王 新，張居典，邵景海，秦 平

北大荒完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150090

0 引言

乳酸菌胞外多糖是由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的，分泌于細(xì)胞外，常滲入培養(yǎng)基中的一種糖類(lèi)化合物[1]。一般為黏液或莢膜多糖等水溶性多糖，是一種天然高分子聚合物[2]。作為一種新型的天然食品添加劑，乳酸菌胞外多糖因獨(dú)特的生理功能和產(chǎn)業(yè)潛力而備受研究者青睞。在生理功能上，胞外多糖具有良好的抗腫瘤、保護(hù)機(jī)體組織細(xì)胞、增強(qiáng)抵抗力和降低膽固醇等活性[3]。在物化特性上，研究表明，乳酸菌胞外多糖不僅能增加發(fā)酵乳的黏度，減少乳清析出，提高發(fā)酵乳的回復(fù)性和抗剪切力，還能顯著提高發(fā)酵乳的持水力[4]，提供蛋白的穩(wěn)定性，是一種天然的增稠劑及穩(wěn)定劑。胞外多糖在酸奶中的含量一般為50.0～2 700.0 mg/L，對(duì)酸奶質(zhì)構(gòu)的影響主要是胞外多糖的結(jié)構(gòu)和含量與乳蛋白發(fā)生相互作用所致。本研究對(duì)不同菌種發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的胞外多糖含量及其對(duì)產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性等方面的影響進(jìn)行分析研究，為以后胞外多糖含量在酸奶中的研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

全脂生牛乳，脫脂牛奶，白砂糖，試驗(yàn)用發(fā)酵劑1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)為不同型號(hào)發(fā)酵劑（成分均為保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌），乳酸菌培養(yǎng)基（MRS）等。

1.2 試驗(yàn)器材

天平、攪拌槳、均質(zhì)機(jī)、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、黏度計(jì)、離心機(jī)、pH計(jì)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、離心機(jī)、燒杯、稱(chēng)量勺、溫度計(jì)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種胞外多糖產(chǎn)量的測(cè)定

（1）胞外多糖的分離

發(fā)酵劑1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)，接種到經(jīng)滅菌12%脫脂乳培養(yǎng)基中，在最適溫度37 ℃下培養(yǎng)24.0 h。接種2%的發(fā)酵液于MRS培養(yǎng)基中，在42 ℃下培養(yǎng)15.0 h。冷藏過(guò)夜。

取10 mL乳酸菌發(fā)酵液，4 000 r/min離心15 min，取上清液，用濃度為1 mol/L的NaOH將上清液pH值調(diào)至7.5，加入1/10體積的胰蛋白酶液（質(zhì)量濃度為3 g/L，現(xiàn)配現(xiàn)用），40 ℃水浴酶解2.5 h。加入1/3體積Sevag液（氯仿∶正丁醇=3∶1，體積比），振搖30 min后，4 000 r/min 離心15 min，去除沉淀，重復(fù)1 次。加入3～5 倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，充分振蕩（多糖呈絮狀沉淀析出），轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心15 min，得沉淀。將沉淀用丙酮洗滌脫水2 次，干燥得白色粉末即為多糖[5]。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將50 mg標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖定容于500 mL容量瓶中。各種試劑按照表1所示順序加入后混勻，室溫放置顯色20 min后于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以2.0 mL水按照同樣的顯色操作作為空白進(jìn)行調(diào)零，橫坐標(biāo)為多糖含量，單位為μg，縱坐標(biāo)為光密度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度 單位：mL

（3）胞外多糖質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖質(zhì)量濃度，用葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。胞外多糖含量的測(cè)定：準(zhǔn)確吸取10 mL蒸餾水溶解胞外多糖樣品，吸取樣品溶液0.2 mL于試管中，然后按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備步驟操作，測(cè)定樣品的吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸直線方程求出對(duì)應(yīng)的糖質(zhì)量濃度，再乘以樣品稀釋度即得各菌株的胞外多糖質(zhì)量濃度。

1.3.2 酸奶樣品制作

使用標(biāo)準(zhǔn)化處理過(guò)的生牛乳，經(jīng)6 5 ℃，180～200 bar均質(zhì)處理、95 ℃，300 S殺菌、降溫至42 ℃，分別添加發(fā)酵菌種1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)，發(fā)酵后測(cè)定試驗(yàn)樣品狀態(tài)口感、黏度、持水性、耐熱性。

（1）產(chǎn)品狀態(tài)口感測(cè)定

樣品發(fā)酵后至pH值4.4，破乳降溫儲(chǔ)存，后熟12.0 h，由15 人組成品評(píng)小組，對(duì)產(chǎn)品的外觀狀態(tài)、口感進(jìn)行評(píng)價(jià)計(jì)分（表2）。

表2 狀態(tài)口感評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

（2）產(chǎn)品黏度測(cè)定

產(chǎn)品發(fā)酵至pH值4.4，破乳降溫至25 ℃，BROOKFIELD DV3T 黏度計(jì) S63 號(hào)轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速20 r/s，測(cè)定30 s時(shí)樣品的黏度。每個(gè)樣品做平行試驗(yàn)3 次，取平均值。

（3）產(chǎn)品持水性測(cè)定

產(chǎn)品發(fā)酵至pH值4.4，破乳降溫至25 ℃，用離心管取樣品5.0 mL，并測(cè)定樣質(zhì)量W1后，放入離心機(jī)以3 000 r/min離心20 min后，取出離心管靜置10min，除去上清液，測(cè)殘余物的質(zhì)量W。酸奶持水力為：持水力（%）=（W/W1）×100%[7]。

