郭亞楠，郭紅云，王 濤，張永東，郭文靜，蔣 兵，蘇海翔

(1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

肺癌的病死率居癌癥死因的首位[1]，因其早期臨床癥狀不明顯，因此多數(shù)肺癌患者臨床確診時已到中晚期，從而失去了手術(shù)治療機會?；熓侵委煼伟┑闹饕煼ㄖ籟2]，臨床上肺癌的化療以鉑類藥物為主，鉑類中DDP是有效并廣泛應(yīng)用的一線用藥，但是DDP治療一段時間后，耐藥性的出現(xiàn)往往導(dǎo)致藥物失效和預(yù)后不良，尤其是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)較容易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性[3]，因此，尋找高效安全的多藥耐藥(multiple drug resistance，MDR)逆轉(zhuǎn)劑是目前臨床肺癌治療的迫切需要。

異黃腐酚(isoxanthohunol，IN)作為一種異戊二烯基黃酮類物質(zhì)[4]，其主要存在于中藥蛇麻花(humuluslupulus俗稱：啤酒花)中，分子式C21H22O5，分子量354.4，其主要是黃腐酚(xanthohumol，XN)加熱過程產(chǎn)生的一種同分異構(gòu)體。在啤酒釀造的麥汁煮沸過程中，大部分XN被異構(gòu)化為IN，因此啤酒中IN含量遠高于XN[5]。體外實驗研究報道，IN具有抗腫瘤[6]、抗炎[7]以及參與脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)[8]等多種生物學(xué)功能。在國內(nèi)外的食品、保健品、藥品中受到廣泛的關(guān)注。但目前關(guān)于IN聯(lián)合DDP對人肺癌耐順鉑細胞株A549/DDP的作用及相關(guān)機制仍未有報道。本實驗旨在觀察IN聯(lián)合DDP對A549/DDP細胞的增敏作用以及細胞周期、凋亡的影響，并探討其分子機制，為中醫(yī)藥治療NSCLC提供新的實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細胞株人肺癌順鉑耐藥株A549/DDP購自上海富衡生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑異黃腐酚，玉門拓璞科技開發(fā)有限責(zé)任公司；順鉑規(guī)格:100 mg，批號:SC8452，齊魯制藥有限公司；DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；10%胎牛血清，美國BI公司；100×青鏈霉素混合液規(guī)格:100 mL、CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京SoIarbio公司；細胞凋亡檢測試劑盒，美國BD公司；羊抗兔P-gp、LRP、MRP、PI3K、p-AKt、GAPDH，美國Proteintech公司；化學(xué)發(fā)光顯色液，美國Millipore公司。

1.3 儀器流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)；凝膠成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(德國BINDER公司)；培養(yǎng)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；臺式低速離心機(上海精宏有限公司)；雙人單面超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化有限公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)人肺癌A549/DDP細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)液中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了保持A569/DDP細胞的DDP耐藥性，每次換液時在細胞培養(yǎng)液中均添加DDP(最終濃度為1 mg·L-1)。為了減少DDP對實驗的干擾，在實驗前更換成不加DDP的培養(yǎng)液。

2.2 A549/DDP細胞活性檢測當(dāng)A549/DDP細胞達到對數(shù)生長期時，將細胞以8×103個/孔接種于96孔板。待細胞貼壁后，加入不同濃度的IN、DDP，每組6個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm波長處的吸光度值(A)，計算各組細胞生長抑制率/%=1-(藥物組A值/空白組A值)×100%。

2.3 藥物協(xié)同作用Isobologram分析依據(jù)CCK-8的實驗結(jié)果，得出不同濃度IN、DDP對A549/DDP細胞的IC50濃度，分別設(shè)為a和b，位于橫坐標(biāo)軸和縱坐標(biāo)軸上，連接a、b兩點的直線為相加線。同時根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果，求得不同濃度20 μmol·L-1IN與不同濃度DDP聯(lián)用時的IC50濃度c，若d (20，c)點在a b連線上，則表示兩藥聯(lián)用為相加作用，在該連線以下，表示兩藥聯(lián)用為協(xié)同作用；在該連線以上，表示兩藥聯(lián)用為拮抗作用[9-10]。

