蔣歡 唐貴婷 吳朝君 張勇 彭玉梅 蘇宇 趙冰峰 王旭祎

摘要 Zhihengliuella aestuarii B18是一株對十字花科根腫病菌Plasmodiophora brassicae具有抑制作用的優(yōu)良生防菌株。為探明其生防潛能，本文通過抗生素抗性標(biāo)記法、盆栽試驗(yàn)和田間小區(qū)試驗(yàn)研究了B18在不同土壤pH、土壤溫度、土壤含水量、初始接種濃度、蔬菜作物以及不同土壤類型中的定殖動態(tài)。滅菌土試驗(yàn)結(jié)果表明：調(diào)節(jié)土壤pH 7.5～8.5，含水量10%～30%，放置于10～25℃，70 d后B18定殖菌量保持在105～107 cfu/g。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明：初始接種菌液濃度為109 cfu/mL時(shí)，45 d后根際土中定殖菌量可穩(wěn)定在104～105 cfu/g。將50 mL濃度為2×109 cfu/mL的生防菌菌液接種于田間不同類型土壤后，第30天定殖菌量分別為病田8.7×105 cfu/g，病土1.02×105 cfu/g，健田8.5×104 cfu/g，健土2.6×104 cfu/g，即定殖能力由強(qiáng)到弱依次為：病田>病土>健田>健土。且病田中B18在根際土中可存活至45 d且菌量保持在104 cfu/g，根內(nèi)可存活至31 d且菌量保持在104 cfu/g。田間調(diào)查結(jié)果顯示B18在病田和病土中對榨菜根腫病的防效分別為4201%和47.53%，增產(chǎn)率分別為37.24%和40.22%。

關(guān)鍵詞 生防菌; Zhihengliuella aestuarii B18; 定殖菌量; 根際土; 根腫病菌; 防效

中圖分類號： S 436.344

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020630

Analysis of the colonization ability and biocontrol efficacy of Zhihengliuella aestuarii B18 against clubroot disease

JIANG Huan， TANG Guiting， WU Chaojun， ZHANG Yong， PENG Yumei，

SU Yu， ZHAO Bingfeng， WANG Xuyi*

（Southeast of Chongqing Academy of Agricultural Sciences， Fuling 408099， China）

Abstract

Antagonistic Zhihengliuella aestuarii B18 is an excellent biocontrol strain which can inhibit Plasmodiophora brassicae. In order to explore its biocontrol potential， the colonization dynamics of B18 in different soil pH values， soil temperatures， soil water contents， initial inoculation concentrations， different vegetable crops and different soil types were studied by using antibiotic resistance labeling method and conducting pot experiments and field plot experiments. The results of sterilized soil test showed that， under the conditions of soil pH 7.5-8.5， water content 10%-30% and 10℃-25℃， the amount of colonized bacteria remained at 105-107 cfu/g after 70 days. The results of pot experiments showed that， when the initial inoculation concentration was 109cfu/mL， the amount of colonized bacteria in rhizosphere soil stably remained at 104-105 cfu/g after 45 days. When 50 mL of 2×109 cfu/mL biocontrol bacterial solution was inoculated in different soil types in the field， the amount of colonized bacteria on the 30th day was 8.7×105 cfu/g in the infected field， 1.02×105 cfu/g in the infected soil， 8.5×104 cfu/g in the healthy field， and 2.6×104 cfu/g in the healthy soil. These results indicated that， under different conditions， the colonization ability of B18 from strong to weak was as followed： infected field infected soil， healthy field and healthy soil. In the infected field， B18 could survive for 45 days in the rhizosphere soil with an amount of 104 cfu/g， and 31 days in the root with an amount of 104 cfu/g. The results of field investigation showed that B18 had control efficacy of 4201% and 47.53% against clubroot disease of mustard tuber in infected fields and infected soils， with yield increase rate of 37.24% and 40.22%， respectively.

