陸鐘巖，張雯萱，阿合拉·托留拜

1 南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院；農業(yè)農村部動物生理生化重點試驗室，江蘇南京 210095

2 南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇南京 210095

0 引言

反芻動物（如奶牛、綿羊和山羊等）是重要的農用動物，它們依靠瘤胃共生微生物分解植物蛋白和非蛋白氮源（尿素），并將分解產(chǎn)物合成反芻動物可以利用的微生物蛋白，為動物體提供營養(yǎng)。在目前的大規(guī)模集約化畜牧生產(chǎn)中，大多數(shù)養(yǎng)殖者通過飼喂高精料日糧來提高動物的肉、奶產(chǎn)量。豆粕是反芻動物飼養(yǎng)中常用和主要的蛋白來源，在第三世界國家中，大豆也是人類消費的重要糧食之一，同時養(yǎng)豬業(yè)和家禽養(yǎng)殖業(yè)也將大豆作為飼料的主要蛋白成分。加之新冠肺炎疫情的影響和過去幾年的中美貿易爭端，造成了主要農業(yè)國減產(chǎn)，國際市場的大豆價格可能會大幅提高。而我國作為主要的大豆進口國，進口的大豆主要制造動物飼料，大豆價格上漲無形中提高了動物飼養(yǎng)的成本。因此，研究在反芻動物養(yǎng)殖中的替代氮源，包括植物蛋白氮和非蛋白氮，將有助于降低飼養(yǎng)成本，減少對大豆進口的依賴。

尿素是一種參與反芻動物蛋白代謝的非蛋白氮源之一，氮含量高且價格低廉。反芻動物自身的尿素在肝臟中通過鳥氨酸-尿素循環(huán)產(chǎn)生，并通過肝靜脈進入血液。肝臟合成的尿素可以再循環(huán)回消化道或排泄到尿液中[1，2]。在反芻動物的消化道中，瘤胃是最大、最重要的營養(yǎng)物質消化吸收室。在瘤胃中，無論是日糧中或者是循環(huán)回消化道的尿素都會被微生物分解生成氨（NH3）[3]，并將其作為合成微生物蛋白的原料，從而促進微生物生長[4]。瘤胃微生物與消化液混合后流入小腸。在小腸中，微生物蛋白通過酶解釋放氨基酸和核酸[5]。通過這種方式，將反芻動物無法利用的日糧中的蛋白氮和尿氮分解成NH3-N，NH3-N通過微生物固氮轉化為宿主可用的微生物蛋白氮，為宿主提供營養(yǎng)?？茖W家長期以來一直在研究用尿素作為一種低成本氮源，以取代反芻動物日糧中的一部分植物蛋白成分[6]，但不能過度使用，在畜牧生產(chǎn)中，日糧中添加尿素能夠大幅提高反芻動物瘤胃中NH3的濃度，提高動物NH3中毒的風險。當尿素添加量達到25 g/kg干物質（DM）時，會降低動物的干物質攝入量和體重增加值[7]。

Abdoun等[8]報告，當瘤胃液的生理pH值低于6.5，瘤胃內的NH3主要以NH4+的形式被吸收。瘤胃上皮細胞對NH4+的吸收需要載體或通道的幫助，與NH3相比，其吸收速度較慢。理論上，瘤胃液體的低pH值可以降低NH3從瘤胃進入血流的吸收率，降低NH3中毒的風險。通過飼喂高精料日糧可升高瘤胃中短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acid，SCFA）的產(chǎn)生，降低瘤胃pH值[9]，從而降低因日糧中添加尿素產(chǎn)生NH3中毒的風險?；谝陨侠碚?，Xu等[10]將尿素與高精日糧（45%NFC）混合飼喂，證明了高精日糧飼喂條件下尿素可替代75%的日糧蛋白，而不對動物體造成危害。Lu等[11]研究了添加尿素后瘤胃微生物組及其鎳依賴性微生物群落的變化，并進一步分析了瘤胃環(huán)境因素（包括發(fā)酵變量和鎳濃度）在這些群落重建中的作用。但是目前缺少日糧添加尿素對瘤胃上皮細胞功能，特別是增殖、凋亡和吸收轉運功能影響的研究。由于中精日糧（30%NFC）可以顯著提高瘤胃上皮細胞的增殖、凋亡和吸收轉運功能，因此，在本研究中，采用尿素與中精日糧混合并取代日糧中部分豆粕的方案，在整體動物水平上與粗料飼喂條件下的瘤胃上皮細胞對比，研究日糧添加尿素對胃上皮細胞增殖、凋亡和上皮吸收轉運功能相關基因表達的影響；并在組織水平上研究尿素對瘤胃上皮細胞吸收轉運能力的調節(jié)。由于之前的研究表明，飼喂中精日糧可以顯著調節(jié)研究瘤胃發(fā)酵參數(shù)、加快瘤胃上皮細胞的增殖與凋亡和增強上皮吸收轉運功能。所以，進一步探討添加尿素取代日糧中的部分豆粕之后，尿素+中精日糧對瘤胃上皮功能的調節(jié)與中精日糧相比是否有改變。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與動物飼養(yǎng)

