劉劍剛，熊 雙，豐加濤，董國菊，史大卓，梁鑫淼

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院心血管病中心，國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中國中醫(yī)科學(xué)院心血管病研究所，北京 100091；2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

“冠心Ⅱ號”是現(xiàn)代活血化瘀中藥治療冠心病心絞痛的代表方藥。二十世紀(jì)七十年代，通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院等在京六家醫(yī)院成立的北京地區(qū)防治冠心病協(xié)作組的臨床研究，表明其治療心絞痛癥狀緩解的有效率為88.10%[1]，為后期血瘀證與活血化瘀研究在全國范圍廣泛開展奠定了中西醫(yī)結(jié)合的基礎(chǔ)。目前，心血管病的介入治療技術(shù)快速發(fā)展，但對于穩(wěn)定性冠心病的患者選擇藥物治療還是介入治療，直到目前尚未有一致的結(jié)論，因此藥物的早期治療顯得尤為重要[2]。

方藥(方劑)是連接中醫(yī)與中藥的橋梁，探索方劑的現(xiàn)代化研究，開展藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制的系統(tǒng)研究，其技術(shù)關(guān)鍵是中藥化學(xué)層次的配伍配比、生物活性及其間的關(guān)系辨識[3]。課題組對冠心Ⅱ號方進(jìn)行二次開發(fā)，通過對其組方進(jìn)行新的分離、提取、純化，使其化學(xué)成分明確，且生藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有效成分芍藥苷和丹酚酸B的含量和國家藥典(2015版)規(guī)定的成分含量檢測比較有了較大的提高[4]。本研究通過舌下靜注垂體后葉素建立大鼠急性心肌缺血模型，觀察現(xiàn)代工藝提取精制和純化后的冠心Ⅱ號方對預(yù)處理(給藥)心肌缺血模型大鼠的干預(yù)作用，并通過藥效指標(biāo)以及多靶點(diǎn)的效應(yīng)對比研究，確定二次開發(fā)的冠心Ⅱ號藥效組分特征成分和藥理作用的關(guān)系，為進(jìn)一步冠心Ⅱ號新劑型的二次研發(fā)提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物60只，Wistar大鼠，SPF級，體質(zhì)量(180-200)g，♀♂各半，動(dòng)物質(zhì)量合格證號：1100111911065302/3，許可證號:SCXK(京)2016-0006，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室飼養(yǎng)，12 h光照，12 h黑暗，動(dòng)物自由攝水，全價(jià)飼料喂食，適用性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑冠心Ⅱ號精制方(Refined Guanxin Ⅱ，RGX Ⅱ )，制備樣品干粉相當(dāng)于3.31 g生藥·g-1；冠心Ⅱ號純化方(Optimized Guanxin Ⅱ，OGX Ⅱ )，制備樣品干粉相當(dāng)于16.74 g生藥·g-1，由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供。冠心Ⅱ號原方制劑，復(fù)方川丹顆粒(Chuandan granules，CHDG)，1.44 g生藥·g-1，批準(zhǔn)文號：京藥制字Z20163025，由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院中藥制劑室提供，尼可地爾(nicorandil)片，商品名為欣地平，5 mg/片，批號：1906031，由西安漢豐藥業(yè)有限公司提供。

垂體后葉素(pituitrin，Pit)注射液，1mg(6 IU)·ml-1，批號：190423，由安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司提供；戊巴比妥鈉，佛山市化工實(shí)驗(yàn)廠(進(jìn)口分裝)提供，批號：CC860907；色譜柱，Tnature C18(4.6×250 mm，5 m)，由大連思譜精工有限公司提供，乙腈(分析純)，異丙醇(分析純)，甲醇(分析純)由國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司提供。

肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)試劑盒為中生北控生物科技股份有限公司提供，批號：20191130，心肌鈣蛋白(CTNT)ELSIA試劑盒，批號：20191208，內(nèi)皮素(ET-1)ELSIA試劑盒，批號：20191210，一氧化氮(NO)試劑盒，批號：20191210，由北京華英生物技術(shù)研究所提供。超氧化物歧化酶(SOD)活性試劑盒，批號：20191125，丙二醛(MDA)試劑盒，批號：20191128，過氧化氫酶(CAT)試劑盒，批號：20191108，總抗氧化物(T-AOC)試劑盒，批號：20191108，Ca2+,Mg2+-ATP酶活性試劑盒，批號：20191130，Na+,K+-ATP酶活性試劑盒，批號：20191130，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 儀器DR-200BS型，全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀，無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司生產(chǎn)；7160型，全自動(dòng)生化儀，日本HITACHI公司生產(chǎn)；CARDIPIA 800B型，心電圖儀，秦皇島市康泰醫(yī)學(xué)系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)；S6000型，高效液相色譜儀，華譜科儀(北京)科技有限公司生產(chǎn)。

