郭芳芳?彭海山?萬志彬?李怡?楊潔霞

【摘要】目的 評估基因組拷貝數(shù)變異測序（CNV-seq）結合短串聯(lián)重復序列（STR） 多態(tài)性分析技術在檢測孕早期（≤9周）流產(chǎn)物組織中潛在葡萄胎病例的應用價值。方法 收集行流產(chǎn)物組織CNV-seq結合STR多態(tài)性檢測的孕早期病例，挑取部分新鮮絨毛組織進行CNV-seq結合STR多態(tài)性檢測，其余組織常規(guī)固定后進行病理組織學檢測。結果 共納入782例孕早期病例，經(jīng)CNV-seq結合STR多態(tài)性檢測共檢出66例（8.44%）潛在葡萄胎病例，其中57例（7.29%）為三倍體，9例（1.15%）為全基因組同源單親二倍體。57例三倍體中有52例隨訪到病理形態(tài)學結果，其中19例提示為宮腔內絨毛，12例為部分絨毛間質水腫，12例為偶見絨毛、極少許絨毛和少許絨毛，9例未見絨毛。病理形態(tài)學提示未見絨毛和少許絨毛的3例三倍體病例的STR基因分型檢測示染色體異常三倍體2例、部分性葡萄胎1例。9例全基因組同源單親二倍體中，經(jīng)病理形態(tài)學及p57Kip2蛋白免疫組織化學染色提示為完全性葡萄胎8例，余1例病理形態(tài)學提示少許絨毛，隨后經(jīng)STR基因分型檢測證實該病例也為完全性葡萄胎。結論 CNV-seq結合STR檢測孕早期流產(chǎn)物對發(fā)現(xiàn)潛在的葡萄胎病例有一定的價值，特別是完全性葡萄胎;相較于病理組織學檢測，STR基因分型檢測在孕早期葡萄胎標本中更易獲得可靠的結果。

【關鍵詞】孕早期;葡萄胎;短串聯(lián)重復序列多態(tài)性分析;產(chǎn)前診斷;基因分型

CNV-seq combined with STR polymorphism in detection of potential hydatidiform mole in abortion tissues of early pregnancy women Guo Fangfang， Peng Haishan， Wan Zhibin， Li Yi， Yang Jiexia. Medical Genetics Center， Guangdong Women and Children Hospital， Guangzhou 510010， China Corresponding author， Yang Jiexia， E-mail： yjxfimmu@ 126. com

【Abstract】Objective To evaluate the value of CNV-seq combined with short tandem repeat （STR） polymorphism in the detection of potential hydatidiform mole in abortion tissues of early pregnancy women （≤ 9 weeks）. Methods Clinical data of early pregnancy women whose abortion tissues were subjected to CNV-seq combined with STR polymorphism analysis were collected. The villi tissues were partially prepared for CNV-seq combined with STR detection， and the remaining tissues were routinely fixed for histopathological diagnosis. Results A total of 782 early pregnancy women were recruited. Among them， potential hydatidiform mole was detected in 66 cases （8.44%） by CNV-seq combined with STR including 57 cases of triploid （7.29%） and nine cases of whole genome isodisomy （1.15%）. Pathomorphological results were obtained in 52 of the 57 triploid cases. Normal villi were observed in 19 patients. Partial villi stromal edema was seen in 12 cases. Villi were occasionally noted or a slight or extremely slight amount of villi could be found in 12 cases. No villis were seen in nine cases. Pathomorphological examination prompted that among three triploid cases with no villi and a slight amount of villi receiving STR genotyping， two patients were diagnosed with chromosomal abnormal triploid and one case of partial hydatidiform mole. Among nine cases of whole genome isodisomy， eight patients were indicated as complete hydatidiform mole by pathomorphological diagnosis and p57Kip2 immunohistochemistry， and the remaining one patient with a slight amount of villi was subsequently confirmed as complete hydatidiform mole by STR genotyping. Conclusions The combination of CNV-seq and STR has certain value in the detection of potential hydatidiform mole in the abortion tissues of women with early pregnancy， especially for complete hydatidiform mole. Compared with pathomorphological diagnosis， STR genotyping is more likely to obtain reliable results in detecting potential hydatidiform mole in early pregnancy women.

