盧睿瑾，杜玉梅，黃世瑩，唐加峰,3，張 滔,3，，何 爽，徐 航,，陳地龍,3，冉建華，李 靜

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室、2.公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，重慶 400016；3.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404120；4.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，重慶 400016)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，每年導(dǎo)致近70萬(wàn)人死亡，是世界上第四大致命癌癥。在過(guò)去的十年里，隨著結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年升高，雖然很多新興化療藥物的使用延長(zhǎng)了晚期結(jié)直腸癌患者的平均存活時(shí)間，但患者通常在3年內(nèi)死亡[1]。目前，結(jié)直腸癌的治療方式主要是以手術(shù)為主的綜合治療，但術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因。在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的治療方面，西妥昔單抗和伊立替康等常用藥物取得了較好的臨床療效，但容易發(fā)生耐藥[2]。不良的治療結(jié)果提示需要更好地理解導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的機(jī)制。

中藥鴉膽子為苦木科植物鴉膽子的干燥成熟果實(shí)，始載于《本草綱目拾遺》，又名老鴉膽、苦參子等。性寒味苦，具有清熱解毒、抗腫瘤，抗瘧疾等作用[3]。鴉膽子苦醇(brusatol，BRU)是一種從鴉膽子油中提取的重要化合物，同時(shí)具有多種生物學(xué)效應(yīng)，包括抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、減少瘧疾對(duì)位點(diǎn)的復(fù)制、減輕炎癥和抵抗病毒入侵等[4]。目前已有研究報(bào)道中藥鴉膽子苦醇對(duì)肝癌[5]、胰腺癌[6]和鼻咽癌[7]等多種腫瘤有抑制作用。但對(duì)結(jié)直腸癌的研究報(bào)道甚少，且作用機(jī)制尚不明確。所以本研究擬探討鴉膽子苦醇對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響和可能的作用機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)和新藥的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞由課題組實(shí)驗(yàn)平臺(tái)提供。

1.2 藥物與試劑鴉膽子苦醇由三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校饋贈(zèng)。高糖培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，南美胎牛血清(10270-106,Gibco)購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，二甲基亞砜(DMSO)、RIPA裂解液強(qiáng)(P0013B)、青-鏈霉素(C0222)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0010S)和蛋白酶磷酸酶抑制劑(P1048)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PAGE凝膠快速制備試劑盒和無(wú)蛋白快速封閉液均購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。一抗抗體MMP2(40994S)、MMP9(13667S)購(gòu)自美國(guó)CST公司，RhoA(AF2179)、ROCK1(AF1795)和ROCK抑制劑(Y37632)購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司，二抗抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8,HY-K0301)購(gòu)自MCE公司。Transwell小室(孔徑8.0 μm)和Matrigel膠(356234)均購(gòu)于Corning公司。

1.3 儀器恒溫孵箱(Thermo)；高速臺(tái)式離心機(jī)；低溫高速離心機(jī)(平凡儀器，TGL-185)；M450酶標(biāo)測(cè)定儀、凝膠成像系統(tǒng)、Western blot電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；DMi8倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HCT-116細(xì)胞復(fù)蘇后，在DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的孵箱中，每48-72 h傳代1次。

2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HCT-116細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×103/孔，平鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)基。將實(shí)驗(yàn)分為3組，每組3個(gè)復(fù)孔。空白對(duì)照組：不接種細(xì)胞，不加入BRU，僅含有DMEM完全培養(yǎng)基；對(duì)照組：僅接種細(xì)胞和DMEM完全培養(yǎng)基，不加入BRU；實(shí)驗(yàn)組：接種的細(xì)胞加入含終濃度為2.5、5、10、20、40、80、160、320 nmol·L-1BRU的DMEM完全培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，將10 μL CCK-8的工作液分別加入每孔中，置于37 ℃孵育2 h。在450 nm處測(cè)定其吸光度值(A)。計(jì)算24、48、72 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，抑制率%=(A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/(A對(duì)照組-A空白對(duì)照組)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)用胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116細(xì)胞,將細(xì)胞計(jì)數(shù)后，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞于6孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿后,用滅菌的200 μL槍頭在細(xì)胞單層的中央?yún)^(qū)域劃一道直線劃痕，PBS洗滌后，添加含不同終濃度BRU(3、6 nmol·L-1)的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，對(duì)照組則加入含等體積的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，每組取一盤(pán)細(xì)胞在劃痕后立即在倒置顯微鏡下觀察、拍照，其余細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下觀察，并隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照，用ImageJ軟件計(jì)算劃痕面積，并計(jì)算各組的相對(duì)遷移率，相對(duì)遷移率/% =(各藥物組0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/(對(duì)照組0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)×100%。

