黃姍 宋章永

摘要 本研究采用形態(tài)學鑒定、單基因、多基因序列系統(tǒng)發(fā)育進化分析等方法對引起山東臨沂地區(qū)的白菜地夜蛾科昆蟲流行病的病原真菌進行鑒定，明確了此病原真菌的系統(tǒng)分類地位。通過菌株的菌落特征、培養(yǎng)特征和產(chǎn)孢特性初步確定引起山東臨沂地區(qū)夜蛾科昆蟲流行病的病原菌系綠僵菌屬Metarhizium spp.，通過多基因序列測定、系統(tǒng)發(fā)育進化分析，進一步確定引起流行病的菌株為萊氏綠僵菌Metarhizium rileyi，菌株命名為SDMr01。用濃度為1.0×108個/mL的SDMr01孢子懸浮液分別浸泡小菜蛾P(guān)lutella xylostella及斜紋夜蛾Spodoptera litura 2齡幼蟲進行致病性測定，14 d后累計校正死亡率分別為77.1%、80.5%。結(jié)果表明，萊氏綠僵菌SDMr01對部分夜蛾科害蟲具有良好的生防潛力及開發(fā)應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 萊氏綠僵菌; 多基因序列分析; 分離鑒定; 致病力

中圖分類號： S 476.12

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020539

Identification of pathogenic fungus causing field pests epidemics based on multiple-gene sequence analysis

HUANG Shan1*， SONG Zhangyong2

（1. Weifang Nursing Vocational College， Weifang 262500， China;

2. Southwest Medical University， Luzhou 646000， China）

Abstract

Morphological identification， singular gene and multigene phylogenetics methods were used to identify entomogenous fungi which lead to Noctuidae epidemics in China cabbage field in Linyi， Shandong province. Morphological observation indicated that the entomogenous fungus was Metarhizium. Molecular phylogenetic analysis confirmed that the entomogenous fungus was Metarhizium rileyi， named as SDMr01. The mortalities of 2nd instar larvae of Plutella xylostella and Spodoptera litura infected by 1.0×108 spore/mL SDMr01 suspension were respectively measured by immersion method. The corrected accumulative mortalities rate reached 77.1% and 80.5% 14 days after treatment， respectively. The results demonstrated SDMr01 had good biocontrol potential and application prospects against some Noctuid insects.

Key words

Metarhizium rileyi; multiple gene sequence analysis; isolation and identification; pathogenicity

昆蟲病原真菌是寄生于昆蟲并引起昆蟲死亡的一類真菌，多數(shù)寄主范圍廣，可感染多種昆蟲。目前研究較多的有球孢白僵菌Beauveria bassiana、綠僵菌Metarhizium spp.、玫煙色棒束孢Isaria fumosorosea、青霉Penicillium、擬青霉Paecilomyces等[1-4]。近年來，國內(nèi)外一些研究表明，球孢白僵菌，布氏白僵菌Beauveria brongniartii，金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae，萊氏綠僵菌Metarhizium rileyi等對草地貪夜蛾具有良好的生防潛能[5]。

萊氏綠僵菌，舊稱萊氏蛾霉，可侵染多種鱗翅目害蟲的幼蟲，田間經(jīng)常能觀察到萊氏綠僵菌引起害蟲種群的自然流行疾病。早在1974年，Kish等首次模擬出了萊氏綠僵菌的流行病學模型，利用此模型較為準確的預(yù)測出了田間害蟲死亡率，為萊氏綠僵菌的開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[6]。大量的研究表明，萊氏綠僵菌引起昆蟲流行病的暴發(fā)受多種因素的影響，包括生物因素和非生物因素，其中非生物因素中較為重要的是環(huán)境溫度、濕度及風力。適于害蟲流行病暴發(fā)的環(huán)境溫度是25℃左右，濕度在70%～75%。因此，在全年溫度較高，降水量較大的熱帶地區(qū)容易暴發(fā)害蟲流行病[7-8]。

本課題組在山東臨沂地區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，每年的5月-10月間時常發(fā)生農(nóng)作物害蟲流行病，為明確引起2018年昆蟲流行病的病原真菌種類，課題組于2018年9月在臨沂地區(qū)田間白菜地采集了大量病蟲尸體，分離到一株優(yōu)勢菌株，經(jīng)形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定，明確引起該地昆蟲流行病的病原菌為綠僵菌屬的萊氏綠僵菌。并測定了分離菌株對2種夜蛾科昆蟲幼蟲的毒力，旨在為該病原真菌在害蟲生物防治中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與菌種采集

