徐靜嫻，劉 森，高欣冉，高葉俊，夏清榮，葛金芳

(1.安徽醫(yī)科大學藥學院，2.重大自身免疫性疾病安徽省重點實驗室，3.炎癥免疫性疾病安徽省實驗室，安徽 合肥 230032;4.安徽醫(yī)科大學附屬心理醫(yī)院臨床藥學部，5.合肥市第四人民醫(yī)院安徽省精神衛(wèi)生中心藥劑科，合肥 230032)

小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的固有巨噬細胞，在先天免疫反應及大腦穩(wěn)態(tài)的維持中起著至關重要的作用[1]。在正常生理情況下，小膠質細胞可以吞噬清除細胞碎片和受損的神經元發(fā)揮神經保護作用[2]。然而，活化的小膠質細胞則可通過釋放腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細胞介素-1β (IL-1β)等促炎細胞因子和介質，誘發(fā)和(或)加速神經炎癥和神經毒性反應。研究表明，小膠質細胞過度活化后誘導的神經炎癥可導致突觸變性、神經細胞死亡和認知功能障礙[3]，參與包括抑郁癥和阿爾茨海默病在內的眾多神經精神疾病的發(fā)生發(fā)展過程。

白藜蘆醇(resveratrol，RES)，化學名為3，4′，5-三羥基-二苯乙烯，是一種具有多種生物活性的多酚類化合物，已有多個臨床試驗觀察其對非酒精性脂肪性肝炎(NCT01464801)、糖尿病(NCT02549924，NCT01038089)等代謝性疾病的保護作用及認知和腦血流的影響(NCT01010009)。本課題組長期致力于探索RES的神經保護作用及可能機制，前期研究結果證實RES不僅可以干擾淀粉樣蛋白異常沉積[4]，還能改善亞臨床甲狀腺功能減退癥[5]或非酒精性脂肪肝大鼠[6]的學習和認知功能障礙，其機制涉及對腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)豐度調節(jié)相關的多種信號分子的調控。然而，RES對小膠質細胞活性和功能的調節(jié)尚不清楚。

本研究擬通過建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的小膠質細胞損傷模型，在此基礎觀察白藜蘆醇體外用藥對炎癥反應及相關信號通路分子信號表達的影響，旨在進一步闡明白藜蘆醇神經保護作用的機制，為將其進一步開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株BV2細胞購自武漢細胞庫中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 試劑MEM/EBSS培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自以色列BI公司；丙酮酸鈉和非必需氨基酸購自上海源培生物科技股份有限公司；LPS(L2880)、白藜蘆醇、氟西汀購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自江蘇碧云天生物科技研究所；Iba-1(DF6442)抗體、Akt(AF6261)抗體、p-Akt(AF0016)抗體及p-CREB(AF389)抗體購自美國affinity公司；TREM1抗體(ab200729)、TREM2抗體(ab201621)和BDNF抗體(ab108319)購自英國abcam公司；Synaptotagmin I抗體(YT4484)購自美國Immunoway公司；CREB(12208-1-AP)抗體購自中國proteintech公司；β-actin抗體(TA-09)、辣根酶標記兔抗和辣根酶標記鼠抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.3 儀器TH4-200倒置光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；WULTISKANMK3酶標儀(北京安麥格貿易有限公司)；5424R離心機(德國艾本德生命科學公司)；PCR儀，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 BV2細胞培養(yǎng)將BV2細胞培養(yǎng)在10%的胎牛血清 (FBS)，1%非必須氨基酸和丙酮酸鈉(1 ∶1)的MEM/EBSS培養(yǎng)基中，置于37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用0.25%胰蛋白酶和PBS每隔2 d按照1 ∶3的稀釋度進行傳代培養(yǎng)。

2.2 實驗分組① LPS濃度梯度：實驗設置對照組，LPS(0.01，0.1，1，10，100 mg·L-1)刺激24 h后通過MTT法檢測細胞活性，LDH法檢測細胞上清LDH釋放量。② LPS時間梯度：實驗設置對照組，LPS(1 mg·L-1)刺激6、12、24、48 h，MTT法檢測細胞活性。③ 白藜蘆醇作用機制實驗：設置對照組、模型組(LPS 1 mg·L-1)，白藜蘆醇(終濃度為10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol·L-1)、氟西汀(終濃度為10-7mol·L-1)和布洛芬組(終濃度為10-7mol·L-1)組，在LPS刺激前12 h加入。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行相關指標檢測。