2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)用無(wú)血清的DEME培養(yǎng)基按8 ∶1的比例稀釋Matrigel膠并充分混勻,將混合液均勻鋪于Transwell小室膜上,每孔100 μL，置于37 ℃的條件下 4 h，待其凝固。用胰蛋白酶消化HCT-116細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后,在Transwell小室的上室中每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞和含不同終濃度BRU(0、3、6 nmol·L-1)的無(wú)血清培養(yǎng)基。在每孔的下室加入500 μL DMEM(含20%胎牛血清)培養(yǎng)基,置于孵箱中培養(yǎng)24 h后,用棉花輕輕擦掉上室中未侵襲的細(xì)胞，室溫下用4%多聚甲醛固定小室的底部15 min,PBS漂洗1-2次,結(jié)晶紫染色15 min,顯微鏡下每組隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并拍照。

2.5 Western blot檢測(cè)將HCT-116細(xì)胞分為3組，分別加入含不同終濃度BRU(0、3、6 nmol·L-1)的DMEM完全培養(yǎng)基,放細(xì)胞孵育箱24 h后收集細(xì)胞；再將HCT-116細(xì)胞分為4組，分別為對(duì)照組，加藥組(BRU)，抑制劑組(Y27632)，加藥和抑制劑組(BRU+Y27632)，先后提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在室溫條件下，用無(wú)蛋白快速封閉液封閉15 min，分別加入稀釋比例均為1∶1 000的一抗MMP2、MMP9、RhoA、ROCK1和GAPDH，置于4 ℃冰箱的搖床過(guò)夜。用TBST液洗滌3次后,加入適量稀釋比例為1 ∶10 000的二抗，在室溫狀態(tài)下放入搖床孵育1 h，再用TBST液洗滌3次，使用ECL系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 BRU對(duì)HCT-116細(xì)胞增殖的影響如Fig1所示，使用CCK-8法檢測(cè)不同濃度的BRU作用于HCT-116細(xì)胞24、48、72 h后，與對(duì)照組相比，HCT-116細(xì)胞的抑制率隨著B(niǎo)RU作用時(shí)間和濃度的增加而逐漸增加。計(jì)算BRU作用于HCT-116細(xì)胞24、48、72 h的IC50分別為16.62、15.11、13.42 nmol·L-1，24 h的IC10為6 nmol·L-1，所以后續(xù)選用6 nmol·L-1作為最大藥物處理濃度。

Fig 1 Effect of BRU on proliferation of HCT-116 cells by

3.2 BRU抑制HCT-116細(xì)胞的遷移劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BRU對(duì)HCT-116細(xì)胞遷移能力的影響。如Fig2所示，使用0(對(duì)照組)、3、6 nmol·L-1的BRU處理HCT-116細(xì)胞24 h后，各組的相對(duì)遷移率為(49.3±1.5)%、(31.2±10.4)%、(8.9±2.6)%。與對(duì)照組相比，加藥組細(xì)胞遷移率逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示BRU能夠明顯抑制HCT-116細(xì)胞的遷移。

Fig 2 Effect of BRU on HCT-116 on migration of colorectal cancer cells by wound healing n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control

3.3 BRU抑制HCT-116細(xì)胞的侵襲將Matrigel膠稀釋后均勻鋪在Transwell小室的上室中，用于檢測(cè)HCT-116細(xì)胞的侵襲能力。如Fig3所示，使用0(對(duì)照組)、3、6 nmol·L-1的BRU處理HCT-116細(xì)胞后，各組的每視野下侵襲過(guò)膜細(xì)胞數(shù)為(760±26)個(gè)、(532±57)個(gè)、(353±8)個(gè)。與對(duì)照組相比，加藥組中HCT-116細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示BRU能夠顯著抑制HCT-116細(xì)胞的侵襲。

