孫雪梅，呂心蕊，儲(chǔ) 偉，朱曉筱，周蘭蘭

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230022；2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護(hù)學(xué)院，廣東 深圳 518055)

腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)是一種由多種病因引發(fā)，以腎小球基底膜通透性升高為主的原發(fā)性腎臟疾病，這種疾病的臨床癥狀是高尿蛋白、高度水腫、高脂血癥和低蛋白血癥，對(duì)身體危害較大[1-2]。研究顯示，在腎臟疾病中，當(dāng)腎小球?yàn)V過的通透性增大時(shí)，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)大量蛋白質(zhì)隨尿液排出。高尿蛋白不僅是腎臟受損的一個(gè)指標(biāo)，還是腎病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素[3]。高蛋白尿與腎小球足細(xì)胞足突間裂孔隔膜受損及相關(guān)蛋白的表達(dá)異常導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障的破壞密切相關(guān)。Nephrin是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)且證實(shí)與濾過屏障相關(guān)的足細(xì)胞蛋白[4]。瞬時(shí)性受體電位通道6(transient receptor potential 6，TRPC6)是跨膜蛋白通道蛋白，主要分布在腎小球外層的足細(xì)胞中，同時(shí)在內(nèi)皮細(xì)胞和系膜上也有表達(dá)。TRPC6作為非選擇性的陽(yáng)離子通道，主要介導(dǎo)鈣離子的內(nèi)流，并激活下游信號(hào)。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞受損會(huì)導(dǎo)致TRPC6蛋白的升高[5-6]，nephrin蛋白和TRPC6蛋白兩者間有共定位并且受同一種酶的調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究nephrin蛋白和TRPC6蛋白在腎病發(fā)展過程中的作用。

目前，腎病綜合征的臨床治療主要用糖皮質(zhì)激素((glucocorticoid，GC)及其他免疫抑制劑，雖能控制病情，但長(zhǎng)期應(yīng)用可能會(huì)導(dǎo)致感染、高血糖及股骨頭壞死等嚴(yán)重并發(fā)癥[7-8]。地塞米松(dexamethasone，Dex)是GC類藥物，因其抗炎、抗過敏、休克、抗毒等療效強(qiáng)大，極易產(chǎn)生與治療目的無關(guān)的反應(yīng)，限制其臨床的應(yīng)用。如何能在確保其發(fā)揮最大治療效果的前提下盡可能降低毒副作用，成為擺在臨床及藥物研制者面前的一道難題。地塞米松緩釋劑(sustained-release of dexamethasone，SR Dex)作為一種新型的長(zhǎng)效藥[9]，采用腎囊內(nèi)植入給藥，可使藥物持續(xù)恒速釋放，使病灶部位血藥濃度持續(xù)穩(wěn)定在治療范圍內(nèi)，因而可能具有非常好的治療效果。前期研究結(jié)果顯示，SR Dex對(duì)阿霉素腎病大鼠具有良好的保護(hù)作用[10]。本文進(jìn)一步研究了SR Dex對(duì)藏紅花紅O家兔腎病模型的保護(hù)作用及機(jī)制，旨在為其今后的臨床應(yīng)用提供充足的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)雄性普通級(jí)新西蘭家兔，購(gòu)自江蘇省南京江寧區(qū)青龍山動(dòng)物場(chǎng)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2012-0008，體質(zhì)量(2.0-2.5)kg。家兔(每只/籠)正常攝取水和食物，(21-23)℃溫度和40%-70%濕度的飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)3 d后實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要藥品試劑與儀器地塞米松植入劑及受試藥的輔料，由安徽四維藥業(yè)提供，臨用前裝入消毒的植入劑專用植藥針。醋酸地塞米松，購(gòu)自浙江仙琚制藥公司。臧紅花紅O(SafraninO)：購(gòu)自Simga公司。nephrin(bs-4866R，1 ∶100)抗體和TRPC6(bs-2393R,1 ∶100)抗體均購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司。高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Leica。ZH-B6型家兔代謝籠：購(gòu)自正華生物儀器設(shè)備公司。Spectra Max 190全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：Molecular Devices。RM2255全自動(dòng)切片系統(tǒng)：德國(guó)Leica。7500Real-Time PCR儀：Applied Biosystems。