Key words

biocontrol bacteria; Zhihengliuella aestuarii B18; colonization quantity; rhizosphere soil; Plasmodiophora brassicae; control effect

十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌Plasmodiophora brassicae Woron.引起的影響全球十字花科作物生產(chǎn)的土傳病害[1]。在中國，根腫病常年危害面積占十字花科作物種植面積的 1/3以上，造成的產(chǎn)量損失達(dá) 20%～30%，發(fā)病嚴(yán)重田塊產(chǎn)量損失可達(dá) 60%以上，有的甚至絕收[2-4]。根腫病菌是一種不可人工培養(yǎng)的專性寄生菌，病菌在土壤中存活時(shí)間長且有生理分化[5]，經(jīng)土壤、種子、流水等傳播，防治十分困難。國內(nèi)外針對該病原菌進(jìn)行了大量防治技術(shù)的研究，包括抗病品種選育[6]、農(nóng)業(yè)和化學(xué)防治[7-8]和生物防治[9-10]，其中生物防治近年來越來越受到研究者的重視并初見成效。

生防微生物在實(shí)際應(yīng)用中會受到諸多因素的影響，包括土壤環(huán)境條件的復(fù)雜性及多樣性、土壤微生物之間的競爭、生防微生物與植物根部的親和能力等，這通常也是造成生防菌在田間效果不穩(wěn)定的重要原因。生防微生物被引入土壤后能否在寄主植物根圍以及體內(nèi)定殖關(guān)系到其對植物病害防效的穩(wěn)定性和持續(xù)性，如果能成功定殖，則可少受或不受外界復(fù)雜生態(tài)環(huán)境的影響，充分發(fā)揮其防治植物病害的潛能。因此，生防菌在植物體內(nèi)和根際土壤中的定殖能力是評定其是否具有產(chǎn)業(yè)化前景的一個(gè)重要指標(biāo)。目前已發(fā)展出多種標(biāo)記方法監(jiān)測目標(biāo)微生物施用后的定殖情況，常用的主要有抗生素抗性標(biāo)記法[11-12]和熒光標(biāo)記法[13-14]。抗生素抗性標(biāo)記法具有簡便、快捷、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。任玉珍等[15]測定了艾草Artemisia argyi內(nèi)生放線菌Ac10對4種抗生素（萘啶酸、利福平、氨芐西林、鏈霉素） 和5種殺菌劑（啶酰菌胺、啶菌噁唑、苯醚甲環(huán)唑、噁霜·錳鋅、多抗霉素）的抗性，篩選出抗性菌株及其相應(yīng)的抗藥濃度，并采用加入相應(yīng)濃度藥劑的培養(yǎng)基，測定了Ac10在玉米、番茄、白菜和黃瓜4種植株體內(nèi)的定殖能力及對這些植物胚軸和胚根生長的影響。Wu等[16]的研究表明，解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens SQY 162與有機(jī)肥混施后在盆栽和田間均可在煙草根際土壤中定殖并顯著降低煙草青枯病的發(fā)病率。邱小燕等[17]的研究結(jié)果表明枯草芽胞桿菌B.subtilis菌株515-126在玉米植株的根際土壤、根表有很好的定殖能力，且在田間對玉米紋枯病相對防效達(dá)到49.37%。

Zhihengliuella aestuarii B18是一株從榨菜根際土壤中篩選出的對榨菜根腫病防治效果良好的菌株。為評價(jià)B18的潛在應(yīng)用價(jià)值，有必要對B18的定殖能力進(jìn)行全面的研究，本文通過抗生素抗性標(biāo)記法對B18在土壤、榨菜根際以及根內(nèi)定殖動態(tài)的影響因素進(jìn)行研究，包括土壤pH、土壤溫度、土壤含水量、菌懸液的初始接種濃度、不同蔬菜作物以及不同土壤類型對B18定殖能力的影響。以期為榨菜根腫病的防治以及B18在田間的應(yīng)用提供可供參考的理論依據(jù)，具有理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、蔬菜種子以及培養(yǎng)基

供試菌株：根腫病菌菌根（未進(jìn)行單孢分離）采自重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院根腫病試驗(yàn)田，-20℃保存;B18為本團(tuán)隊(duì)從榨菜根際土壤中篩選出的對榨菜根腫病防治效果良好的菌株，經(jīng)鑒定其為劉志恒菌屬真菌Zhihengliuella aestuarii，菌體于甘油中-80℃保存;MB18為B18抗利福平突變株，拮抗?jié)舛葹?00 μg/mL。