【Key words】Early pregnancy;Hydatidiform mole;Short tandem repeat polymorphism;Prenatal diagnosis;Genotyping

葡萄胎主要包括完全性葡萄胎和部分性葡萄胎，幾乎所有的完全性葡萄胎為完全父源性單親二倍體，部分性葡萄胎是具有雙雄單雌來源的三倍體[1]。隨著檢測技術的進步，越來越多的孕早期流產(chǎn)妊娠物被發(fā)現(xiàn)為葡萄胎。但是，孕早期葡萄胎往往沒有典型的臨床癥狀，超聲對孕早期葡萄胎的總體檢出率也僅為50%左右[2]。2018年我國發(fā)布的妊娠滋養(yǎng)細胞疾病診斷與治療指南（第四版）中，明確了病理組織學檢測是葡萄胎最重要和最終的診斷方法[3]。但是孕早期葡萄胎病理組織形態(tài)學表現(xiàn)可能不典型，水腫性流產(chǎn)與葡萄胎病理組織形態(tài)學表現(xiàn)差異可能會不明顯，且病理學家對此的解讀也存在一定的主觀性[4]。因此，對孕早期流產(chǎn)妊娠中葡萄胎的精準診斷仍然存在挑戰(zhàn)。近年來，國內外學者對基于下一代測序技術的基因組拷貝數(shù)變異測序（CNV-seq）臨床應用的相關探索表明，CNV-seq結合短串聯(lián)重復序列（STR）多態(tài)性分析技術可應用于流產(chǎn)物樣本分析，以檢測覆蓋全染色體非整倍體、大片段缺失/重復及全基因組CNV，與此同時還可以發(fā)現(xiàn)三倍體及同源單親二倍體[5]。為此，本研究回顧性分析了經(jīng)CNV-seq結合STR多態(tài)性檢測在孕早期（≤9周）流產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的潛在的66例葡萄胎病例，希望為此類病例的臨床管理提供一定的依據(jù)。

材料與方法

一、標本來源

收集2019年1月至2020年1月在廣東省婦幼保健院進行流產(chǎn)物CNV-seq結合STR檢測的孕早期（≤9周）782例病例基本資料及其流產(chǎn)物組織（自然流產(chǎn)排出或稽留流產(chǎn)清宮術取出）。從新鮮流產(chǎn)物中挑取少量絨毛組織用于CNV-seq及STR檢測，剩余標本常規(guī)固定后用于病理組織學檢測。所收集病例基本資料包括年齡、孕周、超聲檢查結果等。本研究已通過廣東省婦幼保健院倫理委員會審批，檢測前患者均已簽署知情同意書。

二、病理組織學檢查

將流產(chǎn)物組織置入適量的4%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋并制作HE切片，由2位病理醫(yī)師對HE 切片進行組織形態(tài)學觀察，判斷是否有絨毛水腫并記錄其程度，具體指標包括絨毛積液水腫程度、是否有絨毛水池形成（大小超過絨毛的50%）、是否有細胞滋養(yǎng)葉細胞增生及其增生程度等[6]。對所有的經(jīng)CNV-seq及STR檢測提示為同源單親二倍體的標本進行p57Kip2蛋白免疫組織化學染色（免疫組化），采用廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司的p57Kip2鼠抗人單克隆抗體行鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）染色檢測p57Kip2蛋白在絨毛和蛻模組織中的表達情況，若絨毛間質細胞和細胞滋養(yǎng)葉細胞無棕色或者棕黃色染色，結果判定為陰性，即完全性葡萄胎，見圖1。

三、STR檢測

1. STR多態(tài)性檢測流程

提取流產(chǎn)物組織及其母體外周血DNA，具體操作流程參照Magen磁珠法通用核酸提取試劑盒說明書。NanoDrop 2000評估所提取 DNA的濃度和純度。將DNA濃度稀釋至20 ～ 40 ng/μl，利用熒光標記多重PCR技術擴增13個常染色體STR位點（21號染色體5個、18和13號染色體各4個）。擴增產(chǎn)物經(jīng)ABI 3500 xL測序儀毛細管電泳檢測出各基因座的等位基因電泳數(shù)據(jù)，將電泳數(shù)據(jù)導入數(shù)據(jù)分析軟件GeneMarker V2.2.0，進行數(shù)據(jù)分析及結果判斷。根據(jù)GeneMarker V2.2.0軟件分析結果，計算各個位點峰面積比值得出染色體倍體正?；虍惓５慕Y論（二倍體、同源單親二倍體、三倍體）。