供試菌株：將自山東臨沂地區(qū)白菜地采集大量死亡的僵蟲尸體，初步鑒定僵蟲有斜紋夜蛾Spodoptera litura、粉紋夜蛾Trichoplusia ni、小菜蛾P(guān)lutella xylostella、菜青蟲 Pieris rapae 等，經(jīng)分離純化獲得菌株。

供試昆蟲：小菜蛾、斜紋夜蛾第1代蟲卵采自農(nóng)田蔬菜地，將蟲卵在（24±1）℃、RH 60%～90%、L∥D=12 h∥12 h的人工氣候培養(yǎng)箱中孵化，孵化的幼蟲在相同條件下用人工飼料飼養(yǎng)[9]。挑選第2代大小一致的2齡幼蟲作為供試蟲源。

SMAY（薩氏麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基）：蛋白胨2.5 g，酵母提取物5.0 g，瓊脂粉18 g，麥芽糖40 g，加蒸餾水至終體積1 000 mL。1/4 SDAY（1/4薩氏葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基）：蛋白胨2.5 g，酵母提取物5.0 g，瓊脂粉18 g，葡萄糖10 g，加蒸餾水至終體積1 000 mL。PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，馬鈴薯小塊200.0 g，添加蒸餾水至終體積1 000 mL。

試劑：PCR擴增試劑（10×Buffer、10 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgCl2、5 U/μL rTaq酶）購自TaKaRa公司;DNA小量提取試劑盒購自加拿大MBI Fermentas公司;DNA純化試劑盒購自Axygen公司;葡萄糖，麥芽糖，酵母提取物，蛋白胨，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 菌株的分離純化

用無菌接種環(huán)輕輕蘸取僵蟲表面的綠色分生孢子粉，用劃線法分別接種于PDA、SMAY、1/4SDAY平板上，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察菌落的生長狀況，用尖頭鑷子夾取優(yōu)勢菌的菌絲體進行再次接種，讓其繼續(xù)生長，并觀察生長情況，經(jīng)過幾次轉(zhuǎn)接即可獲得純培養(yǎng)物。將菌株命名為SDMr01。

1.3 菌株形態(tài)學觀察

在SMAY上培養(yǎng)菌株SDMr01，采取真菌插片培養(yǎng)法培養(yǎng)至產(chǎn)生分生孢子，取下蓋玻片制作臨時裝片，置于顯微鏡下觀察菌株的菌絲，孢子梗，分生孢子等形態(tài)，結(jié)合菌株的菌落形態(tài)初步判斷菌株的分類地位。

1.4 基因擴增與測序

用玻璃涂布棒將制備好的菌株SDMr01的分生孢子懸浮液均勻涂布于 SMAY 平板上，置于25℃下恒溫培養(yǎng)，10 d后收集新鮮的菌絲及分生孢子。將菌絲及分生孢子加液氮進行充分研磨，提取基因組DNA。采用真菌通用引物ITS1/ITS4擴增ITS序列。同時擴增β-tubulin、EF1α和 rpb2[10]基因?；驍U增引物如下：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

β-tubulin上游：5′-CATTATACCGAAGGAGCTGAGCTCG-3′，下游：5′-CGTCCATACCCTCACCTGTGTAC-3′。EF1α上游：5′-ATGGGTAAAGGAAGACAAGACTCAC-3′，下游：5′-GGAAAGTACCCATGATCATGTTCTTG-3′。rpb2上游：5′-CAGTGTTGGTTCACCGGCCGAG-3′，下游：5′-TTTCCCATGGCCTTGTTTACCC-3′。50 μL PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、25 mmol/L MgCl2 3 μL、10 μmol/L引物各1 μL、25 ng/μL DNA 模板 4 μL、5 U/μL rTaq 1 μL、超純水33 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性15 s，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán);72℃延伸5 min。用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，對目的DNA片段進行回收純化，純化產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109，挑取陽性克隆送華大基因公司測序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育進化分析

將測序得到的基因序列提交到GenBank，用BLAST完成序列比對，確定其種屬分類地位，選取綠僵菌屬各模式菌株的EF1α、rpb2、β-tubulin 基因序列，用序列比對軟件Clustal 1.83分別對各基因序列進行比對，用分子進化遺傳分析軟件MEGA 7構(gòu)建菌株單基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹。通過PhyloSuite軟件中的模型計算軟件ModelFinder計算EF1α、rpb2、β-tubulin 基因序列的最佳模型，分別利用MrBayes 3.2.6軟件的BI法和Iqtree軟件中的最大似然法構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹。貝葉斯分析中設(shè)定運行代數(shù)mcmc=1 000 000，通過節(jié)點上的后驗概率值來評估構(gòu)建的進化樹。最大似然法分析中設(shè)定bootstrap=5 000，通過節(jié)點上的自舉值來評估構(gòu)建的進化樹，判斷菌株所屬種類。