供試蔬菜種子：榨菜Brassica juncea var.tumida‘涪雜2號，甘藍(lán)B.oleracea var.capitata‘綠園4號，大白菜B.rapa var.glabra‘豐抗90。

豆粉液體培養(yǎng)基：大豆粉10.0 g，葡萄糖10.0 g，NaCl 2.5 g，蛋白胨 3.0 g，CaCO3 2.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4;NA固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂粉15.0～18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 供試土壤的采集及處理

土壤采集自無根腫病菌的榨菜田，自然風(fēng)干研碎后過40目篩，170℃干熱滅菌2 h，翻攪再滅菌2 h，備用。

1.3 抗生素標(biāo)記

吸取5 mL B18菌液接入含10 μg/mL利福平（Rif）的100 mL豆粉培養(yǎng)液中，180 r/min，30℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h后將菌液梯度稀釋至10-6，吸取10-4、10-5和10-6 梯度的菌液100 μL涂布于含10 μg/mL Rif（記作Rif 10，下同）的NA平板，30℃黑暗倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落于含更高濃度Rif的豆粉液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，涂布于相同濃度的抗生素平板，每次培養(yǎng)液中Rif的濃度均增加20 μg/mL，直至200 μg/mL。然后用含Rif 200的NA平板檢測并挑取能穩(wěn)定生長，且抑制根腫病菌孢子萌發(fā)與野生型菌株差異不顯著、菌落形態(tài)變化不大的突變菌株，命名為MB18。

1.4 根腫病菌孢子懸浮液制備

將-20℃保存的根腫病菌菌根（以下簡稱菌根）解凍洗凈切成小塊，按比例（m菌根∶m水=1∶5）加入純水于榨汁機(jī)中打成勻漿，勻漿八層紗布過濾，濾液稀釋至10-1、10-2、10-3后用血球計(jì)數(shù)板于顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算濾液中的孢子濃度，最后將孢子濃度用純水調(diào)至2×108個(gè)/mL備用。

1.5 MB18在不同pH，溫度及含水量土壤中定殖菌量測定

每100 g供試土壤（處理方法見1.2）中加入MB18培養(yǎng)液（2×109cfu/mL）5 mL后做如下處理：1）加入無菌水10 mL，使含水量為15%，用HCl和NaOH粉末調(diào)節(jié)土壤pH至4.5、5.5、6.5、7.5、8.5和9.0（用HCl調(diào)節(jié)pH時(shí)記錄加入的HCl體積V1，則加入無菌水的體積為10 mL-V1），室溫（重慶涪陵4月日均氣溫約為16～25℃，下同）下放置;2）加入無菌水10 mL使含水量為15%，用NaOH粉末調(diào)節(jié)土壤pH（使用土壤pH計(jì)進(jìn)行測定）至8.0～8.5之間，分別置于10、15、20、25、30、35℃和40℃黑暗培養(yǎng);3）調(diào)節(jié)土壤pH至8.0～8.5之間，加入無菌水調(diào)節(jié)土壤含水量至5%、10%、15%、20%、25%和30%，室溫下放置。

每處理3次重復(fù)，處理后每隔14 d對土壤中定殖菌量進(jìn)行分離計(jì)數(shù)。

土樣含菌數(shù)量（cfu/g）=每板平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×基礎(chǔ)液體積/[土樣克數(shù)×（1-土樣含水量） ×菌懸液加入量]。

式中，基礎(chǔ)液體積：土樣加入無菌水后的母液體積（mL）;稀釋倍數(shù)：母液進(jìn)行梯度稀釋后的倍數(shù);菌懸液加入量：涂板時(shí)加入的菌液體積（mL）。