1.4 藥物提取方法冠心Ⅱ號方由丹參、川芎、赤芍、紅花和降香(3 ∶1.5 ∶1.5 ∶1.5 ∶1)組成，按照處方飲片比例稱取藥材提取精濾，去除固體雜質(zhì)。精制制備樣品干粉相當(dāng)于3.31 g生藥·g-1。純化制備樣品干粉相當(dāng)于16.74 g生藥·g-1[5]。

1.5 3種藥物樣品的制備及有效成分的含量測定色譜柱，Tnature C18(4.6×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相，A：乙腈，B：水；C：2% H3PO4/水，D：40%異丙醇/甲醇，流速，1.5 mL·min-1，提取波長，254 nm，柱溫，40 ℃，進(jìn)樣量，20 μL。

復(fù)方川丹顆粒、冠心Ⅱ號精制方，冠心Ⅱ號純化方分別制備樣品：川丹顆粒提取液、精制過濾液、純化洗脫液。制備能夠較大程度上保留指標(biāo)性成分，川丹顆粒、精制冠心Ⅱ號、純化冠心Ⅱ號的丹酚酸B外標(biāo)含量分別為0.767%、4.247%、32.76%，芍藥苷外標(biāo)含量分別為0.418%、1.546%、12.15%。3種冠心Ⅱ號方制劑的指紋圖譜基本一致，見Fig1。

Fig 1 Fingerprint of three kinds preparation of Guanxin ⅡA:fingerprint of CHDG；B:fingerprint of RGX Ⅱ；C:fingerprint of OGX Ⅱ

1.6 模型制作與分組大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組(normal saline，NS)、模型組、陽性對照藥組(尼可地爾片，Nicorandil，2.70 mg·kg-1)、復(fù)方川丹顆粒組(3.19 g·kg-1，相當(dāng)于生藥4.60 g·kg-1)、冠心Ⅱ號精制方組(1.39 g·kg-1，相當(dāng)于生藥4.60 g·kg-1)、冠心Ⅱ號純化方組(0.27 g·kg-1，相當(dāng)于生藥4.60 g·kg-1)組，每組10只。各組連續(xù)灌胃等體積藥液，給藥7 d，生理鹽水組，模型組灌胃等體積純凈水，于末次給藥后40 min后，大鼠腹腔注射2% 戊巴比妥鈉水溶液(0.2 mL·100 g-1)麻醉，仰位固定于鼠板上，舌下靜脈注射pit造模。

急性心肌缺血模型制作方法，大鼠舌下靜脈注射pit 0.75 IU·kg-1體質(zhì)量，恒速緩慢(10 s)注射完畢。大鼠注射pit后心電圖的變化一般可分為2期。大鼠的肢體導(dǎo)聯(lián)與胸導(dǎo)聯(lián)相似，均無明顯的ST段[6],首先，注射后即刻至30 s，T波升高，J點(diǎn)偏移、抬高(>0.1 mV)，而J點(diǎn)偏移和抬高(超過0.1 mV),大多數(shù)出現(xiàn)在10 s左右，此時(shí)心電圖的變化最為明顯。因此，J點(diǎn)是否偏移是判斷大鼠心肌缺血的關(guān)鍵標(biāo)記，假手術(shù)組注射等體積的生理鹽水注射液。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程符合《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》和國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的要求。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1大鼠心電圖 麻醉后，固定于鼠板的大鼠四肢皮下插入金屬針，連接肢導(dǎo)聯(lián)，記錄多導(dǎo)聯(lián)心電圖。

監(jiān)測大鼠Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ導(dǎo)聯(lián)心電圖，心率(HR)的變化，以P-R起點(diǎn)連線為基線，心電圖的紙速為50 mm·s-1，輸出頻率為50 Hz，增益為10-20 mm·mV-1，待波形穩(wěn)定后，記錄注射pit注射前、注射后10 min內(nèi)心電圖的變化，連續(xù)記錄5個(gè)心電周期，取其平均值。

1.7.2血清標(biāo)記物檢測 CK-MB檢測采用免疫競爭法，CTNT檢測采用酶聯(lián)(ELISA)免疫競爭法，檢測操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7.3血清抗氧化指標(biāo)檢測 ET-1、CGRP檢測采用ELISA免疫競爭法，檢測操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。SOD活性采用比色法測定，MDA采用比色法測定，在532 nm處為最大吸收峰換算成濃度。CAT采用比色方法測定，通過比色儀在405 nm處測定其生成量，換算CAT的活力。T-AOC采用比色法測定。

