張 慶，倪 林，黃貞偉，張小琴，林 埔

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002)

4-羥基芝麻素(4-hydroxysesamin)屬于雙四氫呋喃木脂素類成分，存在于葉下珠、黃荊、香樟等中藥中。以芝麻素為代表的雙四氫呋喃類成分具有抗腫瘤、抗腦卒中等作用[1-2]，但有關(guān)4-羥基芝麻素對(duì)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的抑制作用及可能機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以課題組前期從香樟中獲得的4-羥基芝麻素為研究對(duì)象[3]，采用LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥模型，探討其對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)是否具有保護(hù)作用及可能作用機(jī)制，從而為從中藥中尋找神經(jīng)保護(hù)類藥物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑4-羥基芝麻素(由福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院倪林副教授提供，純度>98%)；脂多糖(Sigma，批號(hào)：L2630)；caspase-1 p20(SANTA CRUZ公司，批號(hào)：SC-398715)；IL-18(ab207323)、NLRP3(ab263899)均購(gòu)自abcam公司；p38(8690S)、Phospho-p38(4511S)、COX-2(12282)、兔二抗(7074)均購(gòu)自CST公司；鼠二抗(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：HS101-01)。

1.2 主要儀器光學(xué)顯微鏡(Thermo Fisher公司)；酶標(biāo)儀(TECAN公司)；7900H熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)；電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像儀(BIO-RAD公司)。

1.3 藥物制備精密稱取4-羥基芝麻素適量，溶于含20% DMSO的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為100 mmol·L-1的母液備用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇BV2小膠質(zhì)細(xì)胞(中國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心)，培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基中每天換液、隔天傳代，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.5 MTT法檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞存活率將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分為正常對(duì)照組(C)、LPS模型組(100 ng·L-1)、4-羥基芝麻素低劑量組(10 μmol·L-1，4-hydroxysesamin-L)、4-羥基芝麻素中劑量組(20 μmol·L-1，4-hydroxysesamin-M)、4-羥基芝麻素高劑量組(40 μmol·L-1，4-hydroxysesamin-H)。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.6 ELISA法檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-6、IL-1β的含量將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔板中，分組同“1.5”。采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-6、IL-1β的含量。

1.7 Western blot法檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中p38MAPK/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平BV2小膠質(zhì)細(xì)胞種板、造模和給藥同“1.6”。蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗(COX-2、p38、p-p38、NLRP3、caspase-1 p20、IL-18、β-actin)和相應(yīng)二抗，再置于凝膠成像系統(tǒng)中顯影，最后使用Image Lab軟件分析圖像。

2 結(jié)果

2.1 4-羥基芝麻素對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞存活率在LPS(100 ng·L-1)干預(yù)12 h的條件下無(wú)明顯變化；與LPS組相比，4-羥基芝麻素(10、20、40 μmol·L-1)對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響。

2.2 4-羥基芝麻素對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6、IL-1β分泌水平的影響Tab 1結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，LPS干預(yù)12 h后，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞上清中IL-6、IL-1β的水平明顯上升(P<0.01)；與LPS模型組比較，隨著4-羥基芝麻素濃度的增大，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞上清中IL-6、IL-1β的含量明顯下降(P<0.05或P<0.01)。

Tab 1 Effect of 4-hydroxysesamin on levels of IL-6,IL-1β in LPS-induced BV2 microglial cells n=3)

2.3 4-羥基芝麻素抑制LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中p38MAPK/NLRP3通路的激活Tab 2結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，LPS干預(yù)12 h后，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中p-p38、NLRP3、caspase-1 p20、IL-18、COX-2蛋白表達(dá)均明顯上升(P<0.05或P<0.01)；與LPS模型組比較，隨著4-羥基芝麻素濃度的增大，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中p-p38、NLRP3、caspase-1 p20、IL-18、COX-2的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

Tab 2 Effect of 4-hydroxysesamin on protein expression of p38MAPK/NLRP3 signaling pathway related proteins in LPS-induced BV2 microglial cells n=3)

3 討論

神經(jīng)炎癥反應(yīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種免疫應(yīng)答反應(yīng)，在缺血性腦卒中、神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活、發(fā)生增殖并遷移至損傷部位，釋放大量炎癥介質(zhì)及細(xì)胞毒素，如IL-6、TNF-α等[4]。促炎介質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生會(huì)進(jìn)一步加重炎癥浸潤(rùn)和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化所導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，對(duì)保護(hù)神經(jīng)元、恢復(fù)神經(jīng)功能具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4-羥基芝麻素可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-6的分泌，以及COX-2蛋白水平的表達(dá)。

NLRP3炎癥小體是一種大分子量的胞質(zhì)蛋白復(fù)合體，由NLRP3、ASC和效應(yīng)蛋白pro-caspase-1組成。缺血性腦卒中發(fā)生后，無(wú)活性的NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18發(fā)生轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)NLRP3、ASC和pro-caspase-1的組裝，進(jìn)而催化IL-1β和IL-18的成熟和分泌，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重缺血性腦卒中損傷[5]。p38MAPK信號(hào)通路可以通過(guò)促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)NLRP3炎癥小體的激活[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4-羥基芝麻素可明顯抑制p38蛋白磷酸化，降低NLRP3、caspase-1 p20的蛋白表達(dá)，進(jìn)而減少IL-18、IL-1β的釋放。

綜上可見(jiàn)，4-羥基芝麻素可能通過(guò)抑制p38MAPK/NLRP3信號(hào)通路，降低促炎性蛋白酶COX-2的表達(dá)，抑制炎癥因子IL-6的釋放，進(jìn)而發(fā)揮抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)的作用。