1.3 家兔臧紅花紅O腎病模型制備[11-12]及腎囊注射術(shù)臧紅花紅O腎病模型采用連續(xù)二次兔耳緣靜脈注射1%臧紅花紅O方法，首次注射劑量15mg/只，3 h后再次注射15mg/只。家兔耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)麻醉，然后在無菌條件下從背部做切口，分別暴露兩側(cè)腎脂肪囊，用植入受試藥的專用植藥針腎囊內(nèi)注射，逐層縫合，縫合處滴少許10 U單位青霉素鈉溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥家兔按體重隨機(jī)分為：對(duì)照組、假手術(shù)組、腎病模型組。造模1周后，腎病模型組分為模型組，受試藥輔料組、受試藥高中低劑量組、地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組。模型組只做腎囊穿刺，受試藥輔料組注射空白對(duì)照粒子(0.74 mg·kg-1)，受試藥組注射不同劑量的藥物(1.48、0.74、0.37 mg·kg-1)，假手術(shù)組除不注射給藥外，其他操作相同。陽(yáng)性對(duì)照組采用灌胃給藥(0.4 mg·kg-1，q.d.)，持續(xù)給藥至第8周。

1.5 腎病家兔血液和尿液生化指標(biāo)檢測(cè)取家兔的尿液和血液檢測(cè)尿素氮和血肌酐的含量，來評(píng)估腎臟功能的損傷程度。其中尿液檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)為：造模前、造模1周后、用藥后每周1次。血液檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)為：造模前、造模1周后、用藥后每周2次。

1.5.124 h尿蛋白檢測(cè)(urinary protein,mg·d-1) 收集24 h內(nèi)的尿液，收集尿液時(shí)禁食。從收集的尿液總量中取3 mL，在3 000 r·min-1的條件下離心5 min，取上清液測(cè)含量。采用雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)得結(jié)果乘以24 h內(nèi)總尿液量，即得24 h尿蛋白的量。

1.5.2血肌酐(creatinine，Cr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的測(cè)定 耳緣動(dòng)脈取血法采集血液，至于EP管中，室溫靜置1 h，在4 000 r·min-1的條件下離心10 min，取上清進(jìn)行測(cè)量。采用苦味酸肌酐反應(yīng)測(cè)血清中肌酐的含量，酸性試劑反應(yīng)測(cè)尿素氮的含量，然后分別在510 nm和540 nm的條件下分別測(cè)OD值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，分別計(jì)算求出血肌酐和尿素氮的量。

1.6 腎組織病理學(xué)檢測(cè)家兔麻醉后處死，取出腎組織分別進(jìn)行PAS染色和天狼猩紅(sirius red，SR)染色，染色的具體實(shí)驗(yàn)操作詳見試劑盒說明書指導(dǎo)，試劑盒購(gòu)自Abcam公司。

1.7 免疫組化法(immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)腎組織中Nephrin和TRPC6蛋白的表達(dá)家兔麻醉后處死，取出腎臟用免疫組化試劑盒檢測(cè)Nephrin、TRPC6蛋白表達(dá)，具體實(shí)驗(yàn)操作詳見試劑盒說明書指導(dǎo)，試劑盒購(gòu)自Simga公司。在顯微鏡下(400x)進(jìn)行拍照，隨機(jī)取5個(gè)視野，用ImageJ進(jìn)行分析，測(cè)平均光密度。

1.8 Real-time PCR檢測(cè)腎組織中Nephrin、TRPC6 的mRNA水平家兔麻醉后處死，取腎組織用TRIzol Reagent提取總RNA，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司?；蛐蛄腥缦拢害?actin，F(xiàn)：5′-TTCCTTCC TGGGTATGGAAT-3′和R：5′-GAGGAGCAATGATCT TGATC-3′。Nephrin，F(xiàn)：5′-AGCCAGGAGCGTCTTTC TC-3′和R：5′-ACAGCACATTGAGGCGGTA-3′。TRPC6，F(xiàn)：5′-TTCCTGTTCCCTTCAACCTG-3′和R：5′-TCTGCATCCTCTTGGAAACC-3′。操作步驟嚴(yán)格按照Tli RNaseH Plus試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 SR Dex對(duì)藏紅花紅O腎病家兔24 h尿蛋白的影響如Tab 1所示，與對(duì)照組相比，模型組、輔料組在造模1周后，家兔24 h內(nèi)的尿蛋白顯著增加，直至實(shí)驗(yàn)第9周差異均有顯著性(P<0.01)。與模型組相比，SR Dex不同劑量組在第3-8周時(shí)尿蛋白降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組在第4-8周時(shí)尿蛋白降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 SR Dex對(duì)藏紅花紅O腎病家兔血肌酐和血尿素氮的影響如Tab 2所示，與對(duì)照組相比，模型組、輔料組在造模后第1-9周血肌酐和尿素氮的含量均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，SR Dex不同劑量組在第2-8周血肌酐的量均減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；SR Dex高劑量組在第1-8周尿素氮的含量明顯降低(P<0.05)，SR Dex中、低劑量組在第3-8周尿素氮降低(P<0.01)。陽(yáng)性對(duì)照組血肌酐和尿素氮的含量分別在第2-8周和第3-8周下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Tab 1 Effect of SR Dex on urinary protein in safranine O-induced nephritis rabbits n=10)

