李夢(mèng)秋，黃 娟，鄒國(guó)發(fā)，李坤平，馮毅凡，明 露，高振虎，陳艷芬

(廣東藥科大學(xué) 1.中藥學(xué)院、2.中醫(yī)藥研究院、3.新藥開發(fā)中心，廣東 廣州 510006)

高良姜是姜科植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根莖，產(chǎn)于中國(guó)東南部(廣東、廣西、海南)，性熱、味辛，溫胃止嘔、散寒止痛，臨床常用于治療脘腹冷痛、噯氣吞酸、胃寒嘔吐等消化系統(tǒng)疾病。研究表明，高良姜具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，除了胃痛腹痛，對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)等疼痛也具有顯著療效[1-2]。盡管在體內(nèi)研究中已經(jīng)證實(shí)了高良姜的鎮(zhèn)痛作用，但其潛在的鎮(zhèn)痛作用的分子機(jī)制仍不清楚。瞬時(shí)受體電位通道蛋白1(TRPA1)是瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential，TRP)超家族的一員，是一種對(duì)鈣離子具有高通透性的非選擇性陽(yáng)離子通道，通常在小直徑的初級(jí)傳入神經(jīng)纖維中表達(dá)，與感知外界傷害性刺激相關(guān)，可被各種外源性刺激物激活，如有害的低溫、芥子油中的異硫氰酸烯丙酯、過氧化氫和不飽和醛等內(nèi)源性反應(yīng)物質(zhì)[3]。研究表明[4]，TRPA1通過感覺神經(jīng)激活參與痛覺和炎性疼痛的感知，TRPA1通道的激活可增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，最終導(dǎo)致傷害性或傷害性反應(yīng)。因此，以TRPA1為目標(biāo)蛋白成為開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥的研究熱點(diǎn)。在前期研究中，我們采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)TRPA1通道的HEK-293T細(xì)胞系[5]。本研究采用TRPA1-HEK293T細(xì)胞模型，體外研究高良姜是否對(duì)TRPA1表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，以期闡述中藥高良姜溫中止痛的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1細(xì)胞株 人胚腎(HEK-293T)細(xì)胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將TRPA1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK-293T細(xì)胞中，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TRPA1通道的TRPA1-HEK293T細(xì)胞株。由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，♀♂各半，體質(zhì)量(200 ± 20)g，合格證號(hào)SCXK(粵)：2013-0034，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)動(dòng)物房，飼養(yǎng)條件為恒溫(24 ± 2)℃，相對(duì)濕度50%-70%。

1.1.3藥物與試劑 高良姜飲片(康美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：160202851)；高良姜黃酮部位、二苯基庚烷部位、揮發(fā)油部位由本實(shí)驗(yàn)室自制[6]；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclon公司)；總RNA提取試劑TRIzol(Invitrogen公司)；GoScriptTMReverse Transcription試劑盒(Invitrogen公司)；兔多克隆抗體TRPA1(Abcam公司)；二抗(羊抗兔)HRP標(biāo)記(JACKSOM)；兔多克隆抗體β-actin(萬(wàn)類生物科技有限公司)；cAMP ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司)；EnlightTMWestern 特異發(fā)光檢測(cè)試劑盒(北京英格恩生物科技有限公司)；色譜甲醇(瑞典歐普森公司)；色譜乙腈(瑞典歐普森公司)；高良姜素(成都曼思特生物科技有限公司)；高良姜二芳基庚烷A參照化合物由廣東藥科大學(xué)新藥開發(fā)中心自制，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為1-苯基-7-(3′-甲氧基-4′-羥基)苯基-5-醇-3-庚酮，按HPLC面積歸一化法計(jì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于98.0%[7]。