從溧水山羊養(yǎng)殖場（江蘇省南京市）購得18 只波雜山羊（4月齡，體重14～16 kg）。飼養(yǎng)地點為南京農業(yè)大學動物房，每只羊被飼養(yǎng)在單獨的欄舍里，可以自由飲水。在14 天適應期（只飼喂干草飼料）后，將山羊隨機分為3 組，分別接受含有無尿素+純粗料（LC組，n=6）、0%緩釋尿素+30%精料（MC組，有豆粕，n=6）以及1%DM緩釋尿素+30%精料（Urea組，部分豆粕被替代，n=6）的飼料。日糧符合《NY/T816—2004 產(chǎn)肉山羊飼養(yǎng)標準》的營養(yǎng)要求，日糧的成分和化學成分見表1。在試驗開始和結束時對飼料進行取樣分析，樣品的干物質、灰分、粗脂肪和粗蛋白含量按照AOAC程序進行分析。根據(jù)Van Soest等[12]的程序分析酸性洗滌劑纖維（ADF）和中性洗滌劑纖維（NDF）值。

表1 日糧營養(yǎng)和化學成分

在試驗期間，每天07：00和19：00時喂食混合日糧，每天測量每只山羊的采食量和剩余日糧量。連續(xù)飼喂28 天，在第29天，18 只山羊在早晨喂食后6h在當?shù)赝涝讏鐾涝?，并收集瘤胃內容物和上皮。瘤胃內容物通過4 層粗棉布過濾，四等分（50 mL）的瘤胃液體儲存在-20℃用于SCFA濃度、pH值和NH3-N濃度測定。自瘤胃腹側盲囊采集上皮并剪成1cm×1cm的小塊，沖洗，放置在RNALate溶液中過夜，然后在-80 ℃下儲存，用于mRNA提取和Real-Tme PCR，如下所述。在試驗的最后1 天，在早晨喂食前1 h，通過頸靜脈穿刺將血樣采集到5mL EDTA涂層真空采集器管中。立即將血樣置于冰上，4 ℃，1 500 r/min，離心15 min以獲得血清，然后在-20 ℃下儲存。

1.2 瘤胃NH3-N、SCFA 濃度以及pH 值的測定

按照Yang 等[13]的方法，使用氣相色譜儀（HP6890N，Agilent Technologies，Wilmington，DE）測定瘤胃SCFA濃度；采用NH3分析試劑盒（南京建成，中國南京）測定瘤胃NH3-N濃度。在雙尾T檢驗中，當P<0.05時，差異被認為是顯著的；使用pH計進行瘤胃pH值測定（Mettler Toledo Delta 320；Mettler-Toledo Group，Halstead，=UK）。

1.3 瘤胃上皮的形態(tài)學觀察

根據(jù)Malhi等[14]的描述，測量了瘤胃乳頭的密度、長度和寬度，即使用1 cm2福爾馬林固定的瘤胃上皮計算乳頭密度（乳頭個數(shù)/cm2）。使用滑動卡尺測量福爾馬林固定上皮樣本中的15 個乳頭的長度和寬度。

