趙宇涵，康小龍，何承輝

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830002；3.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004)

系統(tǒng)性硬皮病(systemic scleroderma，SSc)是一種慢性自身免疫性疾病，其特征表現(xiàn)為皮膚和內(nèi)部器官的纖維化以及血管病變[1]。SSc死亡率極高，但尚未完全解釋其發(fā)病機(jī)制[2]。本課題組從刺山柑(CapparisspinosaL.)中提取了有效成分刺山柑總生物堿，在前期研究中，我們采用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測了SSc模型小鼠血清中Wnt相關(guān)蛋白Wnt10b的含量，發(fā)現(xiàn)刺山柑總生物堿可降低Wnt10b表達(dá)[3]，采用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測SSc模型小鼠皮膚組織中Wnt1、Wnt2、Wnt3a的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)刺山柑總生物堿可降低Wnt1、Wnt2、Wnt3a的蛋白表達(dá)；采用qRT-PCR法檢測了模型小鼠皮膚組織中β-catenin mRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)法檢測了模型小鼠皮膚組織中β-catenin蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)刺山柑總生物堿可降低β-catenin mRNA蛋白的表達(dá)[4-5]。為了確保實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)性，避免假陽性，進(jìn)一步探討刺山柑總生物堿對SSc Wnt通路的作用，本研究將采用更加準(zhǔn)確的q-RT PCR方法檢測其對SSc小鼠Wnt通路中Wnt2 mRNA的表達(dá)，采用Western blot方法驗(yàn)證其對SSc小鼠Wnt通路中Wnt3a及β-catenin蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)動物90只SPF級BALB/c雌性小鼠，合格證號：SCXK(京)2016-0006，體質(zhì)量(18-22)g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)藥物刺山柑購于新疆麥迪森維藥飲片廠；鹽酸博萊霉素注射劑(批號：17001711，規(guī)格：1.5萬U)，海正輝瑞制藥有限公司；青霉胺片(批號：052160901，規(guī)格：125 mg/100片)，上海上藥信誼藥廠。

1.3 試驗(yàn)試劑SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號：20181119)、脫脂奶粉(批號：702F0511)、Lowry法蛋白濃度測定試劑盒、SABC(IgG)-POD試劑盒(批號：20200929)(北京索萊寶科技有限公司)；Real Time PCR EasyTM-SYBR GreenⅠ熒光實(shí)時定量PCR試劑盒、RT EasyTMⅠ反轉(zhuǎn)錄試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)；β-catenin抗體(Cell signaling technology公司，批號：8480s)；Wnt3a抗體(Abcam公司，批號：ab219412)；β-actin抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號：BM0627)；引物合成于上海生工股份有限公司。

1.4 試驗(yàn)儀器低溫離心機(jī)(型號：LEDEND MICRO21)、核酸蛋白測定儀(型號：NANO DROP 2000)、實(shí)時定量PCR儀(型號：Step One PlusTM)，美國Thermo Fisher公司；Western blot設(shè)備(型號:Mini-protean Tetra System)，美國Biorad公司；BMJ-A型包埋機(jī)；旋轉(zhuǎn)式生物組織切片儀(型號：RM2016)；顯微鏡(型號：Leica DM300)。

2 方法

2.1 制備原藥刺山柑果實(shí)加10倍95%的乙醇于80 ℃的水浴鍋加熱回流提取，30 min/次，提2次，過濾，2次濾液減壓濃縮至藥材藥液質(zhì)量比為2 ∶1。提取物濃縮干燥后經(jīng)紫外分光光度法(UV)測得總生物堿水平為32%(W/W)，高效液相色譜法(HPLC)測得鹽酸水蘇堿水平為2.2%(W/W)。

精密稱取基質(zhì)硬脂酸、月桂氮卓酮、白凡士林、單硬脂酸甘油酯作為油相，甘油與刺山柑總生物堿提取物濃縮液作為水相，十二烷基硫酸鈉、對羥基苯甲酸乙酯作為乳化劑。制備方法：將上述各相水浴加熱至90 ℃溶融，依次將水相和乳化劑加入油相中，邊加邊攪拌至完全乳化，乳膏顏色均勻、質(zhì)地細(xì)膩為乳化完全，封口備用。

2.2 小鼠SSc模型的建立、分組及給藥BALB/c小鼠90只隨機(jī)分成空白組、SSc模型組、刺山柑總生物堿藥物低(225 mg·kg-1)、中(450 mg·kg-1)、高(900 mg·kg-1)劑量給藥組及青霉胺(125 mg·kg-1)陽性藥組等6組。除空白組外，剩余幾組小鼠背部皮下注射博來霉素(BLM)(劑量0.03 g·d-1)，28 d建立SSc模型。給藥組背部外敷受試藥，陽性藥組小鼠青霉胺灌胃，空白組與模型組敷無藥乳膏基質(zhì)，以上步驟每天1次×60 d。最后一天給藥后將小鼠處死，取其給藥處皮膚組織，分成2份，1份凍存于-80 ℃，1份置于10%福爾馬林中備用。