2.4 細胞凋亡檢測當(dāng)A549/DDP細胞達到對數(shù)生長期時，將細胞以1×106個/孔接種于6孔板。待細胞貼壁后，分別加入IN組、DDP組和IN與DDP聯(lián)合用藥組，培養(yǎng)48 h后，加入1 mL的胰酶消化后收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗2次，根據(jù)試劑盒說明書操作，加入500 μL Binding buffer，5 μL Annexin V-FITC和PI溶液，避光反應(yīng)20 min，濾膜過濾至流式管中用流式細胞儀檢測。

2.5 細胞周期檢測當(dāng)A549/DDP細胞達到對數(shù)生長期時，將細胞以1×106個/孔接種于6孔板。待細胞貼壁后，按照2.4上述各組藥物配置，分別加入到6孔板中，培養(yǎng)48 h后，收集細胞，用PBS洗滌2次，離心，每組樣品用100 μL預(yù)冷的PBS重懸，然后再加入300 μL預(yù)冷的乙醇，輕輕混勻以后，放入-20 ℃冰箱過夜，次日，取出固定的細胞，棄上清，并用預(yù)冷的PBS清洗3次，然后按照細胞周期試劑盒說明書操作，加入500 μL的PI-RNase染液混勻，室溫避光孵育20 min，濾膜過濾至流式管中用流式細胞儀檢測。

2.6 細胞內(nèi)相關(guān)蛋白變化檢測細胞培養(yǎng)和分組處理同2.4。培養(yǎng)48 h后，收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞，每孔加入細胞裂解液，12 000 r·min-1離心20 min，用蛋白定量試劑盒定量，隨后加入5×蛋白上樣緩沖液置于90 ℃水浴鍋中煮沸10 min。15%的聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，將PVDF膜封閉于5%的脫脂奶粉中，且在室溫條件下封閉2 h后依次加入一抗(稀釋比1 ∶1 000)，4℃孵育過夜后，用TBST洗膜3次，每次5 min；二抗封閉(稀釋比1 ∶10 000)，室溫下孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，滴加ECL發(fā)光試劑于凝膠成像系統(tǒng)曝光。

3 結(jié)果

3.1 IN與DDP聯(lián)用協(xié)同抑制A549/DDP細胞生長CCK-8實驗結(jié)果見Fig1所示，IN濃度≤20 μmol·L-1時，作用于人肺癌耐順鉑細胞株A549/DDP細胞48 h后，細胞增殖率在90%以上，當(dāng)濃度增加至30～80 μmol·L-1時，IN以濃度依賴性明顯抑制A549/DDP細胞活性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，IC50值為42.1 μmol·L-1。見Fig2結(jié)果所示，選擇無明顯細胞毒性的20 μmol·L-1IN與不同濃度的DDP聯(lián)合給藥48 h后，DDP對A549/DDP細胞的IC50從22.46 mg·L-1降為6.20 mg·L-1，并且發(fā)現(xiàn)與單獨使用DDP組比較，≥6 mg·L-1DDP與20 μmol·L-1IN聯(lián)用后，A549/DDP細胞的增殖率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時，通過Isobologram分析見(Fig3)，6 mg·L-1DDP與20 μmol·L-1IN聯(lián)用對A549/DDP細胞的IC50坐標(biāo)d (20，6.2)落在a (DDP IC50)和b (IN IC50)相加線左下方，再次證明了6 mg·L-1DDP與20 μmol·L-1IN聯(lián)用對A549/DDP細胞可以產(chǎn)生協(xié)同作用。因此選擇低濃度、低毒性的6 mg·L-1DDP與20 μmol·L-1IN聯(lián)用進行后續(xù)實驗研究。