用Odongo等[16]的方法，將單個福爾馬林固定乳頭包埋在石蠟中，并以6 μm厚切片。每個切片用蘇木精和曙紅染色，然后安裝在載玻片上進行顯微鏡分析。瘤胃上皮每個樣品選四張切片，使用Image Pro Plus6.0軟件（Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA）觀察所有樣本中上皮細胞的形態(tài)，每個切片選取4 個區(qū)域，計算單位面積內顆粒層和棘突層細胞個數(shù)和單位長度上的基底層細胞個數(shù)。

用流式細胞儀檢測細胞周期。每個樣品計數(shù)10 000 個細胞，CELLQuest軟件收集細胞大小及細胞DNA含量等數(shù)據(jù)，ModFit LT for Macintosh軟件分析結果。

1.4 Real-Tme PCR

用Neasy微型試劑盒（Qiagen，Shanghai，China）從瘤胃上皮提取總RNA。使用隨機六聚體引物（Invitrogen，Shanghai，China）和M-MLV（莫羅尼鼠白血病病毒）逆轉錄酶（Fermentas，Burlington，ON，Canada）合成cDNA。使用StepOne Plus實時PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，Den Ijssel，Netherlands）和SYBR Green（Roche，Shanghai，China）進行定量PCR檢測。選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH）作為管家基因。根據(jù)NCBI中的可用序列設計靶基因的引物（表2）。引物的擴增效率通過一系列稀釋的上皮cDNA測定。所有樣品均一式三份，并根據(jù)2-ΔΔCT法[15]。利用擴增結束時進行的熔融曲線分析，檢查擴增產(chǎn)物的特性和純度。

表2 Real-time PCR 引物

1.5 Ussing Chamber 瘤胃上皮離體培養(yǎng)

利用Ussing Chamber上皮體外培養(yǎng)系統(tǒng)，通過測量尿素跨上皮轉運率，研究尿素特異性載體，尿素轉運蛋白-B（UT-B）的蛋白活性。按照Lu等[9]的方法配置標準緩沖液，配方見表3，并保持38 ℃，動物在屠宰后2～3min內從腹腔取出前胃。從腹側囊取出一塊約400 cm2的瘤胃壁，在38 ℃緩沖溶液中反復清洗，并從肌肉層剝離。隨后將組織浸泡在通有95%CO2和5%O2的緩沖溶液中運輸至實驗室。取瘤胃上皮（3 cm ×3 cm）安裝在Ussing Chamber培養(yǎng)小室的兩半之間，暴露面積為3.14 cm2。系統(tǒng)兩側注入16 mL培養(yǎng)液，配方見表3，對安裝好的組織進行浸泡，并在38 ℃下用O2/CO2（5:95）的混合氣體進行充氣，模擬瘤胃和血液環(huán)境，并設定瘤胃上皮乳頭一側為瘤胃側，對側為血液側。根據(jù)Lu等[9]的方法進行電生理參數(shù)監(jiān)控，上皮的瘤胃側培養(yǎng)pH值保持在6.4，血液側pH保持在7.4，向血液側加入C14標記的尿素。培養(yǎng)一段時間后從瘤胃側采集培養(yǎng)液，并與閃爍液混合（Rotiszint，Roth–Karlsruhe，Germany），通過使用β計數(shù)器（LKB Wallace Perkin Elmer；überlingen，Germany）。測定培養(yǎng)液中出現(xiàn)的放射性進而來計算尿素在瘤胃上皮的轉運率。

表3 Ussing chamber 培養(yǎng)液配方

2 結果

2.1 各組瘤胃發(fā)酵參數(shù)、血漿尿素氮（BUN）濃度比較

如表4結果所示，與LC組相比，Urea組的乙酸、丙酸、丁酸和總SCFA濃度均顯著增加，分別增加約30%、50%、35%和35%（P<0.05）。同時，丙酸、丁酸和總SCFA的濃度在Urea組和MC組之間并未顯示出顯著變化（P>0.05）。Urea組的瘤胃pH值與LC組相比顯著降低（P<0.05），與MC組相比則無出顯著差異（P>0.05）。隨著日糧精料的增加，瘤胃NH3-N和BUN濃度顯著升高（P<0.05）。而Urea組的瘤胃NH3-N和BUN濃度顯著高于MC組（P<0.05）。