2.3 Western blot測定β-catenin蛋白表達(dá)取小鼠皮膚，每0.10 g+1 mL RIPA裂解液，勻漿至充分裂解，12 000 r·min-1低溫離心5 min取其上清液。取適量上清用Lowry法蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按照濃度確定上樣量，使每孔蛋白上樣量一致。樣品加入5×上樣緩沖液后水浴10 min使之變性，離心2 min點(diǎn)樣至各孔于80 V電壓下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。取凝膠在200 mA電流下電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，β-catenin一抗孵育2 h，TBST洗脫3次(10 min/次)，二抗孵育1 h后再用TBST洗脫3次，加化學(xué)發(fā)光劑ECL于暗室曝光，得β-catenin蛋白條帶。將曝光后的PVDF膜取出，用膜再生液洗去一抗后重新封閉，將一抗換成β-actin內(nèi)參，重復(fù)上述步驟，得內(nèi)參條帶。用ImageJ軟件掃描條帶，以灰度值做相對蛋白表達(dá)量分析。

2.4 RT-PCR測定Wnt2蛋白表達(dá)取小鼠皮膚每0.10 g加1 mL裂解液提取總RNA(OD260/OD280≈1.8-2.0)，按照DNA/RNA濃度測定儀測定的RNA濃度加入DEPC水使每組的總RNA含量相同?？俁NA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行RT-PCR，以Rn18s作為內(nèi)參對照，95 ℃ 10min預(yù)變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃ 10 s延伸，40個循環(huán)。相對定量結(jié)果分析采用比較熒光強(qiáng)度達(dá)閾值時的循環(huán)數(shù)(Ct)值法(2-△△Ct法)，即相對表達(dá)量=2-△△Ct，△Ct=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對照組。

引物序列 ：

Rn18s:F(5′-CTATTTTGGTTTTCGGAACTGAG-3′)

Rn18s:R(5′-TTGGCAAATGCTTTCGCTCTG-3′)

Wnt2:F(5′-GGATGGCACTGGCTTCACTGTAG-3′)

Wnt2:R(5′-CCTGCCTCTCGGTCCCTGATAC-3′)

2.5 測定Wnt3a蛋白表達(dá)

2.5.1免疫組化法 將福爾馬林液中固定小鼠皮膚取出進(jìn)行蠟塊包埋、切片置5 mm于防脫載玻片，脫臘至水，按SABC(IgG)-POD試劑盒方法進(jìn)行操作(一抗：Wnt3a抗體)后于顯微鏡下攝片。用Image Pro Plus軟件進(jìn)行分析，以IOD/Area值做相對表達(dá)量分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法全部實(shí)驗(yàn)數(shù)值導(dǎo)入Excel表，統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 21.0，方差分析比較各組間均數(shù)差異，方差齊用LSD法，方差不齊時用Duunett′s T3法比較組間差異。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠皮膚中β-catenin 蛋白表達(dá)比較Western blot檢測小鼠皮膚組織β-catenin蛋白表達(dá)結(jié)果如Fig1A、B，模型組相對于空白組表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，中、高劑量受試藥劑量組以及青霉胺組相對于模型組表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。

Fig 1 Comparison of relative expression of β-catenin protein in mouse skin by Western blot (n=5)△P<0.05 vs blank group;*P<0.05 vs model group.

3.2 各組小鼠Wnt2 mRNA表達(dá)比較qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：各組小鼠皮膚組織Wnt2 mRNA的表達(dá)量如Fig2，模型組相較于空白組表達(dá)量增加(P<0.01)，與模型組相比，受試藥各組與青霉胺組表達(dá)量降低(P<0.01)。

Fig 2 Comparison of Wnt2 mRNA relative expression in mouse skin (n=6)△△P<0.01 vs blank group;**P<0.01 vs model group.

3.3 各組小鼠皮膚中Wnt3a蛋白表達(dá)比較

3.3.1免疫組化法檢測小鼠皮膚組織Wnt3a蛋白表達(dá) 結(jié)果如Fig3，模型組相對于空白組表達(dá)量明顯增加(P<0.01)，受試藥各劑量組及青霉胺組相對于模型組表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。

Fig 3 The relative expression of Wnt3a protein in mouse skin detected by immunohistochemistry (n=6)△△P<0.01 vs blank group;**P<0.01 vs model group.