1.7.4酶活性指標(biāo)檢測方法 Na+,K+-ATP酶活性，Ca2+,Mg2+-ATP酶活性，均采用比色法，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 各組冠心Ⅱ號方對pit所致心肌缺血心電圖的影響大鼠舌下靜脈給予pit 10 min后，模型組大鼠出現(xiàn)心率明顯減慢，和假手術(shù)組比較差異有顯著性(P<0.05)，同時(shí)心電圖的T波低平、倒置及J點(diǎn)偏移和抬高，表明心肌缺血造模成功。和模型組比較，30 s時(shí)的尼可地爾組、冠心Ⅱ純化方組、冠心Ⅱ精制方組具有明顯抑制J點(diǎn)偏移和升高的作用(P<0.05)，10 min時(shí)的尼可地爾組、冠心Ⅱ純化方組，冠心Ⅱ精制方組和川丹顆粒組具有明顯抑制J點(diǎn)偏移和升高的作用(P<0.01，P<0.05)，各給藥組之間差異無顯著性(P>0.05))，見Tab 1，F(xiàn)ig2。

Fig 2 Effects of Guanxin Ⅱ on electrocardiogram J in Pit-induced myocardial ischemic ratsA：NS Group；B：Model Group；C：Nicorandil Group；D：CHDG Group；E：RGX Ⅱ Group；F：OGX Ⅱ Group

2.2 各組冠心Ⅱ號方對血清標(biāo)記物的影響舌下注射pit 40 min后，大鼠血清cTnT含量明顯升高，和假手術(shù)組比較差異具有顯著性(P<0.05)，CK-MB漏出有一定的增加。與模型組比較，尼可地爾組、川丹顆粒組、冠心Ⅱ精制方組和冠心Ⅱ純化方組明顯抑制cTnT水平(P<0.05，P<0.05),尼可地爾組、川丹顆粒組、冠心Ⅱ精制方組和冠心Ⅱ純化方組CK-MB漏出有明顯的減少，但差異無顯著性(P>0.05)，見Tab 2。

Tab 1 Effects of Guanxin Ⅱ formula on ECG of myocardial ischemic rats induced by Pit n=10)

Tab 2 Effects of Guanxin Ⅱ formula on serum CK-MB,cTnT markers in each group of n=10)

2.3 各組冠心Ⅱ號方對氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響大鼠即刻注射pit后，造成大鼠血清T-AOC、CAT和SOD含量的下降，與假手術(shù)組比較，模型組CAT含量下降差異具有顯著性(P<0.05)。與模型組比較，尼可地爾組、川丹顆粒組、冠心Ⅱ精制方組和冠心Ⅱ純化方組的CAT含量和SOD含量明顯升高(P<0.05，P<0.05)，各給藥之間比較差異無顯著性，見Tab 3。

2.4 各組冠心Ⅱ號方對ET-1和NO含量的影響大鼠造模后，和假手術(shù)組比較，模型組大鼠血中的ET-1含量明顯升高(P<0.01)，NO含量明顯降低(P<0.01)。和模型組比較，尼可地爾組、川丹顆粒組、冠心Ⅱ精制方組和冠心Ⅱ純化方組的ET-1含量得到明顯抑制(P<0.01，P<0.01)，尼可地爾組、川丹顆粒組、冠心Ⅱ精制方組和冠心Ⅱ純化方組的NO含量明顯升高(P<0.01，P<0.01)，見Tab 4。

Tab 3 Effects of Guanxin Ⅱ on oxidative stress markers in each group of n=10)

Tab 4 Effects of Guanxin Ⅱ on ET-1,NO markers in each group of rats n=10)

2.5 各組冠心Ⅱ號方對Na+,K+-ATP和Ca2+,Mg2+-ATP酶活性的影響大鼠注射pit后，血清Ca2+,Mg2+-ATP和Na+,K+-ATP活性有不同程度的降低，和假手術(shù)組比較，模型組的Ca2+,Mg2+-ATP活性降低，差異有顯著性(P<0.05)。和模型組比較，尼可地爾組、川丹顆粒組、冠心Ⅱ精制方組和冠心Ⅱ純化方組的Ca2+,Mg2+-ATP的活性明顯升高(P<0.05，P<0.05)，見Tab 5。

Tab 5 Effects of Guanxin Ⅱ on Na+,K+-ATP,Ca2+,Mg2+-ATP markers in each group of rats n=10)

