于書燕，楊淑青，解志軻，賀明，于少軒，劉青，肖海芳

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255000）

生物體內(nèi)自由基的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦機(jī)體受到有害因素的刺激，體內(nèi)自由基便會(huì)過度累積并造成生物大分子氧化損傷，包括蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化、DNA氧化損傷等，進(jìn)而導(dǎo)致衰老及多種退行性疾病的發(fā)生，如癌癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等[1-3]。因此，抗氧化物質(zhì)對(duì)于清除過多的自由基及抑制氧化損傷進(jìn)而維持人體健康方面發(fā)揮著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)合成抗氧化劑可以有效治療多種疾病，但一些合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）和二丁基羥基甲苯（butyl hydroxytoluence，BHT）等則會(huì)損害人體肝臟功能并誘發(fā)癌癥。因此，植物提取物作為良好的抗氧化劑來源已被廣泛應(yīng)用[4-5]。大量研究表明，攝入天然抗氧化物質(zhì)可以減少機(jī)體的氧化損傷程度，并降低多種疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)[6-9]。多糖在自然界中分布廣泛，是人體所需基本物質(zhì)之一。近年來，植物多糖的抗氧化活性受到了各科學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注。

前期試驗(yàn)結(jié)果表明，核桃葉多糖具有清除自由基的能力且對(duì)蛋白質(zhì)氧化損傷具有顯著的保護(hù)作用[10-11]。本研究進(jìn)一步探討了核桃葉多糖對(duì)Cu2+/H2O2、2，2′-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽[2，2′-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH]和亞鐵離子（ferrous ion，F(xiàn)e2+）誘導(dǎo)的脂質(zhì)、DNA氧化損傷的影響，旨在從生物大分子角度系統(tǒng)闡明核桃葉多糖的抗氧化活性。為進(jìn)一步揭示核桃葉多糖的抗氧化活性提供了數(shù)據(jù)支持，同時(shí)為核桃葉多糖應(yīng)用于食品、化妝品和藥品行業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃葉多糖：山東理工大學(xué)考林微生物脂質(zhì)實(shí)驗(yàn)室自制；健康SD大鼠：山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

AAPH、2-硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituricacid，TBA）：上海麥克林生化科技有限公司；大豆卵磷脂、亞油酸（linoleic acid，LA）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；pBR322DNA：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS28恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；UV-2600紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；LE303E千分之一天平：美國(guó)METTLER-TOLEDO公司；AD500SH勻漿機(jī)：上海昂尼儀器儀表有限公司；5810R高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；GelDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；DYCP-32C核酸電泳槽：北京六一生物科技有限公司；Milli-Q生化分析型超純水機(jī)：美國(guó)Millipore公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠組織勻漿的制備

在試驗(yàn)過程中對(duì)SD大鼠的處理符合動(dòng)物管理方法的相關(guān)章程。取出處死后SD大鼠體內(nèi)的腦組織和肝臟組織，用預(yù)冷過的生理鹽水將血漬洗凈，吸去殘留水分后取1.0 g腦或肝臟組織并剪碎，然后加入9 mL預(yù)冷過的生理鹽水，在冰水浴中勻漿10 min。在4℃，4 000 r/min的條件下離心10 min，取上清液，即得10%的組織勻漿[12]。

1.3.2 核桃葉多糖對(duì)脂質(zhì)氧化損傷的保護(hù)作用

1.3.2.1 核桃葉多糖對(duì)烷氧自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)氧化損傷的影響

取一定體積的組織勻漿（肝臟組織或腦組織）和終濃度為10、20、30、40 mg/mL核桃葉多糖溶液置于多支2 mL離心管中，混勻，37℃水浴30 min。然后加入終濃度為50 mmol/L在37℃預(yù)熱過的AAPH溶液，空白組以相同體積的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）代替AAPH，誘導(dǎo)組以相同體積的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）代替核桃葉多糖溶液?；靹蚝蠓旁?7℃水浴中繼續(xù)處理4 h測(cè)定肝勻漿和腦勻漿中脂質(zhì)氧化損傷程度。

