劉 坤，邢 影，史經(jīng)昊，李自發(fā)，耿希文，魏 盛

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 1.中醫(yī)學(xué)院 2.實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355)

抑郁癥是一種常見的情緒類疾病，除抑郁、情緒低落等癥狀外還伴有認(rèn)知功能障礙。該病存在遺傳傾向，其后代患抑郁癥的概率高達(dá)40%[1]。已有研究證明母代產(chǎn)前應(yīng)激會(huì)對(duì)子代的神經(jīng)發(fā)育及認(rèn)知功能產(chǎn)生影響[2]。中醫(yī)理論認(rèn)為，肝疏泄不及[3]是抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵病機(jī)之一。舒郁膠囊作為柴胡、白芍、香附、甘草有效成分提取物組成的中成藥廣泛應(yīng)用于抑郁癥等情緒類疾病的治療[4]，有研究證實(shí)[5]其組分芍藥苷可緩解孕前應(yīng)激引起的子代抑郁癥狀，但其改善學(xué)習(xí)認(rèn)知能力的藥效研究未見報(bào)道。本研究通過社會(huì)挫敗應(yīng)激[6](social defeat stress，SDS)制備母鼠抑郁樣行為(肝疏泄不及狀態(tài))并進(jìn)行舒郁膠囊干預(yù)，通過行為學(xué)測(cè)試對(duì)子代學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，并探討舒郁膠囊通過調(diào)節(jié)CREB-BDNF信號(hào)通路改善此癥狀的神經(jīng)生化機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar子代雄性大鼠48只，體質(zhì)量(180-200)g，用于交配的雌鼠及雄鼠、造模入侵鼠均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SYXK(魯)20170022。

1.2 藥品、主要試劑及儀器舒郁膠囊(山東中醫(yī)藥大學(xué)天然藥物研究所自制)；鹽酸氟西汀分散片(禮來蘇州制藥有限公司，批號(hào)9515A)?？?BDNF抗體(1 ∶200，Sigma，AV41970)，抗-CREB抗體、抗-pCREB抗體、(1 ∶500，Abcam，ab31387、ab32096)抗GAPDH抗體(1 ∶2500，Abcam，ab9485)過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1 ∶2 000，Santa Cruz，sc-2004)。XR-SuperMaze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)、XR-XZ301曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)；電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；優(yōu)普去離子水機(jī)(成都超純科技有限公司)；5024R冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；G:BOX ChemiXR5凝膠成像分析系統(tǒng)(美國SYNGEN公司)。

2 方法

2.1 母代大鼠模型制備及行為學(xué)評(píng)價(jià)根據(jù)大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及體質(zhì)量將大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。分別為正常組(純水10 mL·kg-1·d-1)、模型組(純水10 ml·kg-1·d-1)、舒郁膠囊組(408 mg·kg-1·d-1)、氟西汀組(2.67 mg·kg-1·d-1)。造模持續(xù)4周，第1周大鼠單籠飼養(yǎng)進(jìn)行社會(huì)隔離，第2周開始進(jìn)行社會(huì)挫敗入侵實(shí)驗(yàn)[7](將入侵鼠轉(zhuǎn)移至居住鼠籠中15 min，記錄在此期間入侵鼠與居住鼠的行為。若入侵鼠對(duì)居住鼠有攀壓行為且持續(xù)時(shí)間超過2 s，則被定義為“挫敗”)，共進(jìn)行3周。造模期間同時(shí)給藥。造模后通過挫敗率及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、糖水偏好實(shí)驗(yàn)對(duì)母代大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)，篩選合格大鼠與雄性大鼠交配。

2.2 子代雄性大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)行為指標(biāo)檢測(cè)雄性子代滿2月齡后對(duì)其進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，通過物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)及Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

2.2.1物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)(Object Recognition Task，ORT) 子代大鼠于曠場(chǎng)區(qū)域(箱體尺寸：長×寬×高=40 cm×40 cm×40 cm)連續(xù)測(cè)試4 d。d 1和d 2的上午10 ∶00進(jìn)行5 min的自由探索以適應(yīng)環(huán)境。d 3將大鼠放入曠場(chǎng)中心，在靠近曠場(chǎng)一側(cè)區(qū)域墻壁放入兩個(gè)相同的物體進(jìn)行5 min訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后將大鼠放回原籠，1 h后再次將大鼠放入曠場(chǎng)區(qū)域。此時(shí)曠場(chǎng)內(nèi)放入一個(gè)與之前相同的物體(未使用過)以及一個(gè)陌生物體，記錄大鼠5 min中內(nèi)探索每個(gè)物體的時(shí)間。d 4動(dòng)物再次放入曠場(chǎng)箱中，放入一個(gè)熟悉物體及一個(gè)陌生物體,記錄大鼠在5 min內(nèi)探索每個(gè)物體的時(shí)間。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用75%酒精溶液擦拭箱體。最后根據(jù)識(shí)別指數(shù)(recognition index,RI)即探索陌生物體的時(shí)間與探索物體的總時(shí)間之比，作為物體識(shí)別的主要指標(biāo)。若RI=50%表示零偏愛，>50%則認(rèn)為大鼠更傾向于探究陌生物體，<50%表示傾向于探索熟悉物體。