1.6 致病性測定

菌株SDMr01接種于SMAY培養(yǎng)基，于25℃下培養(yǎng)10 d待其產(chǎn)孢。用無菌刀片將分生孢子刮下，置于0.05%（V/V）吐溫-80溶液中，用磁力攪拌器攪拌30 min，待孢子完全被打散均勻后，用無菌紗布過濾，獲得純孢子懸浮液，血球計數(shù)板計數(shù)確定孢子濃度為1×108個/mL。將小菜蛾、斜紋夜蛾2齡幼蟲分別放入孢子懸浮液中浸泡30 s，以無菌005%（V/V）的吐溫-80水溶液浸泡幼蟲為對照，浸泡接種后置于干凈的培養(yǎng)皿中自然晾干，然后統(tǒng)一放置于25℃，相對濕度為80%的氣候箱中飼養(yǎng)（飼養(yǎng)方法同上）。每2 d觀察昆蟲的死亡情況，直到各處理中昆蟲的死亡數(shù)量不再變化為止。各處理供試昆蟲30頭，設(shè)重復(fù)3次。毒力測定過程中，挑出死亡的試蟲進行保濕培養(yǎng)，觀察是否變?yōu)榻┫x，從僵蟲中再次分離菌株，觀察其形態(tài)特征，并特異性擴增其ITS片段，比較是否與分離菌株SDMr01一致，以完成柯赫氏法則驗證。試蟲的校正死亡率用Windows Excel和DPS軟件處理。

死亡率=死蟲數(shù)/試蟲數(shù)×100%;

校正死亡率=[（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種形態(tài)學特征

菌株SDMr01在SMAY平板上培養(yǎng)3 d即有白色絨毛狀菌絲長出，菌絲與培養(yǎng)基結(jié)合緊密不易挑起，隨后菌落不斷擴大且變得干燥，干燥的菌落背面皺裂，呈紅褐色。7 d左右，在菌落中央開始長出綠色的分生孢子，而后向內(nèi)、外蔓延，最終分生孢子覆蓋整個菌落，使其呈橄欖綠色（圖1）。

插片培養(yǎng)法培養(yǎng)菌株SDMr01，用光學顯微鏡觀察菌絲、孢子梗及孢子形態(tài)特征（圖2），鏡下分生孢子梗分支簇致密，單軸生，呈葡萄穗狀（圖2a箭頭），在短尖上著生分生孢子，分生孢子呈橢圓形，兩端略尖，光滑，顏色呈淡綠色（圖2b箭頭）。有些分生孢子連接在一起，大小約為（3.0～3.5）μm×（30～5.0）μm（圖2b箭頭所示）。以上分生孢子梗及分生孢子的特征與已報道的萊氏綠僵菌較一致。

2.2 基因擴增與測序

分別擴增菌株SDMr01的ITS、EF1α、rpb2、β-tubulin 基因序列，擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果如圖3所示，經(jīng)測序獲得4個基因序列的大小分別為597、746、840、960 bp，將4條序列提交Genbank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號分別為MT737785，MW672104、MW661285、MW677604。4條序列的BLAST 比對結(jié)果均顯示菌株SDMr01與萊氏綠僵菌一致性最高。

2.3 單基因系統(tǒng)發(fā)育進化分析

以白僵菌為外群，構(gòu)建基于ITS序列單基

因MP系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖4所示，分離菌株SDMr01與萊氏綠僵菌位于同一進化分支，支持率為100%，與國內(nèi)萊氏綠僵菌菌株DT2011N7進化關(guān)系最近，確定菌株SDMr01的分類地位為綠僵菌屬?；?個蛋白編碼基因EF1α、rpb2、β-tubulin 分別構(gòu)建單基因MP系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖5～7），從圖中可以看出3個單基因系統(tǒng)進化樹的聚類結(jié)果較為一致，但在更細的進化分支中略有不同，基于EF1α的單基因MP系統(tǒng)進化樹表明萊氏綠僵菌菌株ARSEF936與ARSEF1972進化關(guān)系較近，位于同一個進化分支，而菌株SDMr01位于另外一個獨立進化分支。但基于rpb2單基因MP系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明菌株SDMr01與菌株ARSEF1972位于同一個進化分支，親緣關(guān)系較近，菌株ARSEF936則位于獨立的進化分支。基于β-tubulin 單基因MP系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明菌株ARSEF1972、ARSEF 936與SDMr01位于同一個進化分支。