1.6 不同初始接種濃度下MB18在榨菜根際土以及根內(nèi)定殖菌量測定

1.6.1 榨菜苗準(zhǔn)備

將表面消毒（75%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞浸泡5 min，滅菌水漂洗4次，晾干）的榨菜種子播種于營養(yǎng)基質(zhì)上，于光照培養(yǎng)箱中28℃黑暗催芽2 d后，轉(zhuǎn)移至組培架上（L∥D=16 h∥8 h，溫度22℃）培養(yǎng)至兩葉一心后移栽至無根腫病菌的榨菜土壤（土壤裝于口徑16 cm×高12 cm的塑料花盆中，每盆移栽1株）中，培養(yǎng)（L∥D=16 h∥8 h，溫度22℃）7 d后做如下處理：

1）用移液槍分別吸取濃度為2×107、2×108、2×109 cfu/mL的MB18菌液接種于榨菜苗根圍土壤中，每株10 mL;

2）用移液槍分別吸取濃度為2×107、2×108、2×109 cfu/mL的MB18菌液和濃度為2×108個(gè)/mL的根腫病菌休眠孢子懸浮液接種于榨菜苗根圍土壤中，每株10 mL MB18菌液+10 mL根腫病菌休眠孢子懸浮液。

每處理移栽20株，第10天采集根際土和榨菜苗進(jìn)行MB18分離計(jì)數(shù)，以后每7 d取樣1次，最后1次取樣為接種后45 d，共取樣5次，每次每處理采集3株榨菜苗及其根圍土壤。

1.6.2 根際土的采集及根際土中MB18定殖菌量測定

將植株整個(gè)根系完整挖出后，用采樣鏟輕敲根系，使與根系結(jié)合較松的土壤自然落下后棄去。將與根系緊密結(jié)合的土壤連同根系放入自封式采樣袋，用手輕輕揉搓根系，使與根系結(jié)合較緊密的土壤落入采樣袋中，所得樣品即為根際土。取兩份根際土，一份用于烘干后測定含水量，一份用于菌落計(jì)數(shù)。

1.6.3 根內(nèi)MB18定殖菌量測定

分離根內(nèi)標(biāo)記菌株時(shí)，先將根組織進(jìn)行表面消毒。用70%乙醇浸泡3 min，再經(jīng)NaClO消毒5 min，然后用70%乙醇浸泡1 min，最后無菌水沖洗4次，取最后1次沖洗材料的無菌水100 μL涂平板，檢測表面消毒是否徹底。后取1 g無菌材料置于研缽中，加9 mL無菌水研磨后靜置15 min，取上清液梯度稀釋后涂布于Rif 200的NA平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

每克土樣含菌數(shù)量計(jì)算方法同1.5。

每克根組織含菌數(shù)量（cfu/g）=單菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)/根組織克數(shù)。

1.7 MB18在不同蔬菜作物（榨菜、甘藍(lán)、大白菜）的根際土以及根內(nèi)定殖菌量測定

菜苗準(zhǔn)備方法同1.6.1，菜苗移栽后做如下處理：

1）用移液槍吸取濃度為2×109 cfu/mL的MB18菌液分別接種于榨菜苗、甘藍(lán)苗和白菜苗根圍土壤中，每株10 mL;2）用移液槍分別吸取濃度為2×109 cfu/mL的MB18菌液和濃度為2×108個(gè)/mL的根腫病菌休眠孢子懸浮液接種于榨菜苗、甘藍(lán)苗和白菜苗根圍土壤中，每株10 mL MB18菌液+10 mL根腫病菌休眠孢子懸浮液。