2.3 MTT法觀察BV2細胞活力將BV2細胞以每孔1×104個接種于96孔板中，CO2培養(yǎng)箱孵育，待細胞貼壁后給藥，繼續(xù)孵育，加入新鮮的配置的MTT (5 g·L-1)20 μL，孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，用酶標儀檢測在490 nm波長處的吸光(OD)值。

2.4 LDH的測定LDH測定按照生產廠家說明書進行。提前1 h加入LDH釋放劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。檢測490 nm處的OD值。

2.5 qRT-PCR法測定炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA表達收集細胞，用TRIzol裂解細胞提取細胞內總RNA。使用多功能定量儀對總RNA的濃度和純度進行測定。使用試劑盒法合成cDNA。qRT-PCR反應步驟按照說明書進行，引物序列見Tab 1，采用10 μL反應體系，反應體系包括5 μL的TB Green PCR Master Mix，上下游引物各0.3 μL，3 μL的cDNA，無酶水1.4 μL。反應條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，總循環(huán)數(shù)為40個。實驗結果用2-ΔΔCt法分析。

Tab 1 Primer sequences

2.6 免疫熒光染色BV2細胞首先用甲醇固定10 min，然后經10%的BSA封閉20 min，用1%的BSA稀釋Iba-1一抗(工作濃度1 ∶100)，在4 ℃冰箱孵育過夜。次日用PBS洗滌細胞3次，每次5 min，浸洗不搖晃，熒光標記的二抗避光室溫孵育1 h。加入含有DAPI的抗熒光衰減封片劑后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.7 Western blot法測定BDNF等相關蛋白的表達情況在BV2細胞中加入含有1% PMSF和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白。按照BCA法測定蛋白濃度。定量后的蛋白樣品經12%的SDS-PAGE凝膠分離蛋白，然后轉移到PVDF膜上，經5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入至相應的一抗中孵育過夜(除TREM1和Synaptotagmin I的一抗工作濃度為1 ∶2 000之外，其他一抗工作濃度均為1 ∶1 000)，次日經蛋白相對應的二抗室溫孵育1 h，將按比例配置好的超敏ECL顯影液滴加到PVDF膜上經化學發(fā)光儀進行顯影成像。實驗結果經Image J圖像分析軟件進行蛋白條帶灰度值分析。

3 結果

3.1 LPS誘導BV2細胞炎癥損傷模型的建立

3.1.1LPS對BV2細胞活力的影響 采用MTT方法，結合細胞培養(yǎng)上清中LDH濃度測定，觀察不同濃度梯度LPS (0.01、0.1、1、10、100 mg·L-1)、不同作用時間(6、12、24、48 h)對BV2細胞活力的影響。結果如Fig1 A-C所示，隨LPS刺激濃度增加、作用時間延長，BV2細胞活力減弱、上清液中LDH釋放量增加。綜合LPS刺激的時效及量效關系結果，后續(xù)實驗中選擇的BV2細胞損傷模型實驗條件為LPS(1 mg·L-1)刺激24 h。

Fig 1 Dose-and time-effect of LPS on viability of BV2 cells*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

3.1.2LPS對BV2細胞IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA表達的影響 采用qRT-PCR技術檢測LPS刺激對BV2細胞中相關炎癥因子表達的影響。結果如Fig2所示，與對照組比較，LPS(1 mg·L-1)刺激24 h后BV2細胞中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達明顯增加(P<0.05)。

Fig 2 Effect of LPS on mRNA expression of IL-1β,IL-6 and TNF-α in BV2 **P<0.01 vs control group.

3.2 白藜蘆醇對LPS誘導的BV2細胞培養(yǎng)上清中LDH釋放量的影響如Fig3所示，與對照組比較，模型組細胞培養(yǎng)上清中LDH釋放量明顯增高，白藜蘆醇(10-6-10-10mol·L-1)體外用藥可以明顯抑制LPS誘導的BV2細胞上清液中LDH含量增加(P<0.05)。

3.3 白藜蘆醇對LPS誘導的BV2細胞標志物Iba-1表達的影響采用免疫熒光染色觀察小膠質細胞活化的特異性標志物Iba-1的表達變化。結果表明，與對照組相比，LPS處理24 h后，細胞胞體變大，突起變多變短，細胞變圓，形似阿米巴狀或桿狀，形態(tài)變化明顯且熒光強度略有升高，而白藜蘆醇(10-7mol·L-1)及陽性對照藥物氟西汀和布洛芬預處理后BV2細胞形態(tài)接近正常。見Fig4。

Fig 3 Effect of RES on cell injury induced by LPS in BV2 *P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group.