1.3.2.2 核桃葉多糖對(duì)羥基自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)氧化損傷的影響

組織勻漿與核桃葉多糖的處理方式同1.3.2.1中所述。向試驗(yàn)組加入終濃度為25 mmol/L和0.1 mmol/L的H2O2和CuSO4溶液，空白組以相同體積的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）代替H2O2和CuSO4，誘導(dǎo)組以相同體積的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）代替核桃葉多糖溶液?；旌暇鶆蚝?7℃繼續(xù)水浴90 min，測(cè)定肝勻漿和腦勻漿中脂質(zhì)氧化損傷程度。

1.3.2.3 核桃葉多糖對(duì)Fe2+誘導(dǎo)卵磷脂氧化損傷的影響

參照黃曉昆等[13]的方法并略加修改。將卵磷脂溶于0.05 mol/L pH7.4磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中制備脂質(zhì)體，分別加入不同質(zhì)量濃度的核桃葉多糖（樣品溶液終濃度分別為10、20、30、40、50 mg/mL），混勻后于37℃孵育10 min，然后加入終濃度為0.8 mmol/L的FeSO4溶液，37℃繼續(xù)水浴40 min后檢測(cè)卵磷脂氧化損傷程度。

1.3.2.4 核桃葉多糖對(duì)Fe2+誘導(dǎo)亞油酸氧化損傷的影響

以Fe2+/VC為誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)LA氧化損傷。在LA中加入不同濃度的核桃葉多糖（樣品溶液終濃度分別為 10、20、30、40、50 mg/mL），混勻后加入終濃度為50 μmol/L和 1 mmol/L的 FeSO4和 VC溶液，37℃避光水浴24 h后檢測(cè)亞油酸氧化損傷程度。

1.3.2.5 脂質(zhì)過氧化程度測(cè)定

采用TBA反應(yīng)法檢測(cè)脂質(zhì)體氧化損傷的程度[14]。取上述處理后的脂質(zhì)反應(yīng)體系200 μL，分別加入20%TCA 800 μL 和 0.8%TBA 800 μL，混勻，置于沸水浴中加熱30 min。冷卻后離心10 min（6 000 r/min），取上清液在532 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度。脂質(zhì)過氧化程度計(jì)算公式如下。

式中：A為試驗(yàn)組的吸光度；A0為誘導(dǎo)組的吸光度。

1.3.3 核桃葉多糖對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用

1.3.3.1 核桃葉多糖對(duì)烷氧自由基誘導(dǎo)DNA氧化損傷的影響

試驗(yàn)以pBR322DNA為模型考察核桃葉多糖對(duì)自由基誘導(dǎo)的氧化損傷的抑制效果。將1 μL pBR322DNA加入微量離心管中，試驗(yàn)組中加入不同濃度的核桃葉多糖，混勻，37℃水浴30 min。然后試驗(yàn)組加37℃水浴2 min后的AAPH，對(duì)照組以相同體積的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）代替AAPH?；靹蚝蠓旁?7℃水浴中繼續(xù)處理，4 h后測(cè)定DNA氧化損傷程度。

1.3.3.2 核桃葉多糖對(duì)羥基自由基誘導(dǎo)DNA氧化損傷的影響

核桃葉多糖與pBR322DNA的孵育處理方式同1.3.3.1中所述。向試驗(yàn)組加入終濃度為25 mmol/L和0.1 mmol/L的H2O2和CuSO4溶液，對(duì)照組以相同體積的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）代替H2O2和CuSO4?；旌暇鶆蚝?7℃繼續(xù)水浴90 min，測(cè)定DNA氧化損傷程度。