1.1.4主要儀器 T100TM PCR儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品新加坡有限公司)；TOCAN領(lǐng)成全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(上海領(lǐng)成生物技術(shù)有限公司)；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Biotek Instruments公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) TRPA1-HEK293T細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，使用10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，在含有95%濕度和5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中以37 ℃恒溫培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2含藥血清的制備 稱取高良姜500 g，加水淹沒中藥浸泡30 min；煎煮至水沸改用溫火，30 min后傾出藥液，雙層紗布濾過，重復(fù)共煎煮兩次，合并兩次濾液。水浴90 ℃，濃縮至500 mL，得生藥含量為1 mg·L-1高良姜水煎液。SD大鼠隨機(jī)分為高良姜給藥組和空白對(duì)照組，禁食12 h，給藥組以10 mL·kg-1灌胃體積給藥，空白組給予同等劑量的蒸餾水，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，乙醚麻醉，眼眶采血，4 ℃離心，得空白血清和高良姜含藥血清，56 ℃水浴30 min滅活，微孔濾膜過濾，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3MTT法檢測(cè)高良姜含藥血清對(duì)TRPA1-HEK293T細(xì)胞增殖的影響 待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，0.25%胰酶-EDTA常規(guī)消化，1 000 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為7.5×108個(gè)·L-1，96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入180 μL細(xì)胞懸液。于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h-18 h，待細(xì)胞貼壁后，將平板中培養(yǎng)液吸去，每孔加入空白血清或各濃度(20%、15%、10%、5%、2.5%)含藥血清，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。每孔加入20 μL 5 g·L-1MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)，將孔內(nèi)的液體小心吸走，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，至結(jié)晶全部溶解，酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm測(cè)定每孔的OD值，計(jì)算各給藥濃度下細(xì)胞的相對(duì)活性。計(jì)算公式：細(xì)胞的相對(duì)活性/%=(各濃度實(shí)驗(yàn)組平均OD值/各濃度對(duì)照組平均OD值)×100%。

1.2.4RT-PCR法檢測(cè)TRPA1 mRNA的表達(dá) 6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，分組給予不同處理，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后收集細(xì)胞。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA后，按逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒說明書擴(kuò)增目的基因，PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，共循環(huán)35次。以β-actin為內(nèi)參，引物如下：TRPA1，F(xiàn):5′-AACCGCTAGAGCTCCTCAA-3′，R:5′-GAGGAATAAGGGCAACACGA-3′，399 bp；β-actin，F(xiàn):5′-GACCCAGATCATGTTTGGACAC-3′，R:5′-GCAGTAATCTCCTTCTGCATCC-3′，600 bp。將DNA樣品8 μL與樣品緩沖液2 μL混合，加入凝膠點(diǎn)樣孔，120 V下1 %瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照分析，測(cè)定電泳條帶光密度值，計(jì)算TRPA1和β-actin光密度比值相對(duì)值作為半定量指標(biāo)。

1.2.5Western blot 法檢測(cè)TRPA1蛋白的表達(dá) 6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，分組給予不同處理，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后收集細(xì)胞。提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒定量，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)到NC膜上，剪取目的蛋白條帶，并在室溫下用含有5%脫脂乳的封閉緩沖液封閉2 h。用抗TRPA1(1:250)和兔抗人β-actin(1 ∶1 000)的一抗在4 ℃孵育過夜，然后用HRP連接的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗在室溫下孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光Ecl法檢測(cè)目的蛋白，并用Image J進(jìn)行圖像分析。

1.2.6ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞cAMP濃度 分別為用5%、10%、15% 3個(gè)濃度的高良姜含藥血清和空白血清組，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。棄培養(yǎng)基，常規(guī)消化，收集細(xì)胞沉淀，重懸，破碎細(xì)胞，4 ℃ 600×g離心10 min，吸取上清。根據(jù)cAMP ELISA 試劑盒說明，檢測(cè)HEK293T-TRPA1細(xì)胞cAMP水平，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm。

1.2.7激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度 實(shí)驗(yàn)分為空白含藥血清組、15%高良姜含藥血清組、10%高良姜含藥血清組和5%高良姜含藥血清組，每組細(xì)胞培養(yǎng)于激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后，每組分別給藥處理36 h，D-Hanks溶液沖洗3次，終濃度10 μmol·L-1的Fluo-3/AM、0.1% F-127的D-Hanks溶液37 ℃避光負(fù)載30 min，D-Hanks溶液沖洗3次，洗去多余的染料。直接取各組細(xì)胞皿置激光共聚焦顯微鏡的載物臺(tái)上，以488 nm的氬激光激發(fā)Fluo-3產(chǎn)生綠色熒光，觀察各皿中細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞中Ca2+的熒光強(qiáng)度及分布變化。采集圖像，并采用FV10-ASW1.7圖像分析軟件分析計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。