（4）產(chǎn)品耐熱性比較

為驗(yàn)證比較菌種產(chǎn)生胞外多糖對(duì)酸奶受熱保護(hù)性狀，在大量的前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用生牛乳添加菌種進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵至pH值至4.4進(jìn)行破乳降溫，降至25 ℃，采用75 ℃水浴對(duì)酸奶進(jìn)行升溫殺菌，記錄酸奶升溫過(guò)程中的變化，比較酸奶殺菌過(guò)程中蛋白變性情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外多糖產(chǎn)量的測(cè)定

2.1.1 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖的含量作為橫坐標(biāo)，490 nm下吸光值為坐標(biāo)做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），該曲線與線型方程y=0.0086x-0.0031擬合良好，R2=0.9994，葡萄糖的含量為10～100 μg/mL。

圖1 葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 胞外多糖產(chǎn)量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)定5 種發(fā)酵菌種胞外多糖產(chǎn)量，如圖2所示。菌種4號(hào)胞外多糖產(chǎn)量最高，其胞外多糖產(chǎn)量為568.5 mg/L，其后依次為2號(hào)413.5 mg/L，1號(hào)352.3 mg/L，菌種3號(hào)284.3 mg/L，菌種5號(hào)174.8 mg/L。

圖2 不同菌種胞外多糖的產(chǎn)量

2.2 產(chǎn)品狀態(tài)口感測(cè)定

分析不同發(fā)酵菌種1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)制得產(chǎn)品，對(duì)其乳感官狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)。品評(píng)小組從外觀狀態(tài)、口感、光滑度幾個(gè)方面對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)品進(jìn)行品評(píng)，見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，4號(hào)菌種發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)狀態(tài)評(píng)分最佳。結(jié)合上述，胞外多糖產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果，說(shuō)明胞外多糖能賦予產(chǎn)品更好的口感和狀態(tài)。

表3 狀態(tài)口感評(píng)定結(jié)果

2.3 產(chǎn)品產(chǎn)黏測(cè)定

分析不同發(fā)酵菌種1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)對(duì)產(chǎn)品黏度的影響，從圖3可以看出，發(fā)酵菌種4號(hào)所制得酸奶黏度最高，為2 200 cp；其后依次為2號(hào)菌種1 900 cp、1號(hào)菌種1 600 cp、3號(hào)菌種1 400 cp、5號(hào)菌種1 000 cp。可以看出產(chǎn)品黏度與菌種胞外多糖產(chǎn)品正相關(guān)。胞外多糖可提高酸奶產(chǎn)品黏度，改善質(zhì)地，是一種很好的天然生物增稠劑[8]。乳酸菌胞外多糖的種類(lèi)非常多，結(jié)構(gòu)也多變。其產(chǎn)品黏度的貢獻(xiàn)取決于產(chǎn)生胞外多糖的數(shù)量與胞外多糖的結(jié)構(gòu)[9]。

圖3 不同菌種對(duì)應(yīng)產(chǎn)品黏度的測(cè)定

2.4 產(chǎn)品持水性測(cè)定

分析不同菌種發(fā)酵產(chǎn)品持水性的比較。通過(guò)圖4可以看出，發(fā)酵菌種4號(hào)所制得酸奶持水能力最高，隨菌種產(chǎn)生胞外多糖能力的增加，產(chǎn)品持水性成增長(zhǎng)趨勢(shì)。這可能是乳酸菌產(chǎn)生的EPS增加了發(fā)酵乳的持水性，減少了乳清析出。產(chǎn)EPS的發(fā)酵乳含有相對(duì)大的孔，EPS在這些微孔里使蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)形成更厚、更濃密的蛋白質(zhì)凝膠通道，這種結(jié)構(gòu)更有利于防止發(fā)酵乳脫水析出[10]。

圖4 不同菌種對(duì)應(yīng)產(chǎn)品持水性的測(cè)定

2.5 產(chǎn)品耐熱性比較

分析不同菌種發(fā)酵產(chǎn)品耐熱性的比較。通過(guò)圖5可以看出，發(fā)酵菌種4號(hào)所制得酸奶耐熱到75 ℃才開(kāi)始有蛋白變性，隨菌種產(chǎn)生胞外多糖能力的增加，產(chǎn)品蛋白耐熱穩(wěn)定性成增長(zhǎng)趨勢(shì)。多糖和蛋白之間發(fā)生的相互作用主要有非共價(jià)作用和共價(jià)作用兩種[11]。非共價(jià)作用主要有強(qiáng)的靜電作用和弱的相互作用（氫鍵、范德華力、疏水相互作用等）。共價(jià)作用主要通過(guò)Maillard反應(yīng)產(chǎn)生[12]。兩者的相互作用會(huì)改善蛋白質(zhì)的溶解性、熱穩(wěn)定性等[13]。

圖5 不同菌種對(duì)應(yīng)產(chǎn)品耐熱性的測(cè)定

3 結(jié)論

乳酸菌胞外多糖可賦予發(fā)酵乳制品特殊物化特性，可改善酸奶的質(zhì)地口感，增加酸奶的黏性、流變性，提高酸奶的持水性，防止乳清析出，增強(qiáng)酸奶的耐熱強(qiáng)度等。此外，胞外多糖還具有生物活性，如免疫活性、抗腫瘤等。在酸奶生產(chǎn)過(guò)程中，常出現(xiàn)黏度低、凝塊破碎和大量乳清析出等問(wèn)題，這些問(wèn)題可以通過(guò)使用高產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵菌種解決。使用高產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵劑生產(chǎn)出來(lái)的酸奶與低產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵劑相比，具有口感狀態(tài)好、黏度高、持水性好的優(yōu)勢(shì)，在常溫酸奶的使用中，高產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵劑生產(chǎn)的酸奶具有耐熱性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。