1.3.3.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳

利用瓊脂糖凝膠電泳考察pBR322DNA氧化損傷程度[15]。取0.2 g瓊脂糖溶于20 mL TAE緩沖液，放在微波爐中加熱處理1 min，冷卻后加入2 μL溴化乙錠，混勻，倒膠，待其凝固后拔掉梳子。處理后的DNA反應(yīng)體系中加入上樣緩沖液，混勻后每孔加入等量的反應(yīng)液，調(diào)整電泳電壓為120 V，時(shí)間為30 min。凝膠電泳結(jié)束后在GelDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)下成像，并采用Image J軟件分析所成圖像的條帶灰度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2016處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行One-Way ANOVA分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃葉多糖對(duì)脂質(zhì)氧化損傷的保護(hù)作用

2.1.1 核桃葉多糖對(duì)SD大鼠腦勻漿中脂質(zhì)（rat brain lipid，RBL）氧化損傷的保護(hù)作用

肝臟是機(jī)體重要的代謝器官，極易受到自由基的攻擊產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，所以肝勻漿常被作為脂質(zhì)模型來考察植物活性物質(zhì)的抗氧化能力[16-17]。圖1、圖2分別為核桃葉多糖對(duì)烷氧自由基與羥自由基誘導(dǎo)的RBL氧化損傷的抑制效果。

圖1 核桃葉多糖對(duì)烷氧自由基誘導(dǎo)RBL氧化損傷的保護(hù)作用Fig.1 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on alcoxyl radical-induced lipid oxidative damage in RBL

圖2 核桃葉多糖對(duì)羥自由基誘導(dǎo)RBL氧化損傷的保護(hù)作用Fig.2 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on hydroxyl radical-induced lipid oxidative damage in RBL

從圖1、圖2中可以看出，與空白對(duì)照組相比，Cu2＋/H2O2與AAPH誘導(dǎo)組脂質(zhì)過氧化水平明顯升高；經(jīng)10 mg/mL～40 mg/mL核桃葉多糖處理之后，相對(duì)于誘導(dǎo)組，RBL氧化損傷程度極顯著降低（P＜0.01），且呈濃度依賴關(guān)系。上述結(jié)果說明，核桃葉多糖抑制了烷氧自由基與羥基自由基誘導(dǎo)RBL氧化損傷。

2.1.2 核桃葉多糖對(duì)SD大鼠肝勻漿中脂質(zhì)（rat liver lipid，RLL）氧化損傷的保護(hù)作用

核桃葉多糖對(duì)AAPH與Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)體系中RLL過氧化水平的影響見圖3、圖4。

圖3 核桃葉多糖對(duì)烷氧自由基誘導(dǎo)RLL氧化損傷的保護(hù)作用Fig.3 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on alcoxyl radical-induced lipid oxidative damage in RLL

圖4 核桃葉多糖對(duì)羥自由基誘導(dǎo)RLL氧化損傷的保護(hù)作用Fig.4 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on hydroxyl radical-induced lipid oxidative damage in RLL

從圖3、圖4中可以看出，與空白組相比，Cu2＋/H2O2與AAPH誘導(dǎo)組脂質(zhì)過氧化水平明顯升高；經(jīng)10mg/mL～40 mg/mL的核桃葉多糖預(yù)先孵育處理后，羥自由基與烷氧自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化水平明顯下降，且多糖濃度越高保護(hù)效果越好（P＜0.01）。上述結(jié)果說明，核桃葉多糖對(duì)烷氧自由基與羥基自由基引發(fā)的RLL氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用。

2.1.3 核桃葉多糖對(duì)Fe2＋誘導(dǎo)卵磷脂氧化損傷的保護(hù)作用

卵磷脂中的多不飽和脂肪酸在金屬離子催化下發(fā)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致組織損傷[18]。核桃葉多糖對(duì)羥基自由基誘導(dǎo)的大豆卵磷脂氧化損傷的抑制如圖5所示。

圖5 核桃葉多糖對(duì)Fe2+誘導(dǎo)卵磷脂脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用Fig.5 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on Fe2+-induced lecithin liposomes peroxidation