Fig 3 Effect of BRU on invasion of HCT-116 colorectal cancer cells by Transwell n=3)**P<0.01 vs control

3.4 BRU對(duì)HCT-116細(xì)胞中遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP2、MMP9表達(dá)的影響用不同濃度的BRU(0、3、6 nmol·L-1)處理HCT-116細(xì)胞24 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(即0 nmol·L-1BRU處理組)相比，經(jīng)BRU處理后的加藥組中的MMP2、MMP9蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示BRU可以抑制遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)。見(jiàn)Fig4。

3.5 BRU對(duì)RhoA/ROCK1通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響用不同濃度的BRU(0、3、6 nmol·L-1)處理HCT-116細(xì)胞24 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(即0 nmol·L-1BRU處理組)相比，經(jīng)BRU處理后的加藥組中的RhoA、ROCK1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示BRU可以抑制RhoA、ROCK1蛋白的表達(dá)，見(jiàn)Fig5。

Fig 4 Effect of BRU on expression of MMP2,MMP9 protein in HCT-116 cells n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs Control

Fig 5 Effect of BRU on expression of RhoA,ROCK1 protein in HCT-116 cells n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs Control

3.6 BRU和Y27632對(duì)ROCK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響用BRU(6 nmol·L-1)和ROCK抑制劑分別處理HCT-116細(xì)胞，再用BRU和Y27632共同處理HCT-116細(xì)胞后，將細(xì)胞收集進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)BRU或Y27632處理后的加藥組中的RhoA、ROCK1、MMP2和MMP9蛋白的相對(duì)表達(dá)量均減少，經(jīng)BRU和Y27632共同處理后的HCT-116細(xì)胞中RhoA、ROCK1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)量減少更為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果提示BRU和Y27632一樣，都能抑制ROCK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，見(jiàn)Fig6。

Fig 6 Effect of BRU and Y27632 on expression of ROCK signaling pathway related proteins in HCT-116 cells n=3)**P<0.01 vs Control

4 討論

結(jié)直腸癌(CRC)是全球第三大最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是全球第四大癌癥相關(guān)的死亡原因。結(jié)直腸癌是一種多因素的疾病，與遺傳、環(huán)境和生活方式等多種危險(xiǎn)因素有關(guān)[8]。目前結(jié)直腸癌的預(yù)后仍然較差，約50%的患者在手術(shù)后2年內(nèi)死亡[9]。中醫(yī)學(xué)里無(wú)結(jié)直腸癌的說(shuō)法，從其發(fā)病的特征和臨床表現(xiàn)分析，通常將其歸于“腸積”、“腸風(fēng)”、“臟毒”等病的范疇。中醫(yī)認(rèn)為外感濕熱或脾胃損傷導(dǎo)致水濕內(nèi)生，郁久化熱，是結(jié)直腸癌發(fā)病的重要原因。本病的主要病因是濕熱，故以清熱利濕、化瘀解毒為治療原則[10]。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直在研究中草藥的天然產(chǎn)品作為癌癥治療的潛力藥物。研究中藥對(duì)結(jié)直腸癌的治療或許將是提高其預(yù)后的新思路。

鴉膽子作為一種常用中藥,性苦味寒，入大腸經(jīng)、肝經(jīng)，具有清熱、燥濕、解毒、殺蟲(chóng)、止痢的作用,是一種非常有開(kāi)發(fā)價(jià)值的藥物。鴉膽子苦醇(BRU)是一種從鴉膽子籽中提取的類黃酮類化合物，最近的研究證明，BRU可以抑制肺癌細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路，從而抑制肺癌細(xì)胞的抗氧化功能，增加放化療造成的DNA損傷，提高化療藥物的療效[11]。同時(shí)，Nrf2作為維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，已被證明與癌癥的侵襲性增殖等惡性表型有關(guān)[12]。因此，作為Nrf2的特效抑制劑，BRU在多種癌癥中的腫瘤抑制作用越來(lái)越受到重視。臨床試驗(yàn)表明，BRU可有效抑制胰腺癌、肝癌、前列腺癌等癌細(xì)胞的增殖,是潛在的天然抗腫瘤藥物[13]。但其對(duì)結(jié)腸癌的影響還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文旨在研究BRU對(duì)結(jié)腸癌遷移和侵襲的影響和作用機(jī)制。