將職務犯罪調查中的技術運用劃分為兩條涇渭分明的路線，并非是將這樣的路線之爭實質化，而是將其中的技術原理予以提煉后，分析國家對職務犯罪調查技術運用的制度安排。從目前來看，國家對于職務犯罪調查的技術安排體現(xiàn)為發(fā)展與制約并重。一方面，在技術運用較為薄弱的科學技術方面強化投入與產(chǎn)出，在最短的時間內提升戰(zhàn)斗力。另一方面，通過制度設計制約人文技術，使其始終保持在穩(wěn)定可控的范圍內。這樣揚長避短的制度思路或許還將長期存在于職務犯罪調查的技術安排之中。

表4 對比各組瘤胃發(fā)酵參數(shù)和血漿Urea-N 濃度（n=6）

2.2 瘤胃上皮的形態(tài)學分析

如表5結果所示，由于日糧精料水平的增加，MC組與LC組相比，瘤胃乳頭的長度、寬度和密度均顯著增加（P<0.05）。Urea組與LC組相比，這些參數(shù)同樣顯著增加（P<0.05）。而Urea組和MC組相比，瘤胃乳頭的以上參數(shù)差異均不顯著（P<0.05）。通過計算Urea組單位面積瘤胃上皮內乳頭吸收面積顯著高于LC組，同時低于MC組，但是降低趨勢并不明顯（P>0.05）。

表5 對比各組瘤胃上皮乳頭參數(shù)（n=6）

如表6結果所示，與LC組相比，Urea組和MC組瘤胃上皮棘突層和顆粒層細胞密度以及層數(shù)顯著升高（P<0.05），Urea組與MC相比較則不顯著；而3組之間基底層細胞層數(shù)和細胞數(shù)量無差異顯著。

表6 對比各組瘤胃上皮形態(tài)學變化

2.3 各組瘤胃上皮細胞周期的比較

如表7所示，與LC組相比，Urea組山羊瘤胃上皮細胞S期和G2/M期細胞百分率均顯著升高（P<0.05），Urea組與MC相比較則不顯著；Urea 組的G0/G1 期細胞百分率顯著低于LC 組（P<0.05），但與MC組之間差異不顯著。

表7 對比各組瘤胃上皮細胞周期的變化1

2.4日糧添加尿素對山羊瘤胃上皮細胞增殖凋亡相關基因mRNA 表達的影響

如圖1結果所示，Urea組山羊瘤胃上皮細胞增殖相關基因cyclin A、cyclin B1、cyclin D1、cyclin E1、CDK1、CDK2、CDK4、和CDK6mRNA表達均顯著高于LC組（P<0.05），同時這些基因的表達量與MC組無顯著差異。

圖1 瘤胃上皮細胞增殖相關基因mRNA 表達

如圖2結果所示，Urea組山羊瘤胃上皮細胞凋亡相關基因Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、p53、Bcl 2與Bax的mRNA表達都顯著高于LC組（P<0.05），與MC組相比Caspase 9、Bax的表達量顯著降低（P<0.05），Bax則顯著升高（P<0.05），其余基因無顯著差異。

圖2 瘤胃上皮細胞凋亡相關基因mRNA 表達

2.5日糧添加尿素對山羊瘤胃上皮SCFA 轉運載體mRNA 表達的影響

如圖3 所示，Urea 組山羊瘤胃上皮三種SCFA–/HCO3

圖3 瘤胃上皮SCFA 轉運載體mRNA 表達

–交換載體DRA、PAT1和AE2的m RNA 的表達顯著高于LC 組（P<0.05），兩 種SCFA–與H+的共轉運載體MCT1和MCT 4 的m RNA 表達也顯著高于LC 組（P<0.05）。但與MC組相比這些基因的表達量差異不顯著。

