陳云云 李惠霞 張海英 徐生軍 劉永剛

摘要 為篩選用于甘藍(lán)枯萎病的生防菌并明確其對病原菌的抑菌活性和盆栽防治效果，對從荒漠沙土中分離、篩選的細(xì)菌菌株MQ19ST15進(jìn)行了對峙培養(yǎng)、抑菌活性物質(zhì)測定、盆栽防效測定和種類鑒定。結(jié)果表明，菌株MQ19ST15能夠顯著抑制病原菌的菌絲生長，使菌絲出現(xiàn)膨大、變形扭曲及分支增多等畸變，抑菌率達(dá)54.95%。抑菌活性物質(zhì)檢測顯示，該菌株能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、果膠酶及β-1，3-葡聚糖酶;抗菌脂肽物質(zhì)合成相關(guān)基因擴增顯示其基因組DNA中具有surfactin、iturin、fengycin和bacillomycin 4種抗菌脂肽物質(zhì)的合成調(diào)控基因。盆栽試驗結(jié)果顯示，該菌株對甘藍(lán)枯萎病的防控效果為53.03%。通過菌落形態(tài)、16S rRNA基因和gyrB基因序列分析將其鑒定為萎縮芽胞桿菌Bacillus atrophaeus。

關(guān)鍵詞 甘藍(lán)枯萎病; 萎縮芽胞桿菌; 抑菌活性; 盆栽防效

中圖分類號： S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020565

Identification of Bacillus atrophaeus MQ19ST15 and its control efficacy against Fusarium wilt on potted cabbage plants

CHEN Yunyun1，2， LI Huixia1， ZHANG Haiying2，3， XU Shengjun2，3*， LIU Yonggang1，2*

（1. College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Biocontrol Engineering Laboratory of Crop Diseases

and Pests of Gansu Province， Lanzhou 730070， China; 2. Institute of Plant Protection， Gansu Academy of

Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， China; 3. Scientific Observation and Experimental Station of Crop

Pests in Tianshui， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Tianshui 741200， China）

Abstract

In order to discover biocontrol bacteria against the cabbage Fusarium wilt and clarify their inhibitory activity against plant pathogens and control effect on potted plants， the bacterial strain MQ19ST15， isolated and screened from sandy soil， was subjected to dual culture， determination of antibacterial active substances， determination of their control effects on potted plants and species identification. The results showed that strain MQ19ST15 could significantly inhibit the mycelial growth of plant pathogens and caused the mycelium to expand， distort and branch， with an inhibition rate of 54.95%. The detection results of inhibitory substances showed that the strain could produce amylase， protease， pectinase and β-1，3-glucanase. The amplification results of the genes related to the synthesis of antimicrobial lipopeptides showed that there were synthetic genes of four antimicrobial lipopeptides （surfactin， iturin， fengycin and bacillomycin） in its genome. The pot experiment results showed that the control efficacy of this strain against cabbage Fusarium wilt was 53.03%. It was identified as Bacillus atrophaeus by colony morphology， 16S rRNA gene and gyrB gene sequence analysis.

Key words

cabbage Fusarium wilt; Bacillus atrophaeus; inhibitory activity; control effect on potted plants

甘藍(lán)枯萎病是由尖孢鐮刀菌十字花科?；虵usarium oxysporum f.sp.conglutinans侵染引起的土傳真菌病害[1]，在全世界多數(shù)甘藍(lán)栽培地區(qū)都有發(fā)生。2003年李明遠(yuǎn)等[2]在國內(nèi)首次報道了該病，隨后此病陸續(xù)在我國北京[3]、山西[4]、甘肅[5]等甘藍(lán)主產(chǎn)區(qū)發(fā)生。甘藍(lán)是甘肅省高原夏菜的主打產(chǎn)品，在蘭州、定西等地有悠久的種植歷史，2009年甘肅省定西市安定區(qū)[5]發(fā)現(xiàn)此病，平均發(fā)病率達(dá)20%以上，最高達(dá)到45.68%[6]。甘藍(lán)枯萎病在甘藍(lán)生長期均可發(fā)生，主要癥狀表現(xiàn)為葉片變黃、萎蔫、掉葉，植株維管束組織變褐、阻塞，并最終導(dǎo)致整株死亡，嚴(yán)重影響甘藍(lán)的質(zhì)量和產(chǎn)量。選用抗病品種是甘藍(lán)枯萎病的主要防治措施，但是抗病性極易喪失，生產(chǎn)中缺乏真正有效的抗病品種，因此化學(xué)防治依然是防治此病害的重要手段，如使用嘧菌酯懸浮劑和甲霜·噁霉靈水劑組合灌根[7]和采用棉隆微粒劑和氰胺化鈣土壤凈化劑處理土壤[8]等方法具有一定的防治效果。但是，化學(xué)農(nóng)藥的使用易帶來諸如病原菌產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥殘留超標(biāo)、作物品質(zhì)下降、土壤鹽漬化及地下水污染等一系列食品安全和生態(tài)環(huán)境問題。因此，亟待開發(fā)新型、高效、環(huán)境友好的生物防治技術(shù)產(chǎn)品。