3 討論

隨著介入心血管病學(xué)的快速發(fā)展，循證醫(yī)學(xué)已證明介入治療干預(yù)手段的有效性，但直至今日這些干預(yù)手段并未帶來群體預(yù)后的改善，目前的臨床實(shí)踐中，達(dá)到早期干預(yù)的比例仍然很低[7]。而早期的藥物干預(yù)具有快速性和便捷性，仍然是目前冠心病早期治療的重要手段。冠心Ⅱ號方是二十世紀(jì)七十年代治療冠心病心絞痛的經(jīng)典方劑，也是國家藥典收錄的中藥復(fù)方藥物，早期運(yùn)用此方治療冠心病心絞痛患者療效明顯[1，4]。方劑的現(xiàn)代化研究主要是體現(xiàn)在中藥的多種藥效物質(zhì)的提取、分離、鑒定，并明確這些藥效物質(zhì)的作用途徑、作用靶點(diǎn)，同時(shí)對藥物的提取成分進(jìn)行藥理活性篩選以及多靶點(diǎn)的效應(yīng)對比研究，中藥成品的質(zhì)量、工藝仍有較大的提升空間，是開發(fā)現(xiàn)代中藥的重要來源[3]，也是開發(fā)現(xiàn)代中藥和傳承中醫(yī)藥的有效途徑。

早期和現(xiàn)在的學(xué)者都對經(jīng)典名方冠心Ⅱ號方進(jìn)行了分離提取和藥效藥理研究，確定了部分有效成分和組分組成[8]。課題組對冠心Ⅱ號進(jìn)行分離提取，分別采用加熱回流提取、精制過濾液、選擇性高效純化制備，最后濃縮噴霧干燥，川丹顆粒、冠心Ⅱ號精制方和冠心Ⅱ號純化方的生藥當(dāng)量分別為：1.44、3.31和16.74，即1 g樣品干粉分別相當(dāng)于1.44、3.31和16.74 g藥材。通過本研究結(jié)果可以看出，經(jīng)過現(xiàn)代工藝提取冠心Ⅱ號樣品中的生藥含量明顯高于川丹顆粒(冠心Ⅱ號方的原制劑)，精制過濾和純化制備工藝能夠較大程度上保留指標(biāo)性成分，川丹顆粒、冠心Ⅱ號精制方、冠心Ⅱ號純化方的丹酚酸B外標(biāo)含量分別為0.767%、4.247%、32.758%，芍藥苷外標(biāo)含量分別為0.418%、1.546%、12.15%,精制和優(yōu)化后其藥物的有效成分也有較大的提高，同時(shí)服用量也明顯減少。現(xiàn)代研究表明，冠心Ⅱ號方中五味藥物的有效成分有芍藥苷、丹參酮、丹酚酸B、丹參素、阿魏酸和川芎堿等，對缺血、缺氧引起的心肌縮舒功能障礙有良好的改善作用[9-10]。尼可地爾屬硝酸酯類化合物(煙浪丁，SIGMART)，為作用于平滑肌的鉀通道激活劑。近年來研究顯示，尼可地爾可解除冠脈痙攣，增加冠脈的血流量，兼有舒張血管的作用，從而改善AMI患者預(yù)后[11]，是用于治療心絞痛的新型藥物。

垂體后葉素(pituitrin,Pit)是由豬、牛腦垂體后葉中提取的復(fù)方水溶性成分，內(nèi)含催產(chǎn)素和加壓素(加壓素又稱抗利尿素)，對平滑肌有強(qiáng)烈的收縮作用，作用快速而持續(xù)時(shí)間短。利用其對毛細(xì)血管和小動(dòng)脈收縮作用是顯著，特別是收縮冠狀動(dòng)脈血管引起血壓升高致心肌缺血的特點(diǎn)。大鼠舌下注射后30 s變化最為明顯，一般維持10-15 min，是一種廣泛的非特定的心肌缺血和心肌損傷[12]。心電圖能快速反映心肌缺血的特征變化，注射30 s大鼠心電圖顯示J點(diǎn)明顯偏移、抬高，J、T部分融合或完全融合、倒置，同時(shí)P-R及Q-T間期延長，心率減慢，而尼可地爾組、川丹顆粒組、冠心Ⅱ精制方組和冠心Ⅱ純化方組明顯減慢J點(diǎn)偏移、升高，緩解心肌缺血的程度。