2.6日糧添加尿素對山羊瘤胃上皮pHi 調節(jié)相關蛋白和UT-B mRNA 表達的影響

圖4 瘤胃上皮pHi 調節(jié)相關蛋白和UT-B mRNA 表達

2.7日糧添加尿素對山羊瘤胃上皮UT-B 蛋白活性的影響

如表8 所示，尿素在瘤胃上皮中的轉運受瘤胃p H 值、SCFA 濃度和N H3濃度的調節(jié)。Ussingchamber 數(shù)據(jù)顯示，與LC 組相比，Urea 組（P<0.0 5）和MC 組（P<0.05）瘤胃上皮將尿素從血液轉運到瘤胃能力隨著日糧精料水平提高而顯著增加。而這兩組數(shù)據(jù)之間對比，MC 組上皮的尿素轉運能力則要顯著高于Urea 組（P<0.0 5）。結果表明U T-B 蛋白活性由高到低分別為：MC 組、Urea 組以及LC 組。

表8 對比各組血漿尿素跨上皮轉運率（n=6）

3 討論

3.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

在所研究的發(fā)酵變量中，精料+尿素的混合日糧顯著升高了瘤胃乙酸、丙酸和丁酸濃度，瘤胃pH值顯著降低，但是與飼喂中精日糧的MC組相比，以上參數(shù)沒有因為日糧中添加尿素而改變。瘤胃SCFA和H+主要來源于日糧中碳水化合物的微生物發(fā)酵水解，這表明Urea組與MC組相比，瘤胃微生物發(fā)酵的功能并未改變，這與Currier等[16]的研究一致。因此，日糧中碳水化合物的比例相似會導致所有組中乙酸、丙酸、丁酸以及總SCFA的濃度相近。

N H3是瘤胃中微生物蛋白合成和生長的重要氮源[8]。瘤胃NH3的最適宜濃度約為8.8 mg/dL[17]。然而，當瘤胃NH3濃度超過140 mg/dL時，反芻動物可能遭受NH3中毒[18]。瘤胃NH3的濃度由日糧中氮的水平和通過尿素循環(huán)進入瘤胃的尿素決定。尿素可被瘤胃解脲微生物（主要是細菌）迅速水解為NH3，100%可在瘤胃內降解[19]。前人的大量研究結果顯示日糧中添加尿素能夠大幅提高反芻動物瘤胃中NH3的濃度[20～22]，Patra等[23]的研究報道，瘤胃NH3濃度是尿素循環(huán)的主要抑制因素。因此Urea組中較高的瘤胃NH3濃度抑制了血液中的尿素通過尿素循環(huán)跨過瘤胃上皮進入瘤胃，導致了Urea組BUN濃度顯著高于MC組。

3.2 瘤胃上皮形態(tài)學和細胞周期

瘤胃上皮對發(fā)酵終產(chǎn)物的吸收至關重要，例如50%～85%的SCFA直接通過瘤胃上皮吸收，SCFA的吸收途徑主要包括被動擴散和通過載體介導的轉運蛋白[24～26]，瘤胃上皮乳頭表面積決定了上皮的吸收轉運能力[13，27，28]。針對山羊和綿羊的研究表明，提高日糧精料水平可以提高瘤胃SCFA濃度，進而增加瘤胃乳頭的大小和表面積[29，30]。在本研究中，Urea組的瘤胃乳頭長寬、密度和表面積均顯著大于LC組，這與Urea組攝入更多的能量和氮源一致，此外，也與Urea組的發(fā)酵終產(chǎn)物SCFA濃度更高相一致。因此，Urea組的瘤胃乳頭表面積更大，增加了吸收能力。與MC組相比，攝入的能量和氮源幾乎相同，導致瘤胃SCFA濃度無顯著差異，所以兩組的瘤胃乳頭長寬、密度和表面積也無顯著差別。