Fig 1 Effect of combination of IN and DDP on proliferation of A549/DDP cells

Fig 2 Effect of DDP alone or in combination with IN on proliferation of A549/DDP cells

Fig 3 Synergism effect between IN and DDP analyzed with Isobolograma (42.1,0)and b (0,22.46)are the IC50 coordinates of IN and DDP to A549/DDP cells,respectively,d (20,6.20)are the IC50 coordinates of A549/DDP cells when 20 μmol·L-1 IN is combined with DDP.

3.2 IN與DDP聯(lián)用誘導(dǎo)A549/DDP細胞凋亡空白組、DDP、IN和IN+DDP組作用A549/DDP細胞48 h后，各組細胞凋亡率分別為(12.29±0.78)%、(14.26±0.25)%、(17.92±0.65)%和(26.73±0.62)%，與空白組、IN組和DDP組比較，聯(lián)合用藥組細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見Fig4。

Fig 4 Effect of IN and combined DDP treatment on A549/DDP cell apoptosis**P<0.01 vs the blank group;##P<0.01 vs the other three groups.

3.3 IN與DDP聯(lián)用阻滯A549/DDP細胞周期空白組、DDP、IN和IN+DDP組作用A549/DDP細胞48 h后，各組細胞中的G0/G1期DNA含量百分比平均值分別為28.20%、39.06%、59.25%和75.22%。與空白組、IN組和DDP組比較，聯(lián)合用藥組作用A549/DDP細胞后，G0/G1期細胞比例明顯升高，細胞分裂周期停滯在G0/G1期的能力更強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見Fig5。

Fig 5 Cycle analysis of A549/DDP cells treated with IN combined with DDP

3.4 IN與DDP聯(lián)用降低A549/DDP細胞中P-gp、LRP、MRP、PI3K和p-AKt蛋白表達水平空白組、DDP、IN和IN+DDP組作用A549/DDP細胞48 h后，與空白組、IN組和DDP組比較，聯(lián)合用藥組作用細胞中的P-gp、LRP、MRP蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見Fig6。同時，與空白組、IN組、DDP組3組比較，聯(lián)合用藥組對A549/DDP細胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白PI3K和p-AKt相對表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見Fig7。

Fig 6 Effect of IN combined with DDP on expression of drug resistance-related proteins in A549/DDP cells**P<0.01 vs the blank group;##P<0.01 vs the other three groups.

Fig 7 Effect of IN combined DDP on expression levels of PI3K and p-AKt in A549/DDP cells##P<0.01 vs with the other three groups.

4 討論

DDP是治療肺癌的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物，但目前化療耐藥已成為提高肺癌患者整體生存率的關(guān)鍵制約因素之一[11]。臨床上肺癌患者尤其是NSCLC較容易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，對患者的預(yù)后造成極大的不良影響，因此，克服DDP耐藥或者增加其對癌細胞的敏感性對于治療NSCLC具有重要的意義。IN作為一種異戊二烯基黃酮類物質(zhì)，因其有抗氧化、抑制癌細胞增殖、抗菌及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。相關(guān)研究表明黃酮類物質(zhì)與DDP聯(lián)合給藥可以減少DDP引起的毒副反應(yīng)，增加DDP敏感性[12]。在本研究中，我們研究了IN與DDP聯(lián)用對人肺癌耐DDP細胞株A549/DDP的協(xié)同作用，并探討了其可能的相關(guān)機制。