每處理移栽20株，樣品采集方法、時(shí)間以及菌株定殖菌量的測定方法同1.6。

1.8 MB18在田間定殖菌量的測定及對榨菜根腫病的防治效果

從苗床拔出榨菜苗后分別在濃度為2×109 cfu/mL的MB18和B18菌液中浸根30 min后移栽至田間，同時(shí)用菌液進(jìn)行灌根，處理如下：

1）病土（有根腫病旱地，下同）中榨菜苗用B18菌液浸根后每窩澆灌50 mL，3個(gè)重復(fù)（用于榨菜成熟時(shí)調(diào)查病情）;用MB18菌液浸根后每窩澆灌50 mL，6個(gè)重復(fù)（其中3個(gè)用于榨菜成熟時(shí)調(diào)查病情，另3個(gè)用于田間定殖能力測定）;2）病田（有根腫病水旱輪作地，下同）中榨菜苗處理同病土;3）健康土（無根腫病旱地）與健康田（無根腫病水旱輪作地）中榨菜苗用MB18菌液浸根后每窩澆灌50 mL，3個(gè)重復(fù)，用于田間定殖能力測定;4）CK：病土與病田中榨菜苗用相應(yīng)的無菌培養(yǎng)液代替生防菌菌液澆灌，每窩50 mL，3個(gè)重復(fù)。

試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)小區(qū)長4 m，寬17 m，移栽60株，田間常規(guī)管理。第1次取樣于移栽后10 d進(jìn)行，以后每7 d取1次樣。榨菜成熟時(shí)調(diào)查發(fā)病率、病情指數(shù)以及產(chǎn)量。

榨菜根腫病田間分級標(biāo)準(zhǔn)參照高明泉等[18]的分級方法。

產(chǎn)量測定：榨菜植株去除根部以及葉片，剩余的瘤莖用于產(chǎn)量測定。

病株率=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%;

病情指數(shù)=∑（病級代表值×各級病株數(shù)）×100/（調(diào)查總株數(shù)×最高級病級代表值）;

防治效果=[（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)]×100%。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 26.0軟件中鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素標(biāo)記

標(biāo)記菌株MB18與野生型菌株B18相比較，菌落形態(tài)與顏色無變化（圖1），對根腫病菌休眠孢子的抑制率分別為71.85%（MB18）和73.89%（B18），抑制作用相當(dāng)，可用于后續(xù)的定殖試驗(yàn)。

2.2 MB18在不同溫度、pH和含水量的土壤中的定殖菌量

溫度、土壤pH和含水量對MB18定殖影響顯著（表1），MB18對pH敏感，土壤pH 7.5和8.5時(shí)定殖菌量最大且定殖時(shí)間長，接菌后70 d菌量仍可達(dá)6.5×105、8.9×106 cfu/g。pH 4.5～5.5時(shí)接菌后菌量迅速降低，第28天時(shí)菌量降為0。

MB18定殖能力隨溫度升高而逐漸減弱，溫度越高，菌量減少得越快。10℃和15℃定殖菌量顯著高于其他溫度，接菌后70 d時(shí)菌量仍可達(dá)2.1×107 cfu/g，40℃下定殖菌量最低，接菌后42 d菌量降為0。

MB18定殖能力隨土壤含水量升高而增強(qiáng)，土壤含水量為30%時(shí)定殖菌量最大，接菌后70 d菌量為3.8×107 cfu/g。土壤含水量5%時(shí)定殖菌量最低，接菌后56 d菌量降為0。

2.3 不同初始接種濃度下MB18在榨菜根際以及根內(nèi)的定殖菌量

不同初始接種濃度對MB18定殖影響顯著（表2），榨菜根際土以及根內(nèi)定殖菌量隨接種濃度升高而增加，在接種濃度為109 cfu/mL 時(shí)定殖菌量最大，107 cfu/mL時(shí)定殖菌量最小;同一接種濃度下，當(dāng)接種濃度為107 cfu/mL時(shí)，含根腫病菌的根際土中定殖菌量與無根腫病菌根際土中定殖菌量無顯著差異，接種濃度為108 cfu/mL和109 cfu/mL時(shí)，接種后10～17 d，含根腫病菌的根際土中定殖菌量顯著高于無根腫病菌的根際土;接種后24 d二者無顯著差異，接種后31～45 d根腫病菌根際土定殖菌量低于無根腫病菌根際土。

MB18在根際土中定殖菌量高于根內(nèi)，定殖時(shí)間也長于根內(nèi);根際土中在接種后45 d時(shí)各接種濃度下仍可回收到MB18;榨菜根內(nèi)，接種濃度為108 cfu/mL和109 cfu/mL時(shí)，在接種后31 d及以后回收不到MB18，接種濃度為107 cfu/mL時(shí)，在接種后24 d及以后回收不到MB18。