續(xù)Tab 1

Tab 2 Effect of SR Dex on serum creatinine and urea nitrogen in safranine O-induced nephritis rabbits n=10)

續(xù)Tab 2

2.3 SR Dex對(duì)藏紅花紅O腎病家兔腎組織病理學(xué)的影響如Fig1所示，與對(duì)照組比較，模型組、輔料組中腎小球上皮系膜面積變大，基底膜明顯加厚。SR Dex不同劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組均可不同程度的減輕腎組織病理?yè)p傷。

Fig 1 Effect of SR Dex on renal tissue histopathology in safranine O-induced nephritic rabbits n=3)A:control;B:Sham;C:model;D:Accessory;E-G:SR Dex 0.37,0.74,1.48 mg·kg-1;H:Dex 0.4 mg·kg-1.

如Fig2所示，與對(duì)照組比較，模型組和輔料組間質(zhì)纖維深染，腎小球的脂類沉積增重。SR Dex不同劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組均可不同程度的緩解間質(zhì)纖維深染和脂類沉積。

2.4 SR Dex對(duì)藏紅花紅O腎病家兔腎組織中nephrin表達(dá)的影響如Fig3所示，對(duì)照組、假手術(shù)組中nephrin呈棕色黃染顆粒狀。與對(duì)照組相比，模型組和輔料組nephrin分布減少，染色強(qiáng)度減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，SR Dex不同劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組可不同程度的增加nephrin蛋白的含量，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

Fig 2 Effect of SR Dex on renal tissue histopatholopy in safranine O-induced nephritis rabbits (SR×200) n=3)A:control;B:Sham;C:model;D:Accessory;E-G:SR Dex 0.37,0.74,1.48 mg·kg-1;H:Dex 0.4 mg·kg-1.

Fig 3 Effect of SR Dex on nephrin protein expression of renal tissues in safranine O-induced nephritic rabbits (IHC×200) n=4)A:control;B:Sham;C:model;D:Accessory;E-G:SR Dex 0.37,0.74,1.48 mg·kg-1;H:Dex 0.4 mg·kg-1.**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

2.5 SR Dex對(duì)藏紅花紅O腎病家兔腎組織中TRPC6表達(dá)的影響如Fig4所示，對(duì)照組、假手術(shù)組TRPC6呈棕色黃染顆粒狀。與對(duì)照組相比，模型組和輔料組TRPC6含量明顯增多，表現(xiàn)為棕色顆粒狀，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。與模型組相比，SR Dex不同劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組均可抑制TRPC6的表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

Fig 4 Effect of SR Dex on TRPC6 protein expression of renal tissues in safranine O-induced nephritic rabbits (IHC×200) n=4)A:control;B:Sham;C:model;D:Accessory;E-G:SR Dex 0.37,0.74,1.48 mg·kg-1;H:Dex 0.4 mg·kg-1.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

2.6 SR Dex對(duì)藏紅花紅O腎病家兔腎組織中nephrin蛋白mRNA水平的影響如Fig5所示，與對(duì)照組相比，模型組、輔料組中nephrin蛋白mRNA的量顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，SR Dex不同劑量組和陽(yáng)性藥對(duì)照組nephrin蛋白mRNA的量均增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

Fig 5 Effect of SR Dex on level of nephrin mRNA expression of renal tissues in safranine O-induced nephritic rabbits n=3)**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

2.7 SR Dex對(duì)藏紅花紅O腎病家兔腎組織中TRPC6蛋白mRNA水平的影響如Fig6所示，與對(duì)照組相比，模型組、輔料組中TRPC6 蛋白mRNA的量顯著增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，SR Dex不同劑量組和陽(yáng)性藥對(duì)照組中TRPC6蛋白mRNA的量明顯減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