3.4 白藜蘆醇對LPS誘導的BV2細胞IL-1β、IL-6和TNF-α表達的影響Fig5為白藜蘆醇體外用藥對LPS誘導的BV2細胞中炎癥因子IL-1β,IL-6,TNF-α的影響。如圖所示，與對照組比較，模型組細胞IL-1β、IL-6和TNF-α的表達明顯上升，白藜蘆醇(10-6-10-10mol·L-1)及陽性對照藥物氟西汀和布洛芬預處理均可減少LPS誘導的BV2細胞中IL-1β、IL-6和TNF-α表達的變化(P<0.05或P<0.01)。

3.5 白藜蘆醇對LPS誘導的BV2細胞BDNF、p-Akt、p-CREB及Synaptotagmin I蛋白表達的影響Western blot 方法檢查白藜蘆醇對LPS誘導的BV2細胞BDNF、p-Akt、p-CREB及Synaptotagmin I 蛋白表達的影響。結果如Fig6所示，與對照組相比，LPS刺激的模型組BV2細胞BDNF,p-CREB和Synaptotagmin I蛋白的表達降低，而p-Akt的蛋白表達則明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，白藜蘆醇及陽性對照藥物氟西汀及布洛芬預處理可以逆轉上述蛋白表達的改變。

Fig 4 Immunofluorescence staining of Iba-1 in BV2 cells(magnification×200)

Fig 5 Effect of RES on mRNA expression of IL-1β,IL-6 and TNF-α induced by LPS in BV2 *P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group.

Pearson檢驗結果表明，BV2細胞BDNF的表達與p-Akt (r=-0.610,P=0.001)呈負相關,而與CREB (r=0.613,P=0.001)、Synaptotagmin I(r=0.608,P=0.001)的表達呈正相關。

3.6 白藜蘆醇對LPS誘導的BV2細胞TREM2和TREM1表達的影響Fig7為各組BV2細胞中TREM1和TREM2表達情況。與對照組相比，模型組TREM1蛋白的表達降低，而TREM2的表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義 (P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，白藜蘆醇及陽性對照藥物氟西汀和布洛芬預處理可上調TREM1的表達并降低TREM2的表達。

Fig 6 Effect of RES on protein expression of BDNF, p-Akt,p-CREB,and Synaptotagmin I induced by LPS in BV2 A:a typical graph;B:the statistical analysis of Western blot results;1:control group;2:Model group;3-7:RES (10-6～10-10 mol·L-1)group;8:Flu (10-7 mol·L-1)group;9:Ibu group (10-7 mol·L-1).*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group.

Fig 7 Effect of RES on protein expression of TREM2 and TREM1 induced by LPS in BV2 A:a typical graph;B:the statistical analysis of Western blot results;1:control group;2:model group;3-7:RES (10-6～10-10 mol·L-1)group;8:Flu (10-7 mol·L-1)group;9:Ibu (10-7 mol·L-1)group.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group.

Pearson檢驗結果表明，BV2細胞TREM1與TREM2的表達呈負相關 (r=-0.629,P<0.001)，并且BDNF的表達與TREM1(r=0.894,P<0.001)的表達呈正相關，而與TREM2(r=-0.593,P=0.001)的表達呈負相關。

4 討論

小膠質細胞介導的神經系統(tǒng)炎癥反應是包括抑郁癥和阿爾茨海默病在內的多種神經精神疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。LPS是革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分，是小膠質細胞活化的強刺激因子。研究表明，LPS可誘導小膠質細胞激活，導致TNF-α、NO等炎癥介質及活性氧自由基釋放增多[7-8]。本課題組前期研究證實，LPS腹腔注射可誘導大鼠抑郁相關行為的產生，并導致海馬BDNF相關的突觸可塑性改變[9]。本研究中采用多種方法觀察了LPS對BV2小膠質細胞增殖活性及炎癥介質釋放的影響，結果表明，LPS(1 mg·L-1)作用24h可誘導BV2細胞活力下降、細胞損傷及炎癥介質IL-1β,IL-6,TNF-α的mRNA表達增加。結合特異性的Iba-1免疫熒光染色結果，提示LPS誘導的BV2細胞損傷和炎癥模型成功建立。