2.4 MB18在不同蔬菜作物（榨菜、甘藍(lán)、大白菜）的根際以及根內(nèi)的定殖菌量

分別測定不同蔬菜作物根際土以及根內(nèi)MB18定殖菌量，結(jié)果（表3）顯示，菌株在不同蔬菜作物中定殖規(guī)律基本一致。根際土中定殖菌量在接種后24 d高于根內(nèi)，且持續(xù)時(shí)間長于根內(nèi)，接種后45 d菌量可穩(wěn)定在104 cfu/g。根內(nèi)接種后31 d菌量為0;除個(gè)別處理外，總的趨勢為：接種后10～24 d接種根腫病菌的根際土中及根內(nèi)定殖菌量高于無根腫病菌的處理。接種后31 d根內(nèi)定殖菌量均為0。

2.5 MB18在田間定殖菌量測定

不同土壤類型對MB18定殖菌量影響顯著（表4）。定殖菌量規(guī)律為：感染根腫病菌土壤中定殖菌量高于健康土壤，水旱輪作地（田）高于旱地（土），即病田>病土>健田>健土;根際土中定殖菌量高于根內(nèi)，定殖時(shí)間長于根內(nèi);病田根際土中接種后45 d MB18定殖菌量為5.3×104 cfu/g，其余田塊菌量為0;病田根內(nèi)接種后31 d定殖菌量為4.2×104 cfu/g，其余田塊根內(nèi)菌量為0。

2.6 田間調(diào)查結(jié)果

MB18以及B18在田間對榨菜根腫病的防治效果如表5所示，結(jié)果顯示經(jīng)過MB18和B18處理后榨菜根腫病發(fā)病率和病情指數(shù)顯著低于對照，產(chǎn)量顯著高于對照，且兩菌株之間的發(fā)病率、病情指數(shù)以及產(chǎn)量差異不大;MB18與B18對榨菜根腫病的防效明顯，均在38%以上，榨菜產(chǎn)量也顯著增加，增產(chǎn)率均在30%～40%之間。

3 結(jié)論與討論

探究生防菌在施用過程中的定殖特性及其作用機(jī)制對于提高生防效果以更好地應(yīng)用于生產(chǎn)意義重大[13]。多數(shù)生防菌在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)有很高的抑菌活性，但是在田間防效卻不理想，這就要求研究者在研究生防菌自身理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究影響生防菌定殖的土壤環(huán)境因素，優(yōu)化生防菌在田間的生存環(huán)境，延長其在田間的存活時(shí)間，以便發(fā)揮更佳的防病效果。

研究表明，土壤pH對生防菌的定殖影響較大，不同生防菌對pH適應(yīng)范圍不同。Ownley等[19]研究發(fā)現(xiàn)生防菌熒光假單胞菌Pseudomonad fluorescens 2-79 在pH 為 6.0～6.6 時(shí)的定殖效果最好。馬桂珍等[20]和王淑芳等[21]報(bào)道生防菌L1-9在酸性條件下對禾谷鐮刀菌 Fusarium graminearum 抑菌活性穩(wěn)定，且在土壤pH 7時(shí)在黃瓜根表土壤中定殖能力最好，速度最快。蔣歡等[22]研究發(fā)現(xiàn)，榨菜根腫病發(fā)病土壤pH主要分布在4.0～7.0，其中pH 5.0～60的土壤最多，在土壤pH 4.5～6.0時(shí)根腫病菌休眠孢子萌發(fā)率高且榨菜發(fā)病嚴(yán)重。本試驗(yàn)結(jié)果表明，B18對pH敏感，若土壤pH低于5.5，B18在土壤中的存活時(shí)間約為21 d，且0～21 d之間隨著時(shí)間的延長菌量急劇減少。故B18田間防效不穩(wěn)定的最主要原因可能是根腫病田土壤偏酸性，不利于菌株在植株根圍的定殖，從而導(dǎo)致防效不佳。