2. STR葡萄胎基因分型檢測流程

將經(jīng)STR多態(tài)性檢測為同源單親二倍體及三倍體的流產(chǎn)物病例，進一步與母體外周血DNA STR位點進行比對，分析其親代來源，從而鑒定出完全性葡萄胎（單雄來源單親二倍體）及部分性葡萄胎（雙雄來源三倍體），見圖2。

四、CNV-seq檢測

取流產(chǎn)物組織DNA 100 ng進行片段化處理，具體操作流程參照試劑盒NEBNext dsDNA Fragmentase Kit說明書進行。按照晶芯? 胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒說明書對片段化后的DNA進行文庫構建及定量，然后上機測序。測序完成后，將樣本的DNA序列與已知人類參考基因組序列進行比對，運用環(huán)狀二元分割算法分析樣本的CNV情況。通過檢索數(shù)據(jù)庫及查閱文獻，參考美國醫(yī)學遺傳學會指南，對這些變異進行五分類（致病性、可能致病、臨床意義不明確、可能良性、良性），判斷樣本是否存在全基因組致病性及可能致病性拷貝數(shù)變異[7]。

五、統(tǒng)計學處理

連續(xù)型變量如符合正態(tài)分布以表示，否則以中位數(shù)（最小值 ～ 最大值）表示;分類資料以例（%）或例（相對比）表示。

結果

一、一般資料

2019年1月至2020年1月在廣東省婦幼保健院進行流產(chǎn)物CNV-seq結合STR檢測的孕早期（≤9周）病例共782例，其中潛在的葡萄胎妊娠共66例（8.44%），包括57例（7.29%）三倍體和9例（1.15%）同源單親二倍體。57例三倍體病例妊娠年齡為30 （24 ～ 41）歲，檢測時孕周為6 （5 ～ 9）周。9例同源單親二倍體妊娠年齡為28（24 ～ 31）歲，檢測時孕周為6（6 ～ 7）周。

二、57例三倍體病例分析

1. 總體情況

57例三倍體中，以69，XXY最常見（25例，43.85%），69，XXX次之（20例，35.09%），69，XYY 最少見（2例，3.51%），其余病例包括1例亞三倍體、8例超三倍體以及1例三倍體合并染色體部分三體和部分單體，即69，XXY， 3p12.1-pter（dup）， 3q11.2-qter（del）， 13q21.1-qter（del）。其中52例隨訪到病理組織形態(tài)學結果，提示為宮內絨毛及蛻膜組織19例、提示為部分絨毛間質水腫12例，提示為偶見絨毛、極少許絨毛和少許絨毛12例，未見絨毛9例。

2. 未見絨毛和少許絨毛的三倍體病例分析

3例病理形態(tài)學結果提示未見絨毛和少許絨毛的三倍體病例，經(jīng)與母體外周血DNA STR位點比對（即STR基因分型檢測），發(fā)現(xiàn)2例為染色體異常三倍體（雙雌單雄來源三倍體），1例為部分性葡萄胎（雙雄單雌來源三倍體），見表1及圖3A ～ C。

3. 全基因組同源單親二倍體病例分析

9例全基因組同源單親二倍體均隨訪到病理組織學結果，其中8例提示為完全性水泡狀胎塊，且7例進一步p57Kip2蛋白免疫組化結果均為陰性，提示此8例均為完全性葡萄胎病例;其余1例提示宮腔內少許絨毛及蛻膜組織（病例4），但經(jīng)母體外周血與流產(chǎn)物組織DNA STR位點比對，證實該病例流產(chǎn)物組織為完全父源單親二倍體，見圖3D。結合該病例超聲結果為妊娠（胚芽長3 mm，未見胎心搏動）合并混合回聲區(qū)，提示該標本可能為妊娠合并完全性葡萄胎。9例完全性葡萄胎病例中有3例（3/9）呈現(xiàn)完全性葡萄胎的典型超聲表現(xiàn)（蜂窩狀回聲和密集光點波動）。

討論

葡萄胎具有進展為持續(xù)性滋養(yǎng)細胞疾病的危險性，且完全性葡萄胎的進展率（15% ～ 20%）比部分性葡萄胎（0.5% ～ 4.0%）更高[8]。因此精確區(qū)分完全性和部分性葡萄胎以及非葡萄胎流產(chǎn)對指導后續(xù)合理的臨床管理具有重要的臨床意義。