多酚類化合物白藜蘆醇具有廣泛的藥理學活性，已被證明具有多靶點的神經保護作用。本課題組前期研究結果證實其對多種動物模型學習記憶能力及抑郁相關行為的改善作用[4-6,10]。本研究結果表明，白藜蘆醇(10-6-10-10mol·L-1)體外用藥可減少BV2細胞培養(yǎng)上清中的LDH釋放，并下調IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA表達，提示白藜蘆醇可有效緩解LPS誘導的神經炎癥反應。5-羥色胺再攝取抑制劑氟西汀是臨床常用的抗抑郁藥物，主要通過增加突觸間隙中的5-羥色胺濃度發(fā)揮抗抑郁作用。研究發(fā)現(xiàn)，氟西汀治療抑郁癥的機制也涉及對神經炎癥的調節(jié)[11]。本課題組前期研究中也證實氟西汀對LPS誘導的大鼠抑郁相關行為具有改善作用[9]?；谝钟舭Y發(fā)生機制的炎癥反應學說，非甾體抗炎藥在抑郁癥防治中的作用也引起廣泛關注。因此，本研究選擇了氟西汀和非甾體抗炎藥布洛芬作為陽性對照藥物。結果表明，兩者均對LPS誘導的BV2小膠質細胞損傷及炎癥反應有一定的改善作用。

突觸可塑性是大腦結構和功能維持和調節(jié)的重要物質基礎。研究表明，小膠質細胞可在多環(huán)節(jié)通過多種途徑參與突觸可塑性的調節(jié)。在大腦發(fā)育階段，神經元相互作用形成大量的無效的突觸連接，而這些無效的突觸連接不及時清除則會引起神經功能障礙，小膠質則通過修剪無效的突觸連接在突觸可塑性中起重要作用[12]。在病理狀態(tài)下，活化的小膠質細胞還可通過吞噬死亡的神經元殘骸、修復損傷的突觸網絡或調節(jié)Wnt等信號轉導通路的活性影響突觸可塑性[13]。并且，有研究指出，小膠質細胞分泌的BDNF是維持學習依賴型突觸形成的重要物質基礎[14]。BDNF的轉錄依賴于Ca2+介導的環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白(CREB)的激活[15]，其基因多態(tài)性、豐度及功能的改變已被證實參與抑郁癥等多種疾病的發(fā)生。突觸結合蛋白SynaptotagminⅠ參與調控突觸的形成及神經遞質的傳遞，在突觸可塑性調節(jié)中發(fā)揮重要作用[16]。本研究中，LPS(1 mg·L-1)作用24 h可誘導BV2細胞BDNF、p-CREB及SynaptotagminⅠ的蛋白表達降低，而p-Akt的蛋白表達則顯著升高；白藜蘆醇及陽性對照藥物氟西汀及布洛芬預處理可以逆轉上述蛋白表達的改變。相關性分析結果提示，BDNF的表達與p-CREB及 Synaptotagmin I的表達之間呈正相關關系。雖然磷酸化狀態(tài)Akt與CREB的關系仍需后續(xù)實驗確認，這些結果提示，LPS誘導的小膠質細胞炎癥反應及其伴發(fā)的突觸可塑性改變，是白藜蘆醇發(fā)揮神經保護作用的可能靶點之一，并且BDNF/Akt/CREB信號通路在其中發(fā)揮重要作用。

髓樣細胞上表達的觸發(fā)受體(TREMs)不僅能夠調節(jié)機體的炎癥反應[17]，其多態(tài)性及豐度改變還參與多種神經精神疾病的發(fā)生機制[18]。TREMs表達失衡可能是小膠質細胞活性和功能狀態(tài)發(fā)生改變的反應之一。本研究中，LPS(1 mg·L-1)作用24h可誘導BV2細胞TREM1表達下調，TREM2表達增加，且TREM1和TREM2的表達呈負相關，這與本課題組前期研究的整體動物實驗結果相一致。白藜蘆醇及陽性對照藥物氟西汀和布洛芬體外給藥均可增加TREM1表達并下調TREM2的表達。Pearson檢驗結果表明，BDNF、CREB及SynaptotagminⅠ的表達均與TREM1的表達呈正相關，而與TREM2的表達則呈負相關關系。進一步提示，TREM1/2的表達改變可能參與LPS誘導的突觸可塑性改變并是白藜蘆醇神經保護作用的可能靶點之一。

綜上所述，本研究結果表明，白藜蘆醇可抑制LPS誘導的BV2小膠質細胞損傷及炎癥反應，其機制與調節(jié)BDNF/Akt/CREB及TREM1/2的表達失衡有關。