由圖5可知，與Fe2＋誘導(dǎo)組相比，空白組脂質(zhì)體過氧化水平較低。核桃葉多糖在10 mg/mL～50 mg/mL的濃度范圍內(nèi)均對(duì)脂質(zhì)過氧化表現(xiàn)出較強(qiáng)的濃度依賴性的抑制作用（P＜0.01）。當(dāng)濃度達(dá)到50 mg/mL時(shí)，由Fe2＋引起的卵磷脂過氧化程度降低到30.85%。由此可知，核桃葉多糖可明顯阻止因羥基自由基引發(fā)的卵磷脂過氧化程度。

2.1.4 核桃葉多糖對(duì)Fe2＋誘導(dǎo)亞油酸氧化損傷的保護(hù)作用

機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化[19]。核桃葉多糖對(duì)Fe2＋誘導(dǎo)的亞油酸脂氧化損傷的抑制如圖6所示。

圖6 核桃葉多糖對(duì)Fe2+誘導(dǎo)亞油酸脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用Fig.6 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on Fe2+-induced linoleic acid liposomes peroxidation

由圖6可知，10 mg/mL的核桃葉多糖對(duì)羥基自由基誘導(dǎo)的亞油酸氧化損傷無(wú)明顯抑制效果，而經(jīng)20mg/mL～50 mg/mL的核桃葉多糖處理后，氧化降解程度明顯降低（P＜0.01）。上述結(jié)果說明，核桃葉多糖在一定濃度范圍內(nèi)抑制了Fe2＋誘導(dǎo)的亞油酸過氧化水平。

2.2 核桃葉多糖對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用

過多的自由基也會(huì)導(dǎo)致包括DNA鏈斷裂、DNA堿基修飾、DNA位點(diǎn)突變、DNA雙鏈畸變等形式的DNA氧化損傷[20]。圖7為核桃葉多糖對(duì)烷氧自由基誘導(dǎo)pBR322DNA氧化損傷的影響。

圖7 核桃葉多糖對(duì)烷氧自由基誘導(dǎo)DNA氧化損傷的保護(hù)作用Fig.7 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on alcoxyl radical-induced DNA oxidative damage

從圖7中可以看出，空白組pBR322DNA的存在形式為超螺旋結(jié)構(gòu)，AAPH誘導(dǎo)組DNA幾乎全部轉(zhuǎn)變成了開環(huán)結(jié)構(gòu)，說明烷氧自由基誘使pBR322DNA發(fā)生了氧化損傷，破壞了其超螺旋結(jié)構(gòu)。0.3mg/mL～0.5mg/mL的核桃葉多糖均可抑制這種轉(zhuǎn)變，且隨著濃度增加，超螺旋結(jié)構(gòu)的pBR322DNA明顯增多。上述結(jié)果表明，核桃葉多糖對(duì)烷氧自由基誘導(dǎo)的DNA氧化損傷具有顯著的保護(hù)作用。

核桃葉多糖對(duì)羥基自由基誘導(dǎo)pBR322DNA氧化損傷的影響如圖8所示。

由圖8可知，羥基自由基可明顯破壞pBR322DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)（P＜0.01）。經(jīng)0.10 mg/mL～0.20 mg/mL的核桃葉多糖孵育處理之后，超螺旋結(jié)構(gòu)的pBR322DNA比例顯著增加（P＜0.01），開環(huán)結(jié)構(gòu)減少。由此可知，核桃葉多糖能夠保護(hù)pBR322DNA不被羥基自由基氧化降解。

圖8 核桃葉多糖對(duì)羥自由基誘導(dǎo)DNA氧化損傷的保護(hù)作用Fig.8 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on hydroxyl radical-induced DNA oxidative damage

3 結(jié)論

本研究利用Cu2＋/H2O2和AAPH兩種不同的自由基誘導(dǎo)體系，探討核桃葉多糖對(duì)大鼠肝勻漿和腦勻漿、卵磷脂、亞油酸及DNA氧化損傷的影響。結(jié)果表明，核桃葉多糖在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)羥基自由基以及烷氧自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)和DNA氧化損傷具有顯著的抑制作用，且呈濃度依賴性。該研究從生物大分子角度評(píng)價(jià)了核桃葉多糖的抗氧化活性，并為農(nóng)業(yè)廢棄核桃葉的綜合利用提供了思路。