3.3.2Western blot法檢測小鼠皮膚組織Wnt3a蛋白表達(dá) 結(jié)果如Fig4，模型組相對于空白組表達(dá)量明顯增加(P<0.01)，中、高受試藥劑量組以及青霉胺組相對于模型組表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。

Fig 4 Comparison of relative expression of Wnt3a protein in mouse skin by Western blot (n=5)△△P<0.01 vs the blank group;**P<0.01 vs the model group.

4 討論

SSc是一種復(fù)雜的臨床異質(zhì)性疾病，與多個器官的纖維化有關(guān)[6]。肌成纖維細(xì)胞是高度收縮的間充質(zhì)細(xì)胞，在SSc和其他纖維化疾病的纖維化發(fā)病機(jī)制中起著核心作用，研究證實(shí)Morphogen信號途徑的激活會導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞的過度表達(dá)[7-8]。Morphogen途徑包括Wnt、Notch和Hedgehog信號級聯(lián)，是胚胎發(fā)育和成人組織動態(tài)平衡的主要調(diào)節(jié)器[9]。

經(jīng)典的Wnt途徑是高度保守的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)途徑，出現(xiàn)在后生動物中，其信號傳導(dǎo)在發(fā)育，組織穩(wěn)態(tài)的維持以及受損組織的再生中起著至關(guān)重要的作用[10]。在哺乳動物中已經(jīng)描述了19種Wnt配體和10 種卷曲蛋白(FZD)受體，Wnt途徑包括經(jīng)典的Wnt /β-catenin途徑和非經(jīng)典的平面細(xì)胞極性(PCP)和Wnt /鈣途徑[11]。在細(xì)胞外沒有Wnt配體的情況下，轉(zhuǎn)錄激活因子β-catenin被胞質(zhì)“破壞復(fù)合物”(由支架蛋白腺瘤性息肉病大腸桿菌(APC)和Axin以及蛋白激酶糖原合酶激酶-3(GSK3)和酪蛋白激酶1α(CK1α)組成)降解;在有Wnt配體時，其與共受體Frizzled和LRP5/6以及胞質(zhì)蛋白Disheveled(Dvl)的結(jié)合誘導(dǎo)構(gòu)象變化，從而傳遞到Wnt受體的胞內(nèi)域。形成低聚卷曲蛋白LRP5/6復(fù)合物，用于形成活性受體的配合物。破壞復(fù)合物中β-catenin的磷酸化和降解最終被阻止，β-catenin積聚在細(xì)胞質(zhì)中，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。一旦進(jìn)入細(xì)胞核，β-catenin就可以作為靶基因中Wnt反應(yīng)元件(WRE)上T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(TCF/LEF)的共激活因子，從而傳遞Wnt轉(zhuǎn)錄程序[12]。

近年來，經(jīng)典的Wnt信號已被深刻表征為纖維化疾病中持續(xù)的成纖維細(xì)胞活化的重要介體[13]。如通過抑制Wnt3a/β-catenin信號通路可以抑制肺成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原合成[14]，Tyler等[15]通過833名SSc患者的遺傳基因和臨床數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)Wnt子網(wǎng)絡(luò)中的部分基因與肺部疾病以及與SSc發(fā)病機(jī)制有關(guān)的分子過程有關(guān)。Laetitia等[16]通過實(shí)驗(yàn)表明溶血磷脂酸(LPA1)受體阻滯劑的某些抗SSc纖維化作用可能是通過抑制Wnt信號通路中Wnt2來部分介導(dǎo)的。Wnt /β-catenin信號通路在BLM誘導(dǎo)的SSc小鼠模型中被過度激活，抑制Wnt /β-catenin信號通路的靶基因可以顯著改善SSc小鼠模型的皮膚 纖維化[17]。阻斷皮膚中的β-catenin信號傳導(dǎo)可能逆轉(zhuǎn)SSc皮膚的脂肪減少和纖維化[18]。本研究結(jié)果與其一致，SSc模型組Wnt2 mRNA和Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)量均高于空白組。本次研究結(jié)果也與本課題組前期研究結(jié)果相一致，β-catenin作為Wnt通路的重要信號因子，所以本次實(shí)驗(yàn)采用了Western blot的方法檢測其蛋白相對表達(dá)量，比采用ELISA和免疫組化更能準(zhǔn)確的蛋白定量。而免疫組化檢測Wnt3a蛋白能更加準(zhǔn)確的定位小鼠皮膚組織內(nèi)抗原的表達(dá)位置，結(jié)果表明其在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)。以上測定方法比前期課題組實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加嚴(yán)謹(jǐn)準(zhǔn)確，進(jìn)一步驗(yàn)證SSc小鼠皮膚Wnt通路被過度的激活，刺山柑總生物堿可以抑制其β-catenin、Wnt3a蛋白和Wnt2 mRNA的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后更深一步研究刺山柑總生物堿治療SSc的作用機(jī)制提供了參考。