2.4 多基因系統(tǒng)發(fā)育進化分析

為進一步明確分離菌株SDMr01的分類地位及其系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系，分別用BI法和MP法構(gòu)建了基于EF1α、rpb2、β-tubulin 3個基因的聯(lián)合序列進化樹（圖8、圖9），兩種算法顯示的結(jié)果較為一致。從多基因進化樹分析可知所選26株綠僵菌可劃分為6大分支，即蝗綠僵菌M.acridum分支、白色綠僵菌M.album分支、黃綠綠僵菌新西蘭變種M.novozealandicum分支和

萊氏綠僵菌分支4個獨立分支，金龜子綠僵菌復(fù)合種分支、黃綠綠僵菌復(fù)合種分支2個復(fù)合種分支，金龜子綠僵菌M.anisopliae、平沙綠僵菌M.pinghaense、羅伯茨綠僵菌M.robertsii、柱狀綠僵菌M.lepidiotae、金龜子綠僵菌大孢變種M.majus和貴州綠僵菌M.guizhouense這6個種聚集于金龜子綠僵菌復(fù)合種分支，自展值為100;癭綿蚜綠僵菌M.pemphigi、 黃綠綠僵菌小孢變種M.minus和黃綠綠僵菌M.flavoviride 這3個種聚集于黃綠綠僵菌復(fù)合種分支，自展值也為100。分離菌株SDMr01位于萊氏綠僵菌分支，與ARSEF 1972和 ARSEF 936聚集于同一分支，自展值為100。上述分析結(jié)果表明，多基因系統(tǒng)進化樹分析進化關(guān)系比單基因系統(tǒng)進化樹更為準確，分支節(jié)點自展值較單基因進化樹中同一節(jié)點高，因而更能準確反映各菌株間的親緣關(guān)系遠近。

2.5 菌株致病性

室內(nèi)致病性測定結(jié)果表明，菌株SDMr01對小菜蛾、斜紋夜蛾2齡幼蟲均具較強的致病力?？ǚ綑z驗結(jié)果表明，與對照組相比，SDMr01菌株濃度1×108個/mL的孢子懸浮液對斜紋夜蛾和小菜蛾2齡幼蟲的致死率均有顯著差異（P<005），且對兩種昆蟲的致死率都是隨著時間的增加而增高（圖10），接種3 d就有昆蟲死亡。接種14 d，小菜蛾、斜紋夜蛾2齡幼蟲的累計校正死亡率分別為77.1%、80.5%。但濃度為1×108個/mL的孢子懸液對兩種昆蟲的致死率無顯著差異（P>005）。

3 討論

萊氏綠僵菌是一種重要的昆蟲病原真菌，因分布廣泛且能引起田間害蟲流行病，所以在有害生物綜合治理（IPM）方面有很大的開發(fā)和應(yīng)用潛力[11-12]。國外早在十九世紀七八十年代就進行了該菌的致病性、菌種資源開發(fā)及侵染機制等方面的研究。國內(nèi)自1975年分離到此菌后也開展了大量的研究，唐維媛等[13]測定了來自山東、河南、安徽等地的萊氏綠僵菌（曾用名：萊氏野村菌）對斜紋夜蛾的毒力，并篩選出了毒力較強的菌株。宋章永等[14]優(yōu)化了菜氏綠僵菌微菌核液體發(fā)酵工藝，為其生防制劑的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。杜廣祖等[15]進行了云南萊氏綠僵菌田間自然發(fā)生流行動態(tài)研究，探索了萊氏綠僵菌田間自然發(fā)生流行規(guī)律。但萊氏綠僵菌的種屬分類地位卻經(jīng)過了多次變動，2014年Kepler等通過多基因系統(tǒng)進化分析，結(jié)合綠僵菌屬相關(guān)近緣屬種的形態(tài)學特征，提出大部分產(chǎn)綠色孢子的野村菌屬中的種均應(yīng)歸至綠僵菌屬的觀點，認為萊氏野村菌N. rileyi應(yīng)歸于綠僵菌屬[16]。

本研究先通過ITS序列初步確定了分離菌株SDMr01的分類地位。然后再通過3個功能基因EF1α、β-tubulin、rpb2 分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹進一步確定各菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系，3個基因的系統(tǒng)發(fā)育進化分析結(jié)果一致，明確了SDMr01為萊氏綠僵菌。但基于EF1α和rpb2 的單基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹中，有些分支的自展值不高。基于β-tubulin基因序列構(gòu)建的綠僵菌屬MP系統(tǒng)進化樹，大部分分支節(jié)點自展值高于60，準確度最高，因此β-tubulin基因可用于綠僵菌屬的遺傳關(guān)系分析，這一結(jié)論與羅卿權(quán)等的研究結(jié)果一致[17]。