本研究采用CCK-8法檢測(cè)了BRU對(duì)HCT-116細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果表明HCT-116細(xì)胞的增殖能被BRU顯著抑制，且呈濃度和時(shí)間依賴性。選取BRU對(duì)HCT-116細(xì)胞24 h的IC10作為最大加藥濃度,進(jìn)一步探究BRU對(duì)HCT-116細(xì)胞遷移和侵襲的影響。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示較低濃度的BRU就可以顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116的遷移和侵襲,且呈濃度依賴性。

腫瘤的轉(zhuǎn)移是涉及肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)形成和分解引發(fā)的多因素和多細(xì)胞過(guò)程[14]。這些過(guò)程又涉及Rho亞家族(RhoA、RhoC)，活化的RhoA通常調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白應(yīng)激纖維的形成并影響肌動(dòng)球蛋白的收縮性。RhoA的下游因子是Rho相關(guān)的卷曲螺旋激酶1(ROCK1)，活化的RhoA激活ROCK1，使肌球蛋白磷酸酶磷酸化而失活，導(dǎo)致磷酸化的肌球蛋白不能脫磷酸化，使得胞質(zhì)內(nèi)磷酸化的肌球蛋白水平增加，增加肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白的相互作用,引起細(xì)胞的黏附、侵襲和遷移[15]。大量研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK1信號(hào)通路在細(xì)胞遷移時(shí)能調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、形態(tài)變化和細(xì)胞骨架拉伸，這對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移具有重要影響。RhoA的激活可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而靶向RhoA/ROCK1信號(hào)通路是抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的可行方法。在本實(shí)驗(yàn)中，用不同濃度BRU處理結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116后RhoA和 ROCK1的蛋白水平明顯下調(diào)。提示BRU可能通過(guò)RhoA/ROCK1信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的遷移和侵襲。

基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類活性上依賴鈣離子和鋅離子的蛋白水解酶,它能降解細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞基底膜，從而導(dǎo)致細(xì)胞局部缺損[16]。由于MMPs的表達(dá)對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性，在過(guò)表達(dá)MMPs的結(jié)直腸癌細(xì)胞中，其遷移與侵襲能力增強(qiáng),所以抑制MMPs的表達(dá)可能是治療結(jié)直腸癌的潛在有效方式[17]。以往的研究表明，ROCK抑制劑Y27632可以抑制HCC的進(jìn)展和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，這可能與腫瘤細(xì)胞中MMP2、MMP9表達(dá)的降低有關(guān)。除了遷移的影響外，ROCK在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的大多數(shù)步驟中都起著作用，包括增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。RhoA/ROCK在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)增加，并與腫瘤細(xì)胞的惡性程度呈正相關(guān)，ROCK參與了MMPs的調(diào)控，MMP2的表達(dá)可以被ROCK抑制劑法舒地爾所抑制[18]，提示MMPs是RhoA/ROCK1信號(hào)通路的下游。本研究中，經(jīng)BRU處理后的HCT-116細(xì)胞中的RhoA、ROCK1、MMP2和MMP9蛋白水平下調(diào)，與Y27632處理后的結(jié)果一致，提示BRU可能是一種潛在的RhoA/ROCK通路抑制劑，能夠通過(guò)RhoA/ROCK1信號(hào)通路抑制MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制HCT-116細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，BRU可能通過(guò)RhoA/ROCK1信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的遷移和侵襲。提示BRU對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116有良好的抗腫瘤活性，是一種治療結(jié)腸癌的潛在有效藥物，RhoA/ROCK1信號(hào)通路是一個(gè)治療結(jié)直腸癌的有前景的靶點(diǎn)，對(duì)其作用機(jī)制的進(jìn)一步研究有助于發(fā)現(xiàn)BRU潛在的藥理作用。