1.2.8HPLC法分析高良姜含藥血清成分

1.2.8.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱量高良姜素對(duì)照品和二芳基庚烷A對(duì)照品10 mg，分別置于25 mL棕色量瓶中，色譜甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液(含高良姜素0.4 g·L-1，含二芳基庚烷A 0.4 g·L-1)。

1.2.8.2 血清樣品的處理 將空白組和高良姜給藥組的大鼠血清分別混合，混勻后各精密吸取0.5 mL，加入0.75 mL色譜純乙腈，在渦旋混合器上振蕩2 min使充分混合，10 000 r·min-1的速度離心15 min，取上清液置于2 mL EP管中，用氮?dú)鉂饪s吹干后加入120 μL色譜甲醇充分溶解，10 000 r·min-1的速度離心5 min，吸取上清液0.45 μm微孔濾膜過濾，待測(cè)。

1.2.8.3 色譜條件 色譜柱：Inertsil?ODS-3柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃，流動(dòng)相：A液為乙腈，B液為0.2%磷酸水溶液。等度洗脫程序:0-20 min，50% 乙腈，體積流量：1 mL·min-1。檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果

2.1 高良姜含藥血清對(duì)TRPA1-HEK293T細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示高良姜各濃度含藥血清(20%，15%，10%，5%，2.5%)的OD值和同濃度的空白血清組比較均無明顯差異，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活性百分率分別為0.987，1.038，1.071，1.161，1.111。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)成梭形，排列緊密，細(xì)胞透明，折光性好，界限清晰(Fig1)。參考實(shí)驗(yàn)室既往研究經(jīng)驗(yàn)，后續(xù)選擇15%、10%、5% 3種血清濃度作為受試含藥血清濃度。見Fig1。

Fig 1 Effect of A. officinarum medicated serum on growth of TRPA1-HEK293T cells in vitro A:OD n=4);B:Morphological changes (400×).

2.2 高良姜含藥血清對(duì)TRPA1 mRNA表達(dá)的影響RT-PCR 結(jié)果顯示(Fig2A)，與空白血清組比較，15%高良姜組、10%高良姜組、5%高良姜組TRPA1 mRNA表達(dá)均下降，其中10%高良姜組、15%高良姜組TRPA1 mRNA表達(dá)差異有顯著性(P<0.05)，5%高良姜組差異不明顯。結(jié)果提示高良姜能夠在體外下調(diào)TRPA1-HEK293T細(xì)胞的TRPA1 mRNA的表達(dá)。

2.3 高良姜含藥血清對(duì)TRPA1蛋白表達(dá)的影響如Fig2B所示，與空白血清組比較，15%高良姜組、10%高良姜組、5%高良姜組TRPA1蛋白表達(dá)下降，尤其以10%高良姜組TRPA1蛋白表達(dá)下降明顯(P<0.05)，5%、15%高良姜組則差異不明顯。

Fig 2 Effect of A. officinarum serum on expression of TRPA1 mRNA and n=3)A:The expression of TRPA1 mRNA;B:The expression of TRPA1 protein.*P<0.05 vs the blank serum group

2.4 高良姜含藥血清對(duì)cAMP含量的影響根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，曲線方程為Y =1/(0.0824X+3.596)，R2=0.9944，將受試樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算出各樣品的cAMP濃度(Fig3A)。結(jié)果顯示，與空白血清組比較，15%高良姜組、10%高良姜組、5%高良姜組細(xì)胞內(nèi)cAMP含量均有增高，其中15%高良姜組和10 %高良姜組差異有顯著性(P<0.05)，5%高良姜組差異不明顯。結(jié)果表明，高良姜能夠提高HEK293T-TRPA1細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度。

2.5 高良姜含藥血清對(duì)Ca2+濃度的影響Fluo-3/AM進(jìn)入細(xì)胞后，酯基被水解掉，F(xiàn)luo-3與細(xì)胞內(nèi)Ca2+的結(jié)合，在特定激發(fā)波長(zhǎng)的作用下發(fā)出綠色熒光，其熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。與空白血清組相比較，15%、10%、5%高良姜組均明顯降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(P<0.01)，提示高良姜可能通過調(diào)控TRPA1通道，從而阻斷Ca2+的內(nèi)流(Fig3B)。