與單基因系統(tǒng)發(fā)育進化分析相比，本研究使用的多基因系統(tǒng)發(fā)育進化分析，具有更高的分辨力和可信度， BI法和MP法構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示出了高度的一致性，且各分支節(jié)點的自展值均較高，除個別分支節(jié)點外，自展值均超過85，這表明利用多基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析進化關(guān)系具有較高的可信度。

本研究通過傳統(tǒng)的真菌鑒定方法和多基因系統(tǒng)進化分析方法確定了引起山東臨沂地區(qū)田間害蟲流行病的病原菌為萊氏綠僵菌，室內(nèi)生防試驗驗證了其對小菜蛾和斜紋夜蛾的致病力，這對篩選高效、廣譜的生物防治菌種具有重要意義。下一步將進行該菌株的田間自然流行病的誘導(dǎo)研究，以期為萊氏綠僵菌SDMr01菌株的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] 蒲蟄龍， 李增智.昆蟲真菌學[M]. 合肥：安徽科學技術(shù)出版社， 1996.

[2] 何恒果， 李正躍， 陳斌， 等.蟲生真菌對害蟲防治的研究與應(yīng)用[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報， 2004， 19（2）： 167-173.

[3] 王清海， 萬平平， 黃玉杰， 等.蟲生真菌在害蟲生物防治中的應(yīng)用研究[J].山東科學， 2005， 18（4）： 37-41.

[4] 曾智， 孫運軍， 錢榮華， 等. 我國微生物農(nóng)藥的研究應(yīng)用現(xiàn)狀與前景[J].農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究， 2008， 29（2）： 254-256.

[5] 盧輝， 唐繼洪， 呂寶乾， 等.草地貪夜蛾的生物防治及潛在入侵風險[J].熱帶作物學報， 2019， 40（6）： 1237-1244.

[6] KISH L P， SAMSON R A， ALLEN G E. The genus Nomuraea Maublanc [J]. Journal of Invertebrate Pathology， 1974， 24（2）：154-158.

[7] TORRES L， COTES A M. Effect of cryopreservacion on the viability and the biocontrol activity of Nomuraea rileyi against Spodoptera frugiperda （Lepidoptera： Noctuidae） [J]. Revista Colombiana De Entomología， 2005， 31（2）：133-138.

[8] FRONZA E， SPECHT A， HEINZEN H， et al. Metarhizium （Nomuraea） rileyi as biological control agent [J]. Biocontrol Science & Technology， 2017，27（11）：1-22.

[9] 于海勇. 斜紋夜蛾幼蟲表皮對萊氏野村菌侵染的防御功能研究[D].重慶：重慶大學，2011.

[10]BISCHOFF J F， HUMBER R R A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage [J]. Mycologia， 2009， 101（4）：512-530.

[11]呂思行， 鄭常格， 江敏華， 等.一株昆蟲病原性真菌萊氏野村菌的分離與鑒定[J].廣東農(nóng)業(yè)科學， 2015， 42（15）： 53-56.

[12]AMBETHGAR V. Potential of entomopathogenic fungi in insecticide resistance management （IRM）： a review [J]. Journal of Biopesticides， 2009， 2（2）： 177-193.

[13]唐維媛， 彭小東， 王歡， 等.不同地域萊氏野村菌的培養(yǎng)性狀及對斜紋夜蛾的毒力[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報， 2013， 39（3）： 279-281.

[14]宋章永， 殷幼平， 姜偉， 等.萊氏野村菌微菌核一步液體發(fā)酵新工藝[J].中國生物防治學報， 2014， 30（5）： 660-664.

[15]杜廣祖， 鄭亞強， 蘇錦堯， 等.云南萊氏野村菌田間自然發(fā)生流行動態(tài)研究[J].環(huán)境昆蟲學報， 2018， 40（5）： 160-168.

[16]KEPLER R M， HUMBER R A， BISCHOFFJ F， et al. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics [J]. Mycologia， 2014， 106（4）：811-829.

[17]羅卿權(quán)， 路廣亮， 徐穎.一株淡劍灰翅夜蛾病原性真菌萊氏綠僵菌的多基因序列鑒定[J].植物保護學報， 2018， 45（3）： 614-621.

（責任編輯：楊明麗）