肌鈣蛋白(Tn)是肌肉組織收縮的調(diào)節(jié)蛋白，位于收縮蛋白的細(xì)肌絲上，在肌肉收縮和舒張過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，在心肌細(xì)胞損傷時(shí)從心肌纖維上降解下來，胞質(zhì)中游離的cTnT迅速釋放入血液循環(huán)，其可作為早期診斷AMI 的敏感指標(biāo)[13]。心肌缺血損傷時(shí)，CK-MB也從心肌組織中漏出，CK-MB主要存在于心肌細(xì)胞的外漿層，CK-MB釋放入血后，一般4-6 h開始升高[14]。注射pit后大鼠血清cTnT水平明顯升高，由于CK-MB漏出的時(shí)效性，其含量有升高的趨勢，尼可地爾組、川丹顆粒組、冠心Ⅱ精制方組和冠心Ⅱ純化方組明顯抑制cTnT，對CK-MB的漏出有一定抑制。

ET-1和NO均是由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的血管活性物質(zhì)，ET-1是一種內(nèi)源性長效血管收縮調(diào)節(jié)因子，具有收縮血管升血壓效應(yīng)，還可反射性引起心率抑制，造成心肌供血不足。NO是在NOS作用下生成的擴(kuò)張血管物質(zhì)，具有選擇性舒張作用，可改善血管內(nèi)皮損傷[15]。Pit作用于心肌組織微血管內(nèi)皮，造成心肌組織廣泛的收縮缺血缺氧，導(dǎo)致許多活性因子釋放，如氧化代謝增強(qiáng)、兒茶酚胺水平等升高，進(jìn)一步導(dǎo)致ET-1含量增高和NO水平降低，加重冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能紊亂。尼可地爾組、川丹顆粒組、冠心Ⅱ精制方組和冠心Ⅱ純化方組的ET-1含量得到明顯抑制，而NO含量明顯升高。

SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要活性物質(zhì)，具有特殊的生理活性，拮抗因氧自由基升高對組織或細(xì)胞造成的損害，還可以及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞。MDA則是影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性，是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一[16]。CAT廣泛存在于紅細(xì)胞及機(jī)體組織內(nèi)的過氧化體中，主要生理作用就是催化H2O2分解為H2O與O2，促使H2O2減少與O2在鐵螯合物作用下的化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致-OH的生成[17]。缺血損傷導(dǎo)致心肌組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，SOD、T-AOC、CAT活性降低，MDA酶活性升高，又負(fù)反饋對心肌缺血造成損害，pit引起的急性心肌缺血為短暫性的，大部分氧化應(yīng)激指標(biāo)變化尚不明顯，尼可地爾組、川丹顆粒組、冠心Ⅱ精制方組和冠心Ⅱ純化方組的CAT含量和SOD含量具有明顯升高作用，緩解pit對心肌造成的損害，并對預(yù)后起到改善作用。

Na+,K+-ATP酶(鈉鉀泵)，Ca2+,Mg2+-ATP酶(鈣泵)分別是存在于組織及細(xì)胞膜上的一種蛋白酶，維持著細(xì)胞的滲透性，保持細(xì)胞的體積。同時(shí)維持低Na+，高K+的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，是機(jī)體代謝反應(yīng)進(jìn)行的必需條件。心肌缺血損傷導(dǎo)致血清各種炎性細(xì)胞的釋放，抑制Na+，K+-ATP酶活性，導(dǎo)致鈉鉀泵功能降低，細(xì)胞內(nèi)Na+,Ca2+濃度增加[18]。造模后大鼠Ca2+,Mg2+-ATP酶性明顯降低，尼可地爾組、川丹顆粒組、冠心Ⅱ精制方組和冠心Ⅱ純化方組不同程度提高Ca2+,Mg2+-ATP酶的活性，維持Na+,K+-ATP酶性的平衡。

中藥復(fù)方制劑為多組分和成份復(fù)雜體系，建立中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及復(fù)方制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，有助于闡明藥物的作用機(jī)理，目前中藥面臨的質(zhì)量問題，在經(jīng)典名方研發(fā)中可以較好的解決,精制和純化后的冠心Ⅱ號方有效成分含量較大幅度提升，制備工藝可控，較大程度保留了指標(biāo)性成分，對pit所致的心肌缺血具有保護(hù)作用，其機(jī)制涉及抗氧化應(yīng)激、抑制鈣超載、平衡血管穩(wěn)態(tài)、減輕心肌損傷，為進(jìn)一步的二次研發(fā)提供藥理學(xué)依據(jù)。

(課題研究得到山東希力藥業(yè)有限公司的經(jīng)費(fèi)資助和史新燦，羅久朝，史先成工程師的幫助，謹(jǐn)致謝忱！)