Fig 3 Effect of A. officinarum serum on concentration of cAMP (A)and Ca2+ (B) n=3)**P<0.01 vs blank group

2.6 高良姜有效部位對(duì)TRPA1 mRNA表達(dá)的影響以2%乙醇作為有效部位的溶劑，故對(duì)照組為2%乙醇。分別以2%乙醇、高良姜黃酮部位組(20、10、5 mg·L-1)和二芳基庚烷部位(40、20、10 mg·L-1)給藥處理HEK293T-TRPA1細(xì)胞36 h。RT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，黃酮類和二芳基庚烷類呈現(xiàn)抑制TRPA1 mRNA表達(dá)的趨勢(shì)，其中黃酮類20 mg·L-1和二芳基庚烷類40 mg·L-1具有顯著的抑制作用(Fig4)，提示高良姜調(diào)節(jié)TRPA1信號(hào)通路的主要物質(zhì)基礎(chǔ)可能是黃酮類和二芳基庚烷類成分。

Fig 4 The inhibitory effect of A. officinarum total flavonoids (A),diarylheptane (B)and volatile oil (C)on expression of TRPAl mRNA n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.7 高良姜含藥血清的成分分析精密吸取高良姜素和二芳基庚烷A對(duì)照品溶液及空白組和高良姜給藥組血清供試液10 μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行HPLC分析。高良姜素和二芳基庚烷A、高良姜提取液、空白血清、含藥血清、含藥血清加標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜見Fig5。高良姜二芳基庚烷A和高良姜素分別在11.053 min和15.052 min出峰。對(duì)比Fig5B和Fig5C，空白血清在11.053 min和15.052 min兩處基線較為平穩(wěn)，無色譜峰出現(xiàn)，高良姜含藥血清則在兩處均有色譜峰出現(xiàn)。此情況下，在高良姜含藥血清中加入適量高良姜素和高良姜二芳基庚烷A標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣得到Fig5E，相較于高良姜含藥血清圖譜，11.053 min和15.052 min兩處色譜峰峰高均有增長(zhǎng)，可推斷高良姜素和二芳基庚烷A為高良姜藥材的入血成分。

Fig 5 Representative chromatogram by HPLCA:Diarylheptane A and galangin standard;B:Alpinia officinarum extract;C:Blank serum;D:A. officinarum medicated serum;E:A. officinalis serum add double standard.Retention time of diarylheptane A and galangin was 11.053 min (1)and 15.052 min (2)respectively

3 討論

血清藥理學(xué)最初由Tashino于1984年命名[8]，是指給動(dòng)物口服藥物或藥物的混合物，在一定時(shí)間后采集血液分離血清，然后使用含藥血清進(jìn)行藥物或藥物復(fù)方作用的體外實(shí)驗(yàn)研究[9]。該方法更適合中藥的體外研究，首先，避免了原料藥所含雜質(zhì)對(duì)結(jié)果的干擾[10]；其次，藥物通過口服途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)過吸收和代謝等一系列生物轉(zhuǎn)化過程，機(jī)體血清中所含的藥物成分可能為體內(nèi)直接作用物質(zhì)[11]。近年研究表明，在中藥藥理體外實(shí)驗(yàn)中，含藥血清模擬了體內(nèi)的藥物狀態(tài)，通過高效液相色譜法指認(rèn)含藥血清中的藥源性成分[12-14]，血清藥理學(xué)與血清藥化學(xué)研究相結(jié)合，對(duì)于研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義，為闡明中藥藥理作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[15]。