在孕早期依靠單純的病理形態(tài)學檢測難以準確區(qū)分完全性葡萄胎、部分性葡萄胎以及非葡萄胎流產(chǎn)，因此常常需要進一步輔以p57Kip2蛋白免疫組化分析。其中完全性葡萄胎p57Kip2蛋白免疫組織化學染色陰性，部分性葡萄胎和非葡萄胎流產(chǎn)p57Kip2蛋白免疫組織化學染色陽性。因此，病理組織形態(tài)學結合p57Kip2蛋白免疫組織化學染色基本可以較好地將完全性葡萄胎鑒別出來，但是卻無法區(qū)分部分性葡萄胎和其他非葡萄胎流產(chǎn)[9]。目前研究顯示，葡萄胎的遺傳學病因是存在過剩的父源性基因組，STR基因分型技術通過將母體組織與流產(chǎn)物組織DNA進行STR位點比對，分析流產(chǎn)物DNA的親代來源，可以檢測出完全性葡萄胎（完全單雄來源單親二倍體）及部分性葡萄胎（雙雄單雌來源三倍體），從而對完全性葡萄胎及部分性葡萄胎做出精確診斷并明確分型[9-10]。

本研究中經(jīng)CNV-seq結合STR多態(tài)性檢測共發(fā)現(xiàn)9例同源單親二倍體，其中7例同源單親二倍體經(jīng)病理形態(tài)學和進一步免疫組織化學檢測驗證為完全性葡萄胎。1例病理形態(tài)學提示為水泡狀胎塊，患者未選擇進一步免疫組化檢測。這提示在STR位點足夠多的情況下，經(jīng)CNV-seq結合STR檢測發(fā)現(xiàn)的同源單親二倍體是完全性葡萄胎的可能性較大，建議進一步對這部分病例抽取母體外周血進行STR分型檢測，以明確是否為完全性葡萄胎。其余1例同源單親二倍體比較特殊，其病理組織學檢測提示宮腔內少許絨毛及部分蛻膜組織，但經(jīng)母體外周血與流產(chǎn)物組織 STR位點比對，證實該病例流產(chǎn)物組織為父源單親二倍體，結合該病例超聲結果為妊娠合并混合回聲區(qū)，提示該標本應該是妊娠合并完全性葡萄胎。如果排除病理學觀察者主觀因素導致的誤差，推測可能是由于標本取材問題導致的病理組織學檢測結果與STR基因分型檢測結果不一致，即經(jīng)CNV-seq結合STR檢測的標本組織取自于完全性葡萄胎組織，而經(jīng)病理檢測的標本取自于正常妊娠組織。因此，對于懷疑雙胎之一合并葡萄胎的病例取材時需特別注意，精確分離不同來源的妊娠物成分并分別進行檢測對于保證準確的結果是至關重要的。Liu等[11]的研究也認為對于難以分離的混合妊娠物標本建議采用病理形態(tài)學檢測篩查、免疫組化分析和STR基因分型相結合的方法，對可能合并葡萄胎的雙胎妊娠的混合妊娠產(chǎn)物組進行診斷。

本研究中，共有4例病理組織學提示未見絨毛（2例）和少許絨毛（2例）的病例進行了進一步的STR基因分型檢測（即將絨毛組織STR位點與母體組織STR位點比對），結果顯示其中1例為部分性葡萄胎、1例為完全性葡萄胎。因此，相比較于病理組織形態(tài)學檢測，STR基因分型檢測僅需極少的標本量，且結果判斷不受主觀因素影響，在孕早期可獲得的絨毛數(shù)量較少的情況下更易獲得準確的結果。

本研究中確診的9例完全性葡萄胎和1例部分性葡萄胎的超聲結果均提示未見卵黃囊，僅見混合回聲團，其中9例完全性葡萄胎病例中僅3例呈現(xiàn)完全性葡萄胎的典型超聲表現(xiàn)（蜂窩狀回聲和密集光點波動）。既往研究者發(fā)現(xiàn)在孕早期（≤12周）葡萄胎中，超聲檢查對早期葡萄胎的檢出率約為50%，其中對完全性葡萄胎和部分性葡萄胎的檢出率分別約為70%和20%[2]。本研究收集到的完全性葡萄胎標本量較少，且孕周更早（≤9周），所以超聲檢查對早期葡萄胎的檢出率更低，僅為3/9。但是以往的研究結果及本研究的結果均提示，超聲對早期葡萄胎的檢出率有限，應重視孕早期非活胎妊娠物的送檢，通過STR 基因分型檢測有利于對可疑葡萄胎病例進行精確診斷并明確分型，減少葡萄胎的漏診。

