5]。人體飲用A1型乳會引起小腸炎癥，其機制可能是通過下調(diào)乳糖酶表達加劇乳糖不耐受的癥狀，而飲用A2型乳可以減輕胃腸道相關(guān)癥狀[26，27]。另有研究認為，A1型β-CN及其代謝產(chǎn)物BCM-7是導(dǎo)致1型糖尿病的重要原因[28]。本試驗結(jié)果從蛋白質(zhì)水平上證實，九龍牦牛乳中的β-CN可能更有益于人體健康。

本試驗中九龍藏黃牛酪蛋白的電泳條帶整體上要比九龍牦牛的遷移更快。將黃牛CSN2和牦牛CSN2的 CDS區(qū)（NCBI：NC_037333.1和GenBank：MH378280.1）進行比對發(fā)現(xiàn)，個別堿基發(fā)生變化，翻譯成蛋白質(zhì)序列后進行分析，發(fā)現(xiàn)黃牛和牦牛β-CN等電點分別為6.63和6.25，而本試驗的電極緩沖液pH值為3[16]，故九龍藏黃牛酪蛋白的遷移速率要比九龍牦牛大。

4 結(jié)論

本試驗表明九龍藏黃牛和九龍牦牛β-CN均存在多態(tài)性，共檢測到4 種等位基因：A1、A2、B、C，其中九龍藏黃牛表現(xiàn)出7 種基因型：A1A1、A1A2、A1B、A2B、BB、A1C、BC，優(yōu)勢等位基因為A1；九龍牦牛β-CN的基因型有2 種：A1A2、A2A2，優(yōu)勢等位基因為A2。這為九龍藏黃牛和九龍牦牛乳的比較生化研究及遺傳育種研究提供參考。