生防菌防控農(nóng)作物病害是一種綠色、安全、對環(huán)境友好的方法，是當(dāng)前植物病害綠色防控的研究熱點，其有益作用已經(jīng)在多種重要的農(nóng)作物病害防治試驗中得到證實。生防菌的抑菌活性主要通過菌株產(chǎn)生的一些具抑菌作用的次級代謝產(chǎn)物體現(xiàn)，如分泌水解酶和抗菌脂肽物質(zhì)。已有研究表明細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶[9]、纖維素酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶[10-11]等水解酶可破壞真菌細(xì)胞壁致使菌絲畸變[12]?？咕奈镔|(zhì)種類較多，常見的有surfactin、fengycin、iturin、 bacillomycin等，其具有抗菌、消炎、抗病毒等多種作用，且抗菌譜廣、作用迅速強大、不易產(chǎn)生耐藥性，具有廣闊的應(yīng)用前景[13-14]。當(dāng)前已有多種生防菌制劑被成功開發(fā)使用，然而，生防菌與土壤生態(tài)環(huán)境中的微生物群落之間經(jīng)常存在相互作用，外源生防菌的引入可以引起農(nóng)作物根際土壤微生物群落組成發(fā)生變化，因此生防菌的使用有很大的地域適應(yīng)性。由于上述原因

目前國內(nèi)外的一些商品化生防菌制劑在防治甘藍(lán)枯萎病時效果并不理想，這就迫切需要挖掘本地特有的微生物資源，研究適合甘肅生態(tài)環(huán)境的生防菌用于甘藍(lán)枯萎病的防控。

本研究從采自甘肅省武威市民勤縣的荒漠沙土中分離、篩選和鑒定出針對甘藍(lán)枯萎病的生防細(xì)菌，并評價其對甘藍(lán)枯萎病的防治效果，以期為開發(fā)穩(wěn)定有效的甘藍(lán)枯萎病生防菌劑提供潛在的菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

荒漠土壤：采自甘肅省武威市民勤縣黃壩灣（103°8′46″E，38°32′52″N），共500 g。

甘藍(lán)枯萎病菌：尖孢鐮刀菌十字花科?；虵usarium oxysporum f.sp. conglutinans，代號FOSY-2-1，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。

甘藍(lán)：‘中甘21，北京中蔬園藝良種研究開發(fā)中心。

藥劑：70%代森錳鋅可濕性粉劑（WP），南通寶葉化工有限公司;10億芽胞/g枯草芽胞桿菌可濕性粉劑（WP），臺灣百泰生物科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤細(xì)菌的分離、純化與保存

采用梯度稀釋法、平板涂布法和平板劃線法分離純化土壤中細(xì)菌。將土樣混合均勻后，稱取1.0 g土樣置于裝有9 mL無菌水的試管中，梯度稀釋到10-5，從最后3個濃度的試管中分別取100 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)72 h后挑取不同形態(tài)菌落劃線于LB固體培養(yǎng)基上，對菌落進(jìn)行純化。將分離純化后的細(xì)菌轉(zhuǎn)移至LB液體培養(yǎng)基，在恒溫振蕩器（28℃、150 r/min）中培養(yǎng)72 h后，裝入終濃度20%甘油中保存于-80℃冰箱中以備進(jìn)一步篩選。