本研究的不足之處在于，大部分經(jīng)CNV-seq及STR檢測發(fā)現(xiàn)的潛在的葡萄胎病例（三倍體及同源單親二倍體）沒有經(jīng)過STR基因分型檢測驗證，日后我們將對這部分病例進行及時的臨床反饋并建議進一步的精確診斷明確葡萄胎分型。

綜上所述，CNV-seq結合STR檢測孕早期流產(chǎn)物對發(fā)現(xiàn)潛在的葡萄胎病例有一定的價值，特別是完全性葡萄胎;相較于病理組織學檢測，CNV-seq及STR檢測僅需要極少的標本量，且不受主觀因素判斷影響，當結合母體DNA 進行STR基因分型檢測時，在孕早期（≤9周）葡萄胎標本檢測中更易獲得可靠的檢測結果。建議對經(jīng)CNV-seq及STR檢測發(fā)現(xiàn)的潛在葡萄胎病例進行及時隨訪及進一步的精確診斷并明確分型，為此類病例后續(xù)合理的臨床監(jiān)測及預后管理提供依據(jù)。

參考文獻

[1] 劉巖， 劉從容.葡萄胎診斷進展與STR基因分型的應用. 婦產(chǎn)與遺傳（電子版），2016，6（4）：18-22.

[2] 焦瀾舟， 尤淑艷， 王亞萍， 朱成功， 姜繼勇. 早期葡萄胎的臨床特點及診斷方法探討. 中華婦產(chǎn)科雜志， 2019， 54（11）：756-762.

[3] 向陽， 周琦， 吳小華， 劉繼紅， 李力， 朱筧青， 白萍， 盛修貴. 妊娠滋養(yǎng)細胞疾病診斷與治療指南（第四版）. 中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2018，34（9）：994-1001.

[4] Kubelka-Sabit K， Jasar D， Filipovski V， Bozinovski G， Plaseska-Karanfilska D. Molecular and histological cha-racteristics of early triploid and partial molar pregnancies. Pol J Pathol， 2017， 68（2）：138-143.

[5] 中華醫(yī)學會醫(yī)學遺傳學分會臨床遺傳學組， 中國醫(yī)師協(xié)會醫(yī)學遺傳醫(yī)師分會遺傳病產(chǎn)前診斷專業(yè)委員會， 中華預防醫(yī)學會出生缺陷預防與控制專業(yè)委員會遺傳病防控學組. 低深度全基因組測序技術在產(chǎn)前診斷中的應用專家共識. 中華醫(yī)學遺傳學雜志， 2019， 36（4）： 293-296.

[6] 鄭興征， 秦旭穎，王鵬， 徐飛， 馬建慧， 王喜立， 陳素文，馮旺琴， 朱力， 陰赪宏， 吳秉銓. STR基因分型在葡萄胎及非葡萄胎妊娠流產(chǎn)診斷中的應用. 中華病理學雜志， 2018， 47（8）：609-615.

[7] Wang Y， Li Y， Chen Y， Zhou R， Sang Z， Meng L， Tan J， Qiao F， Bao Q， Luo D， Peng C， Wang YS， Luo C， Hu P， Xu Z. Systematic analysis of copy-number variations associated with early pregnancy loss. Ultrasound Obstet Gynecol， 2020， 55（1）：96-104.

[8] Heller DS. Update on the pathology of gestational trophoblastic disease. APMIS， 2018， 126（7）： 647-654.

[9] Madi JM， Braga A， Paganella MP， Litvin IE， Wendland EM. Accuracy of p57KIP2 compared with genotyping to diagnose complete hydatidiform mole： a systematic review and meta-analysis. BJOG， 2018， 125（10）：1226-1233.

[10] Colgan TJ， Chang MC， Nanji S， Kolomietz E. DNA genotyping of suspected partial hydatidiform moles detects clinically significant aneuploidy. Int J Gynecol Pathol， 2017， 36（3）： 217-221.

[11] Liu Y， Zheng X， Wang Y， Li Y， Liu C. Identification of a hydatidiform mole in twin pregnancy following assisted reproduction. J Assist Reprod Genet， 2020， 37（3）： 603-610.

（收稿日期：2021-01-22）

（本文編輯：林燕薇）