本文的研究表明，相比LC組，Urea組中瘤胃上皮中角質層以及棘突層和顆粒層細胞層數(shù)增加。這是由于Urea組提高日糧精料水平增加了瘤胃SCFA濃度，進而上調了上皮細胞增殖相關基因表達引起的（圖3）。但是表4的數(shù)據(jù)又顯示，瘤胃上皮的棘突層和顆粒層以及基底層細胞數(shù)量沒有顯著的變化，推測這是因為提高日糧精料水平不僅促進了瘤胃上皮的細胞增殖，而且加快了瘤胃上皮細胞的死亡，比如加快瘤胃上皮細胞凋亡水平。同時，瘤胃上皮細胞周期的變化顯示，Urea組的G0/G1期細胞所占百分比顯著下降，而G2/M期細胞所占百分比顯著升高。這個結果表明，Urea組由于調高了日糧精料水平，瘤胃上皮細胞周期進程加快。由于Urea組和MC組的瘤胃SCFA濃度幾乎相同，所以它們的瘤胃上皮細胞增殖生長和細胞周期的數(shù)據(jù)無顯著差異。

3.3 瘤胃上皮細胞增殖凋亡相關基因mRNA表達

細胞周期控制系統(tǒng)基于兩個蛋白家族：細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（CDK）和細胞周期蛋白（cyclins）[31]。在本試驗中，與LC組相比，Urea組和MC組山羊瘤胃上皮的細胞周期調節(jié)因子（cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE1、CDK1、CDK2、CDK4和CDK6）的基因表達均顯著增強，表明這些細胞周期調節(jié)因子促進了這兩組的細胞周期進程。本研究中，通過將提高日糧精料水平，增加瘤胃SCFA濃度，降低瘤胃pH值。這與之前的報告一致[13，32]。研究結果表明，提高日糧精料水平使瘤胃乳頭密度增加，乳頭大小增大。這與加速上皮細胞增殖有關[30，33]。瘤胃乳頭生長主要受瘤胃SCFA（主要是丁酸）濃度和pH值的調節(jié)[34，35]。提高日糧精料水平會升高SCFA的濃度，SCFA被認為是上調瘤胃上皮細胞增殖的因素[36]。McLeod等[37]進一步報道，消化道SCFA是促進消化道上皮增殖的主要因素。

細胞凋亡對細胞數(shù)量的穩(wěn)態(tài)起著中重要的作用。在通過細胞有絲分裂促進細胞數(shù)量的增加和通過細胞凋亡減少細胞數(shù)量，這兩者的動態(tài)平衡對于維持組織細胞的穩(wěn)態(tài)都起著至關重要的作用，SCFA能促進細胞凋亡，尤其是丁酸的作用更加明顯。在本研究中，與LC組相比，Urea組和MC組山羊瘤胃上皮的細胞凋亡調節(jié)因子（caspase 3、caspase 8、caspase 9、p53、Bcl-2和Bax）的基因表達均增強。這與Urea組和MC組瘤胃SCFA特別是丁酸濃度顯著升高相一致。簡言之，提高日糧精料水平可加速瘤胃細胞周期并促進瘤胃細胞凋亡。在此水平上，凋亡細胞產(chǎn)生的營養(yǎng)物質可用于細胞增殖，這可能有助于維持上皮內穩(wěn)態(tài)。

由于作為主要調節(jié)因素的瘤胃SCFA濃度在Urea組和MC組間無顯著差異，所以兩組的上皮細胞增殖相關基因mRNA表達同樣無顯著差異。

3.4 瘤胃上皮SCFA 轉運載體和pHi 調節(jié)相關蛋白mRNA 表達

提高日糧精料水平不僅會使瘤胃內的發(fā)酵增加，還導致瘤胃對SCFA的吸收增加[38～40]。Sehested等[40]在2000年報道，增加日糧的精料水平，可以在不改變吸收表面積的情況下，增加瘤胃上皮對丁酸的吸收能力。隨后Kuzinski[41]與Connor[42]等分別發(fā)現(xiàn)，提高日糧中的精料比例，會引起瘤胃上皮中SCFA轉運載體MCT1與DRA的mRNA表達增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，瘤胃上皮吸收功能的變化源自瘤胃上皮細胞內SCFA轉運系統(tǒng)的改變。提高日糧中的精料水平可增加瘤胃上皮內SCFA轉運載體的基因表達，從而增加瘤胃上皮對SCFA的吸收能力。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，同LC組相比，Urea組和MC組瘤胃上皮中SCFA轉運載體（MCT1、MCT4、DRA、PAT1和AE2）的表達都顯著升高。這些結果與[43]的發(fā)現(xiàn)一致，由于SCFA轉運載體的mRNA表達增加，這兩的組瘤胃上皮對SCFA的吸收能力也可能會相應的升高。由于Urea組和MC組間SCFA濃度相似，所以兩組的SCFA轉運載體mRNA表達無顯著差異。