1.2.2 拮抗細(xì)菌的篩選

采用平板對峙培養(yǎng)法[15]。將甘藍(lán)枯萎病菌在PDA平板上培養(yǎng)5 d，從菌落邊緣用無菌打孔器打取長勢一致且直徑相同的菌餅，在直徑90 mm的PDA平板距邊緣2 cm的相對位置處，分別接種甘藍(lán)枯萎病菌和10 μL保存于-80℃冰箱的候選細(xì)菌菌液，以病原菌單獨培養(yǎng)作為對照，培養(yǎng)7 d。挑選具有抑菌效果的細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩，將初篩得到的菌株菌液在LB平板上劃線培養(yǎng)48 h，然后在直徑90 mm的PDA平板距邊緣約2 cm的相對位置處，分別接種甘藍(lán)枯萎病菌和細(xì)菌單菌落，每組設(shè)3個重復(fù)，倒置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以病原菌單獨培養(yǎng)作為對照，連續(xù)觀察菌落生長情況，培養(yǎng)至對照處理中病原菌菌落直徑≥4.5 cm，記錄各處理病原菌半徑及抑菌帶寬度，計算抑菌率。同時，從對峙培養(yǎng)的平板中抑菌帶邊緣和對照菌落邊緣挑取菌絲于光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)，對比并拍照記錄。

抑菌率=（對照病原菌菌落半徑-生防菌對峙的病原菌菌落半徑）/對照病原菌菌落半徑×100%。

1.2.3 抑菌活性物質(zhì)檢測

將拮抗細(xì)菌分別接至淀粉酶檢測培養(yǎng)基[16]、蛋白酶檢測培養(yǎng)基（LB固體培養(yǎng)基900 mL、7%脫脂牛奶100 mL）、果膠酶檢測培養(yǎng)基[17]和β-1，3-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基（LB固體培養(yǎng)基、1%羧甲基纖維素鈉），28℃培養(yǎng)3～5 d。觀察蛋白酶檢測培養(yǎng)基中菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈，若有，則視為具有產(chǎn)生蛋白酶的能力。用革蘭氏碘溶液淹沒果膠酶檢測培養(yǎng)基和淀粉酶檢測培養(yǎng)基，如菌落周圍可見一個清晰的圈，說明該菌株產(chǎn)生果膠酶和淀粉酶。用0.01%的剛果紅溶液對β-1，3-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基進(jìn)行染色，如可見一個清晰的色圈產(chǎn)生，說明該菌株產(chǎn)生β-1，3-葡聚糖酶。

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒（天根，北京）提取菌株MQ19ST15的基因組DNA，以此為模板，選擇8對引物對常見4種抗菌脂肽物質(zhì)surfactin、fengycin、iturin和bacillomycin的合成調(diào)控基因進(jìn)行擴增，相關(guān)基因及引物序列見表1，引物合成由生工生物工程（上海）有限公司完成。使用25 μL PCR反應(yīng)體系：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件： 95℃預(yù)變性 5 min; 95℃變性 1 min，退火溫度（表1）退火 1 min， 72℃延伸 1 min，35個循環(huán);72℃延伸 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 盆栽防效測定

采用灌根法進(jìn)行盆栽試驗。將病原菌接種至PLB液體培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L，乳糖20 g/L，蒸餾水1 000 mL），于25℃、150 r/min搖床上培養(yǎng)3 d后收集菌液備用;拮抗細(xì)菌接種至50% PDB+50% LB液體培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min搖床上培養(yǎng)24 h后收集菌液（1×108 cfu/mL）備用。將孢子濃度為1×105個/mL的菌液與園藝土壤按質(zhì)量比1∶10混合均勻得到病土，挑選長勢一致的2～3葉期健康甘藍(lán)幼苗用乙醇消毒的刀片進(jìn)行傷根處理并移栽至裝有病土的盆中（直徑10 cm），每盆1株，設(shè)4個處理：1）甘藍(lán)幼苗移栽后用50 mL清水灌根;2）移栽后用50 mL拮抗菌液灌根;3）移栽后用50 mL 10億芽胞/g枯草芽胞桿菌WP 400倍藥液灌根;4）移栽后用50 mL 70%代森錳鋅WP 1 000倍藥液灌根。每處理10株，試驗重復(fù)3次，以清水灌根處理為對照。在移栽當(dāng)天、第7天和第14天分別進(jìn)行3次灌根。移栽后40 d，根據(jù)甘藍(lán)枯萎病病情分級標(biāo)準(zhǔn)[18]記錄病情級別。0級，無癥狀;1級，1片葉葉脈輕微變黃;2級，1～2片葉葉脈輕至中度變黃;3級，除心葉外，其余葉中度變黃或萎蔫;4級，全部葉片重度變黃或萎蔫;5級，葉片完全萎蔫并死亡。計算病情指數(shù)和防治效果。