TRPA1是瞬時(shí)受體電位離子通道家族中的一員，被認(rèn)為是一種冷刺激的感受器，可被各種外源性刺激物，特別是有害的低溫激活。同時(shí)，TRPA1在痛覺產(chǎn)生及痛覺敏感性增強(qiáng)的病理過程中也發(fā)揮重要作用，目前是抗炎和鎮(zhèn)痛治療的主要靶點(diǎn)[16]?！昂邿嶂?，熱者寒之”，中藥高良姜作為一種常用的溫里藥，臨床主要用于脘腹冷痛、噯氣吞酸、嘔吐泄瀉等里寒證的治療，課題組的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明高良姜具有明顯的溫中止痛作用。為了體外研究高良姜對(duì)TRPA1信號(hào)通路的影響，本實(shí)驗(yàn)室在前期構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)TRPA1通道的HEK-293T細(xì)胞模型[5]。因此，本研究主要基于冷覺和痛覺感受器TRPA1與中藥寒熱藥性理論的聯(lián)系，探究高良姜體外對(duì)TRPA1信號(hào)通路的影響，揭示高良姜溫中止痛的分子作用機(jī)制。

首先，高良姜含藥血清的RT-PCR結(jié)果表明，與空白血清組相比，15%高良姜含藥血清組、10%高良姜含藥血清組TRPA1 mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)；蛋白表達(dá)結(jié)果表明，與空白血清組比較，10%高良姜含藥血清組的TRPA1蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，提示溫里藥高良姜可能通過下調(diào)冷覺感受蛋白TRPA1的表達(dá)而發(fā)揮溫中散寒作用。其次，我們探討了高良姜對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及cAMP濃度的影響。Ca2+作為機(jī)體內(nèi)的第二信使，參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放、肌肉(包括骨骼肌、平滑肌)收縮、激素分泌、以及細(xì)胞的分化、凋亡和死亡等過程。研究顯示，TRPA1通道可以被傷害性冷刺激(<17 ℃)激活，激活后以Ca2+進(jìn)入的方式將冷覺信息傳入中樞或引起外周肌肉痙攣收縮疼痛。本研究結(jié)果顯示，與空白血清組相比較，15%高良姜組、10%高良姜組、5%高良姜組均能明顯降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(P<0.01)，提示高良姜可能通過調(diào)控TRPA1通道而阻斷Ca2+內(nèi)流。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是機(jī)體內(nèi)另一個(gè)重要的第二信使，參與和調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、基因表達(dá)、激素調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)以及細(xì)胞增殖和分化等生理及病理作用[17]。同時(shí)，cAMP被認(rèn)為是與中醫(yī)的陰陽(yáng)(寒熱)密切相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)第二信使，在虛寒狀態(tài)下，cAMP含量降低，虛熱狀態(tài)下，cAMP含量升高，常常以cAMP作為闡釋溫里藥溫?zé)崴幮员举|(zhì)的重要指標(biāo)之一。高良姜含藥血清的ELISA結(jié)果表明，與空白血清組比較，15%高良姜組、10%高良姜組、5%高良姜組細(xì)胞內(nèi)cAMP含量均增高，其中15%高良姜組和10%高良姜組差異有顯著性(P<0.05)，提示高良姜的溫中散寒作用也與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度有關(guān)。

化學(xué)研究表明，高良姜的主要化學(xué)成分是黃酮類、二芳基庚烷類、揮發(fā)油類等[18]。本研究還初步探討了高良姜3類主要成分對(duì)TRPA1 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃酮類和二芳基庚烷類對(duì)高良姜TRPA1 mRNA表達(dá)具有抑制趨勢(shì)。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中發(fā)現(xiàn)，高良姜黃酮部位和二芳基庚烷部位是高良姜治療脾胃寒證相關(guān)疾病的主要有效部位，其中胃腸解痙作用以黃酮類較強(qiáng)，鎮(zhèn)痛作用以二芳基庚烷部位更強(qiáng)[6]。為了進(jìn)一步確定高良姜調(diào)節(jié)TRPA1信號(hào)通路的物質(zhì)基礎(chǔ)，采用高效液相色譜法對(duì)高良姜的入血成分進(jìn)行了化學(xué)分析。結(jié)果表明，高良姜素和二芳基庚烷A是高良姜的主要入血成分。

綜上所述，高良姜作為一種溫里藥，溫中散寒止痛是其最重要的功效之一，體外實(shí)驗(yàn)表明其溫中止痛作用機(jī)制可能與調(diào)控TRPA1信號(hào)通路，從而阻斷Ca2+內(nèi)流，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度等有關(guān)，其對(duì)TRPA1離子通道的具體調(diào)控機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)值得進(jìn)一步探討。