2.2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris Water Maze，MWM) 水迷宮實(shí)驗(yàn)在Morris水迷宮(直徑：160 cm，高度：60 cm)中進(jìn)行,水迷宮被均分為四個(gè)象限，內(nèi)有一個(gè)平臺(tái)(直徑：12 cm，高度：35 cm)，隨機(jī)放于一個(gè)象限。測(cè)試時(shí)水深37 cm，水溫(25±2)℃。實(shí)驗(yàn)分為定位航行訓(xùn)練及空間探索測(cè)試兩部分。

定位航行訓(xùn)練：訓(xùn)練期為4 d,每天將大鼠從不同的象限面向池壁放入水中，大鼠自由游泳2 min，記錄逃避潛伏期(自開始計(jì)時(shí)至找到平臺(tái)的時(shí)間)及平臺(tái)象限停留時(shí)間。若大鼠在2 min內(nèi)未找到平臺(tái)，將大鼠放到平臺(tái)上停留15 s,其潛伏期記為2 min。

空間探索測(cè)試：d 5將平臺(tái)撤去，從任意一個(gè)象限將大鼠放入水迷宮，同時(shí)保證所有大鼠在同一入水點(diǎn)記錄并分析大鼠2 min內(nèi)逃避潛伏期、原平臺(tái)象限的停留時(shí)間。

2.3 Western blot檢測(cè)子代雄性大鼠海馬腦區(qū)蛋白行為學(xué)結(jié)束后取海馬腦區(qū)，Western blot檢測(cè)海馬內(nèi)BDNF、pCREB、CREB含量。取海馬組織內(nèi)總蛋白，蛋白定量后上樣、電泳分離、轉(zhuǎn)膜、洗膜，先后加入一抗及二抗孵育、洗滌。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像后，使用G:BOX chemiXR5成像。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組比較用單因素方差分析，連續(xù)測(cè)量的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的雙因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常組母鼠子代相比，模型組物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)1 h及24 h識(shí)別指數(shù)明顯下降(P<0.01,P<0.01);與模型組相比，氟西汀干預(yù)組1 h及24 h識(shí)別指數(shù)上升(P=0.01,P<0.01),舒郁膠囊干預(yù)組1 h及24 h識(shí)別指數(shù)上升(P<0.05,P<0.01)，見Fig1。

Fig 1 Comparison of object recognition task behaviors of maternal offsprings in different treatment groupsA:The movement track of rats in ORT (1 h retention interval);B:The movement track of rats in ORT (24 h retention interval);C:Comparison of recognition index of 1 h and 24 h retention interval of maternal offsprings in different treatment groups.1:Control progency;2:Stress progency;3:Stress+fluoxetine progency;4:Stress+shuyu progency;**P<0.01 vs Control group;#P<0.05，##P<0.01 vs Stress group.

3.2 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常組母鼠子代相比，模型組Morris 水迷宮探索期目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯下降，逃避潛伏期明顯上升(P<0.01,P<0.01)；與模型組相比，氟西汀干預(yù)組探索期目標(biāo)象限停留時(shí)間上升，逃避潛伏期明顯下降(P<0.05,P<0.01)，舒郁膠囊干預(yù)組探索期目標(biāo)象限停留時(shí)間上升，逃避潛伏期明顯下降(P<0.05,P<0.01),見Fig2。

Fig 2 Comparison of Morris water maze behavior experiment of maternal offsprings in different treatment groups during training period and exploration periodA：Comparison of target quadrant residence time in offsprings of different treatment groups in training period;B：Comparison of escape latencies in offsprings of different treatment groups in training period;C：Comparison of target quadrant residence time and escape latency of offsprings in different treatment groups in exploration period;D：The movement track of rats in MWM.1:control progency;2:Stress progency;3:Stress+fluoxetine progency;4:Stress+shuyu progency；**P<0.01 vs control group;#P<0.05，##P<0.01 vs Stress group

3.3 各組大鼠海馬腦區(qū)微觀指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果與正常組母鼠子代相比，模型組BDNF相對(duì)光密度值明顯降低 (P<0.01)；與模型組相比，氟西汀及舒郁膠囊干預(yù)組BDNF相對(duì)光密度值升高 (P<0.01,P<0.01)。各組CREB相對(duì)光密度值未表現(xiàn)出明顯差異。與正常組母鼠子代相比，模型組pCREB相對(duì)光密度值明顯降低 (P<0.01)；與模型組相比，氟西汀干預(yù)組pCREB相對(duì)光密度值升高 (P<0.01)。與正常組母鼠子代相比，模型組pCREB/CREB比值降低 (P<0.01)；與模型組相比，氟西汀及舒郁膠囊干預(yù)組pCREB/CREB比值升高(P<0.01，P<0.01),見Fig3。