病情指數(shù)（DI）=∑各級病株數(shù)×相應(yīng)病級調(diào)查總株數(shù)×最高病級×100;

防治效果=對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)對照病情指數(shù)×100%。

1.2.5 菌株的分類鑒定

1.2.5.1 形態(tài)學(xué)特征

將拮抗細(xì)菌劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落顏色、形狀、邊緣、表面、透明度和菌體的形態(tài)特征并進(jìn)行革蘭氏染色。

1.2.5.2 分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒（天根，北京）提取菌株MQ19ST15的基因組DNA，選取細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物27F和1492R，使用25 μL體系（同1.2.3）在PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)條件： 94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán); 72℃延伸10 min。

利用引物UP1和UP2r擴增gyrB基因，使用25 μL體系（同1.2.3）在PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min;94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán);72℃延伸10 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對。使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010和SPSS 21.0軟件對試驗處理組間的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計和單因素方差分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法檢驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離和篩選

從沙土中共分離純化獲得45株細(xì)菌，經(jīng)初篩得到6株具有抑菌效果的菌株，對其進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果（表2，圖1）表明，菌株MQ19ST15的抑菌效果最為穩(wěn)定和突出，抑菌率為54.95%，抑菌帶寬度為5.28 mm，顯著大于其他菌株，因此選擇菌株MQ19ST15作為目標(biāo)菌株進(jìn)行后續(xù)試驗。病原菌受到拮抗菌MQ19ST15抑制后，菌落邊緣明顯停止生長，在光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)抑菌帶邊緣的菌絲出現(xiàn)膨大、變形扭曲及分支增多現(xiàn)象（圖2）。

2.2 菌株MQ19ST15抑菌活性物質(zhì)檢測

將菌株MQ19ST15接種在抑菌活性檢測培養(yǎng)基上，結(jié)果（圖3）顯示，拮抗菌MQ19ST15具有產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、果膠酶及β-1，3-葡聚糖酶的能力。抑菌脂肽活性物質(zhì)的8個基因擴增結(jié)果表明（圖4），除ItuC基因外，其余7個基因片段均可被擴增，說明該菌基因組DNA中具有基因SrfC、SrfA、Sfp、ItuD、fenB、fenC和BamC。

2.3 菌株MQ19ST15對甘藍(lán)枯萎病的防治效果

盆栽試驗結(jié)果（表3，圖5）表明，3種處理對甘藍(lán)枯萎病均有一定的防治效果，其中菌株MQ19ST15菌液（1×108 cfu/mL）的防效為5303%，與70%代森錳鋅WP 1 000倍液的防效無顯著差異，顯著高于10億芽胞/g枯草芽胞桿菌WP的防效28.76%。

2.4 菌株MQ19ST15的分類鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)特征

拮抗菌MQ19ST15在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落呈淡黃色，不透明，邊緣不整齊，表面有褶皺（圖6a），培養(yǎng)96 h后菌落及培養(yǎng)基逐漸變?yōu)樯詈稚?，有色素產(chǎn)生（圖6b）。革蘭氏染色結(jié)果顯示為陽性，菌體為桿狀（圖6c）。