Fig 6 Effect of SR Dex on level of TRPC6 mRNA expression of renal tissues in safranine O-induced nephritic rabbits n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用耳緣靜脈注射臧紅花紅O的方法建立家兔腎病模型[11-12]，藏紅花紅O是一種有毒性的染料，其大量靜脈注射可造成家兔腎小管上皮的壞死，這一作用與腎小球腎病的臨床癥狀很像。此外，臧紅花紅O腎病模型還作為研究足細(xì)胞損傷檢測(cè)的模型。本研究使用雄性家兔進(jìn)行造模，造模成功率高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在造模3 h后，家兔的尿液變成紅色；在造模24 h后，家兔食欲不振，發(fā)生腹瀉，尿蛋白量增加，血肌酐、尿素氮的量也明顯增加。家兔腎組織病理結(jié)果顯示，造模后出現(xiàn)腎小管上皮壞死，腎小球部分萎縮，伴隨著炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)等表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SR Dex一次性腎囊植入可降低腎病家兔24 h尿蛋白的量。下調(diào)腎病家兔血肌酐和尿素氮的含量。同時(shí)腎臟病理組織學(xué)結(jié)果也顯示，SR Dex各劑量組可不同程度的改善腎小球上皮細(xì)胞的增生、腎小球基底膜的增厚以及腎小球內(nèi)脂類沉積。研究結(jié)果顯示，SR Dex一次性腎囊植入對(duì)藏紅花紅O所致腎病家兔具有較好的保護(hù)作用。

值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用藥前2周尿蛋白數(shù)值無明顯降低，究其原因可能與以下因素有關(guān)。尿蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，腎病模型組在1-9周造模期間，尿蛋白一直在持續(xù)升高，與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[11-12]，說明臧紅花紅O腎病模型隨時(shí)間延續(xù)，損害逐漸加重。也就是說造模前2周處于疾病的上升階段，不管是用藥組還是模型組腎病家兔的尿蛋白都是升高的。而本研究受試藥是緩釋劑，Tab 1中2 w為用藥1周時(shí)腎病家兔的尿蛋白量，此時(shí)藥物的作用還未凸顯。從結(jié)果數(shù)據(jù)來看，在用藥兩周后(Tab 1中3 w)開始發(fā)揮治療作用，腎病家兔的尿蛋白開始下降，且隨著用藥時(shí)間逐步延長(zhǎng)，尿蛋白數(shù)值逐漸下降，說明藥物可以明顯降低尿蛋白。總之，研究結(jié)果顯示受試藥可有效降低腎損指標(biāo)，且維持時(shí)間較長(zhǎng)。

足細(xì)胞位于腎小球上皮外層，胞體較大，呈多突狀，又稱足突。足突之間連接成裂孔隔膜，這些裂孔隔膜是保證腎小球正常濾過的屏障[13]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腎小球?yàn)V過系統(tǒng)的損傷后會(huì)產(chǎn)生大量蛋白尿，高蛋白尿的產(chǎn)生可能與足突之間裂孔隔膜的完整性受損有關(guān)。足突之間裂孔隔膜中nephrin、TRPC6蛋白表達(dá)與分布對(duì)穩(wěn)定裂孔隔膜結(jié)構(gòu)的完整性很重要。nephrin是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)并已經(jīng)證實(shí)的足細(xì)胞分泌蛋白[4]，位于19q13.1染色體上，其中NPHS1的突變會(huì)導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生[14]。TRPC6是在2005年被發(fā)現(xiàn)，因其與腎臟疾病之間的關(guān)系很快受到大家的關(guān)注。TRPC6位于裂孔隔膜，是裂孔隔膜相關(guān)蛋白，還是與蛋白尿有關(guān)的通道蛋白[15]，其主要功能為介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流增多，并通過調(diào)控下游信號(hào)發(fā)揮功能。足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白的變化可能與TRPC6介導(dǎo)的鈣內(nèi)流相關(guān)。本結(jié)果顯示，SR Dex可提高造模后nephrin的表達(dá)，降低TRPC6的表達(dá)，與類似文獻(xiàn)研究一致[16-18]。所以對(duì)TRPC6通道的阻斷或許會(huì)成為治療腎臟疾病的新靶點(diǎn)。

綜上所述，SR Dex腎囊內(nèi)注射給藥對(duì)藏紅花紅O腎病損傷具有很好保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腎臟nephrin和TRPC6蛋白表達(dá)，增強(qiáng)足細(xì)胞濾過屏障功能有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床更有效的應(yīng)用該類藥物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。