之前的發(fā)現(xiàn)提高日糧精料水平不僅會引起SCFA轉運載體的表達升高，還能引起細胞內pHi調節(jié)蛋白（NHE1、NHE2、NHE3、vH+ATPase與Na+/K+ATPase）的mRNA表達升高[43]。SCFA轉運載體與細胞內pH調節(jié)蛋白的表達同時升高，對瘤胃上皮有著重要的生理意義。目前已經(jīng)證實，SCFA的吸收會導致瘤胃上皮細胞內的H+濃度升高，細胞內的pH值下降，這就需要pH調節(jié)蛋白來幫助排出胞內的H+，以維持內環(huán)境的穩(wěn)定，保證細胞的正常生理活動[24]。本研究發(fā)現(xiàn)Urea組和MC組瘤胃上皮中SCFA濃度顯著高于同LC組，因此這兩組中的細胞內pHi調節(jié)蛋白（NHE1、NHE2、NHE3、vH+ATPase與Na+/K+ATPase）的mRNA表達均顯著升高。由于Urea組中添加尿素替代部分豆粕，造成瘤胃NH3濃度顯著高于MC組。先前的研究發(fā)現(xiàn)NH3對NHE1、NHE2和NHE3的mRNA表達有抑制作用[44]。因此，以上5種細胞內pHi調節(jié)蛋白在Urea組中的mRNA表達顯著低于MC組。

3.5 瘤胃上皮尿素轉運能力

反芻動物具有特殊的氮節(jié)約機制，可以通過尿素循環(huán)，將2/3的需將尿素運回瘤胃[1，2，45]。尿素進入瘤胃后被微生物分泌的脲酶分解，產(chǎn)生的NH3被微生物作為原料合成微生物蛋白，為宿主提供營養(yǎng)。尿素跨瘤胃上皮轉運是尿素循環(huán)中最關鍵的一步，尿素通過特異性載體UT-B實現(xiàn)跨上皮轉運。瘤胃上皮對尿素的轉運能力包括UT-B的蛋白活性和mRNA表達量。之前的研究顯示，瘤胃SCFA和低pH值對瘤胃上皮UT-B的蛋白活性和mRNA表達量均有顯著的上調作用，而瘤胃NH3則起抑制作用[9，46]。Urea組與LC組相比，由于瘤胃SCFA濃度顯著增加，pH值顯著降低，因此UT-B的蛋白活性和mRNA表達量均顯著升高。Urea組中添加尿素替代部分豆粕，造成瘤胃NH3濃度顯著高于MC組，同時瘤胃SCFA濃度和pH值相似，所以UT-B的蛋白活性和mRNA表達量受到抑制顯著低于MC組。

4 結論

本研究通過在3 0%精料的日糧中添加尿素（1%DM）替代部分豆粕作為非蛋白類氮源。添加尿素對于日糧精料水平提高而發(fā)生的瘤胃SCFA濃度升高、pH值降低趨勢沒有顯著改變，但在精料日糧的基礎上進一步顯著提高瘤胃NH3和BUN濃度。因此添加尿素對于以瘤胃SCFA為主要調節(jié)因子的瘤胃上皮生理活動（上皮生長、細胞周期、增殖凋亡相關基因mRNA表達和SCFA轉運載體mRNA表達）均無顯著影響。但是對于受瘤胃NH3調節(jié)的尿素轉運、pHi調節(jié)相關蛋白mRNA表達則有顯著的負調節(jié)。我們的研究結果表明，添加尿素對于提高日糧精料水平而發(fā)生的瘤胃和瘤胃上皮的一系列技能變化有部分調節(jié)作用，為進一步研究尿素作為替代豆粕的非蛋白類氮源對反芻動物生理機能的影響提供了數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。