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

以拮抗菌MQ19ST15基因組DNA為模板，使用16S rRNA基因通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴增并測序，得到1 399 bp的序列，將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示，該菌為芽胞桿菌屬細(xì)菌，其與萎縮芽胞桿菌Bacillus atrophaeus 和貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis均具有較高的同源性，序列同源性達(dá)100%，從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7）中可以看出二者處在同一分支上。利用引物UP1和UP2r擴增gyrB基因，測序得到1 175 bp的序列，與萎縮芽胞桿菌的gyrB基因序列同源性達(dá)98%，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8）顯示菌株MQ19ST15與萎縮芽胞桿菌屬于同一分支。因此，依據(jù)16S rRNA基因和gyrB基因序列分析，結(jié)合菌株MQ19ST15的形態(tài)學(xué)特征，將其鑒定為萎縮芽胞桿菌B.atrophaeus。

3 結(jié)論與討論

芽胞桿菌屬是目前應(yīng)用較為廣泛的生防細(xì)菌，大量研究表明其具有許多優(yōu)秀的生防特性，在我國已報道的甘藍(lán)枯萎病生防菌研究中也以芽胞桿菌居多。盧彩鴿等[19]從黑龍江漠河地區(qū)的永久凍土層中分離得到1株對甘藍(lán)枯萎病菌有較強抑制作用的拮抗細(xì)菌，鑒定為解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens。本研究從河西走廊荒漠沙土中篩選出的拮抗細(xì)菌MQ19ST15在平板對峙試驗中對甘藍(lán)枯萎病菌抑制率達(dá)54.95%，能夠顯著抑制病原菌的菌絲生長，使菌絲出現(xiàn)膨大、變形扭曲及分支增多現(xiàn)象。通過形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)合16S rRNA基因和gyrB基因序列分析將其鑒定為萎縮芽胞桿菌Bacillus atrophaeus，在此之前，尚未見關(guān)于萎縮芽胞桿菌防治甘藍(lán)枯萎病的報道。趙爽等[20]從北京郊外的菜田土壤中分離獲得一株具顯著抑菌活性的產(chǎn)芽胞細(xì)菌T99，試驗得出其對甘藍(lán)枯萎病的防治效果優(yōu)于化學(xué)藥劑多菌靈。趙達(dá)等[21]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌B30對甘藍(lán)枯萎病菌具較強的抑菌活性，其發(fā)酵液的施用時期對甘藍(lán)枯萎病的溫室防效影響顯著，發(fā)酵液灌根后3 d再接種病原菌的效果最好，可明顯降低植株發(fā)病率和病情指數(shù)。本試驗篩選出的萎縮芽胞桿菌MQ19ST15的盆栽試驗結(jié)果顯示，該菌株可明顯降低甘藍(lán)枯萎病的病情指數(shù)，其防效可達(dá)53.03%，與70%代森錳鋅WP 1 000倍藥液的防效相當(dāng)，但顯著高于10億芽胞/g枯草芽胞桿菌WP 400倍藥液的防效。

抑菌活性物質(zhì)檢測顯示，菌株MQ19ST15具有產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、β-1，3-葡聚糖酶的能力，其基因組DNA中具有surfactin、iturin、fengycin和bacillomycin 4種抗菌脂肽活性物質(zhì)的合成調(diào)控基因SrfC、SrfA、Sfp、ItuD、fenB、fenC和BamC，說明該菌株可能代謝產(chǎn)生上述4種抗菌脂肽活性物質(zhì)。楊雪等[22]分離的7株萎縮芽胞桿菌均對病原真菌瓜類枯萎病菌和油菜菌核病菌具有較強的拮抗活性，部分菌株可產(chǎn)生脂肽物質(zhì)，具有不同程度的降解纖維素活性和固氮活性。另外，有關(guān)萎縮芽胞桿菌次級代謝產(chǎn)物的研究表明，其分泌的抗菌肽、抗藻類物質(zhì)以及多種小分子物質(zhì)不僅在農(nóng)作物生物防治方面具有重要意義，還在工業(yè)酶生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)、污染治理等眾多領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[23]。在本次試驗中，除抑菌活性外，從盆栽植株大小可見該菌或許可促進(jìn)植株生長，其促生能力有待后續(xù)研究。綜上所述，菌株MQ19ST15具有較好的生防潛能，是一株值得開發(fā)的生防細(xì)菌。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）