首先，通過CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)IN呈濃度依賴性明顯抑制A549/DDP細胞生長。IN和DDP單獨使用在低濃度時對A549/DDP細胞增殖無明顯抑制作用，但兩藥聯(lián)合應(yīng)用后則明顯抑制A549/DDP細胞增殖，并通過Isobologram得出結(jié)果，發(fā)現(xiàn)低濃度的IN與DDP聯(lián)用具有協(xié)同作用。通過流式細胞儀實驗檢測IN與DDP兩藥聯(lián)用對A549/DDP細胞凋亡的作用，實驗結(jié)果表明IN與DDP兩藥聯(lián)用后促進A549/DDP細胞凋亡的能力更強，阻滯A549/DDP細胞G0/G1期的能力更明顯。

腫瘤的多藥耐藥是多基因多途徑多系統(tǒng)廣泛參與的復(fù)雜過程，機制至今尚未完全清楚，目前常見的主要包括P-gp、MRP和LRP等，LRP、MRP、P-gp介導(dǎo)的藥物外排機制已經(jīng)被認為是最經(jīng)典以及耐藥效應(yīng)最明確的腫瘤MDR機制。LRP、MRP、P-gp蛋白是一種依賴ATP供能、具有藥物外排功能的跨膜糖蛋白，是研究的最早也是最深入的耐藥相關(guān)蛋白。LRP、MRP和P-gp作為一種具有外排作用的轉(zhuǎn)運體，降低了細胞內(nèi)化療藥物的濃度和使藥物遠離鞭點等方式影響腫瘤的凋亡而逆轉(zhuǎn)MDR[13]，相關(guān)研究表明，LRP、MRP、P-gp在肺癌耐藥中表達率很高，LRP、MRP、P-gp的高表達是肺癌多藥耐藥發(fā)生的主要機制[14]。研究表明，黃酮類化合物藤黃酸和DDP共同處理A549/DDP細胞后，可明顯下調(diào)細胞P-gp蛋白的表達，從而表明藤黃酸和DDP聯(lián)用發(fā)揮協(xié)同作用抑制P-gp的表達可使A549/DDP細胞對DDP的敏感增加[15]。本研究結(jié)果表明，IN和DDP聯(lián)用較空白組和單獨用藥組明顯降低LRP、MRP、P-gp蛋白表達水平，提示聯(lián)用可協(xié)同抑制人肺腺癌耐DDP細胞株A549/DDP的生長。

PI3K/Akt信號通路是細胞生存重要通路之一，PI3K/AKT通道的激活是腫瘤細胞對化療藥物如DDP、紫杉醇等產(chǎn)生耐藥的關(guān)鍵因素，在腫瘤MDR方面，很多研究都證實PI3K/AKT信號參與MDR的形成[16]。肺癌的多種生長因子主要通過PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮作用，腫瘤細胞經(jīng)化療藥物作用后增加了AKT磷酸化水平，并激活PI3K/AKT信號通路，活化的AKT進一步激活其下游因子使癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究表明，黃酮類化合物水飛薊素與阿霉素聯(lián)合給藥可以增加耐藥乳腺癌細胞MDA-MB-435和MCF-7細胞對阿霉素的敏感性，其機制可能與水飛薊素和DDP聯(lián)用發(fā)揮協(xié)同作用抑制PI3K、AKT和ERK等致癌信號通路分子有關(guān)[17]。本研究結(jié)果表明，IN和DDP聯(lián)用較空白組和單獨用藥組明顯降低PI3K和p-AKt蛋白表達水平，提示兩藥聯(lián)用后可協(xié)同抑制PI3K/AKt信號通路的活性，從而增強DDP對耐藥細胞的作用。

綜上所述，IN與DDP聯(lián)合用藥可起到協(xié)同作用阻滯細胞于G0/G1期，促進細胞凋亡，抑制A549/DDP細胞增殖的作用，其可能的機制是通過抑制耐藥蛋白LRP、MRP、P-gp蛋白表達以及抑制PI3K/AKt信號通路的活性，增強DDP對耐藥細胞的作用，進而與DDP對A549/DDP細胞產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，這為IN在未來具有作為治療NSCLC的輔助藥物或者DDP的化療增敏劑的潛力提供了科學(xué)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。