Fig 3 Comparison of relative optical density values of BDNF,CREB and pCREB in hippocampus of maternal offsprings in different treatment groupsA：Comparison of the relative optical density values of BDNF,CREB,pCREB and pCREB/CREB in maternal offspring hippocampus of different treatment groups；B：Electrophoretic bands of BDNF,CREB,pCREB and GAPDH in maternal offspring hippocampus of different treatment groups；1:control progency;2:Stress progency;3:Stress+fluoxetine +progency;4:stress+shuyu progency;**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs Stress group

4 討論

本研究采用更為接近社會(huì)環(huán)境應(yīng)激的社會(huì)挫敗應(yīng)激范式制備母鼠孕前抑郁樣行為(肝疏泄不及狀態(tài))，并進(jìn)行舒郁膠囊干預(yù)后，各組成年雄性子代的ORT、MWM等行為學(xué)指標(biāo)及海馬腦區(qū)BDNF、pCREB等微觀指標(biāo)的表達(dá)結(jié)果顯示，母鼠孕前應(yīng)激會(huì)降低成年雄性子代學(xué)習(xí)記憶能力，此負(fù)性影響可經(jīng)中藥舒郁膠囊干預(yù)而得到改善，其作用的微觀機(jī)制可能與舒郁膠囊上調(diào)海馬內(nèi)pCREB、BDNF的表達(dá)，調(diào)節(jié)CREB-BDNF通路有關(guān)。

母鼠孕前應(yīng)激會(huì)使子代產(chǎn)生抑郁行為[8]并可以導(dǎo)致子代認(rèn)知缺陷[9]，已有研究證實(shí)母鼠孕前應(yīng)激對(duì)子代的負(fù)性影響可能與下調(diào)海馬區(qū)pCREB水平，并降低BDNFmRNA的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平[10]有關(guān)。海馬是參與學(xué)習(xí)與記憶的重要腦區(qū)[11]，BDNF除了發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用外，在調(diào)節(jié)海馬長時(shí)程增強(qiáng)中也起到重要作用,是抑郁癥相關(guān)神經(jīng)生理學(xué)研究熱點(diǎn)[12]。BDNF是CREB的經(jīng)典下游靶基因，CREB是認(rèn)知功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵介質(zhì)[13]，其磷酸化形式pCREB可以改善大鼠認(rèn)知功能[14]；而pCREB可以促進(jìn)BDNF的表達(dá)[15]。有研究報(bào)道抗抑郁藥物可以激活細(xì)胞膜的腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)，催化ATP產(chǎn)生cAMP,cAMP可激活蛋白激酶A使CREB磷酸化[16],進(jìn)而通過CREB-BDNF通路發(fā)揮作用。故 CREB-BDNF通路在調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)認(rèn)知功能中發(fā)揮重要作用。

舒郁膠囊主要由柴胡皂苷、芍藥苷、香附揮發(fā)油等組成，是臨床治療抑郁癥的有效藥物，而我們的研究發(fā)現(xiàn)，舒郁膠囊具有改善母代孕前社會(huì)挫敗應(yīng)激導(dǎo)致的成年雄性子代學(xué)習(xí)記憶減退的效果。以往對(duì)舒郁膠囊藥效機(jī)制的研究多基于其改善抑郁樣表型的作用開展，而對(duì)其干預(yù)學(xué)習(xí)記憶的藥效鮮見報(bào)道。我們的研究發(fā)現(xiàn)舒郁膠囊可以通過上調(diào)孕前社會(huì)應(yīng)激制備的肝疏泄不及大鼠模型子代海馬BDNF表達(dá)，提高pCREB/CREB比值，行為學(xué)結(jié)果顯示母代孕前社會(huì)挫敗應(yīng)激導(dǎo)致的子代學(xué)習(xí)記憶能力減退的癥狀得到改善。因此，舒郁膠囊對(duì)于子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的調(diào)節(jié)作用可能是通過CREB-BDNF通路實(shí)現(xiàn)的。

本研究結(jié)果為調(diào)肝方藥舒郁膠囊改善學(xué)習(xí)記憶作用的中樞機(jī)制提供了方向和支持，并為擴(kuò)展該藥物的臨床應(yīng)用范圍奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。然而，中藥可從多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用，僅從單一方面闡發(fā)舒郁膠囊改善學(xué)習(xí)記憶能力是不夠的。舒郁膠囊在提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力中發(fā)揮作用的具體部位及作用的特定神經(jīng)環(huán)路還需要進(jìn)一步的探索和論證。