土壤溫度也是影響生防菌定殖的重要因素。Loper[23]報(bào)道低溫有利于生防菌的定殖，可能是因?yàn)橥寥乐形⑸锏幕顒与S溫度降低而減弱，故與外源菌的競爭作用也隨之減弱。黨文芳[24]等的研究表明，生防菌貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis BHZ-29在土壤溫度30℃時(shí)生長最好。本研究結(jié)果顯示B18對土壤溫度適應(yīng)范圍較廣，10～25℃之間均能很好地存活至70 d而保持菌量在105～107 cfu/g，但10～15℃下B18定殖菌量更高，這與冬季栽培的十字花科作物移栽時(shí)的溫度相近，故有利于B18對根腫病的控制。

生防菌在田間需要借助土壤自由水才能轉(zhuǎn)移到植物根圍土壤的生態(tài)位點(diǎn)上，所以土壤濕度影響著生防菌的定殖。杜嬋娟等[25]的研究結(jié)果顯示當(dāng)土壤含水量為25%時(shí)，生防菌哈茨木霉gz-2在土壤中的定殖能力最好，王素芳等[26]和汪軍等[27]的研究結(jié)果顯示鏈霉菌 Streptomyces sp. S506和淡紫擬青霉 Paecilomyces lilacinus E7等拮抗菌在土壤含水量20%～25%時(shí)定殖最好。本研究結(jié)果顯示B18在土壤含水量10%～30%之間都能很好地存活70 d且保持菌量在105～107 cfu/g，在土壤含水量30%時(shí)，定殖菌量顯著高于其他處理。說明B18同其他生防菌一樣，適合土壤含水量高的環(huán)境。

本研究顯示，在初始接種濃度為109 cfu/mL時(shí)，B18定殖菌量最大，故田間施用109cfu/mL B18更有利于根腫病菌的防治。賈瑞敏等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，生防菌濃度對甘藍(lán)種子的萌發(fā)率、甘藍(lán)苗期和結(jié)球期生長情況以及甘藍(lán)根腫病的防效都存在顯著影響，高濃度的生防菌對甘藍(lán)種子萌發(fā)和幼苗生長均有抑制作用。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，篩選出生防菌對植株的最佳施用濃度才能更好地發(fā)揮其拮抗作用。另外B18在接種根腫病菌的榨菜根際土以及根內(nèi)的定殖菌量在接種后10～24 d高于沒有接種根腫病菌的處理，可能是因?yàn)楦[病菌與B18的競爭激發(fā)了B18的拮抗作用，從而使更多的B18定殖于植株根圍與根內(nèi)以抵抗病原菌，說明B18具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

B18在不同蔬菜作物根際土以及根內(nèi)定殖規(guī)律相似，說明B18應(yīng)用范圍不只局限于榨菜，可用于不同的十字花科作物。

B18在田間的定殖規(guī)律與室內(nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果一致，即根際土定殖菌量與定殖時(shí)間均高于根內(nèi)，且?guī)Ь寥栏哂诮】低寥溃递喿鞯兀ㄌ铮└哂诤档兀ㄍ粒?，即病?病土>健田>健土，生防菌在田間存活時(shí)間為31～45 d，說明田間單獨(dú)施用B18菌液后菌量迅速減少直至死亡，存活時(shí)間短，導(dǎo)致其防效不佳，故后續(xù)有必要將B18制備成菌肥或菌劑，以保證其在田間的菌量與存活時(shí)間。

綜上所述，生防菌株B18對pH敏感，對土壤溫濕度適應(yīng)范圍較廣，但在10～15℃的低溫以及土壤含水量25%～30%的環(huán)境下定殖菌量更高且定殖時(shí)間更長，田間施用濃度為109 cfu/mL較為合適，可施用于不同的十字花科作物以防治根腫病。但施用于田間后菌量迅速減少，定殖時(shí)間短，導(dǎo)致對榨菜根腫病的防效不穩(wěn)定，故B18需固定于合適的載體上，如與生物質(zhì)碳或偏堿性的有機(jī)肥等混合后再施入田間，首先滿足B18對pH的要求，其次為B18 提供營養(yǎng)以及保護(hù)，以延長其在田間的存活時(shí)間，從而提高其對根腫病的田間防效。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）