陳素珠，笪琳萃，黃志清，巍巍，黃鵬宇，鄭備紅

福建省婦幼保健院 福建醫(yī)科大學附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，福州350001

卵巢癌是一種惡性生殖器官腫瘤，嚴重威脅著許多婦女的健康和生命。雖然卵巢癌的研究越來越多，但其確切的分子機制仍未明確［1］。多項研究表明，表觀遺傳改變可能是許多惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子機制［2-3］。組蛋白去甲基化酶KDM2B基因編碼的蛋白包含JmjC結(jié)構(gòu)域、CXXC基序、PHD結(jié)構(gòu)域、富脯氨酸區(qū)域和富亮氨酸重復(fù)序列。其中，JmjC結(jié)構(gòu)域是催化H3K36me2和H3K4me3.28去甲基化的活性中心［4］。最近有研究表明，KDM2B通過JmjC依賴的方式調(diào)控基因表達，可能參與腫瘤發(fā)生［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去甲基化酶KDM2B在卵巢癌中的表達增加與組織學類型、腫瘤分級、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與EZH2呈正相關(guān)。Kdm2b可能成為卵巢癌診斷的潛在遺傳標記物和臨床治療的新分子靶點［7］。目前Kdm2b基因在卵巢癌中發(fā)生發(fā)展的研究主要集中在細胞水平上，而在動物模型中的研究少見，因此構(gòu)建Kdm2b基因敲除的動物模型，可以促進該基因在卵巢癌中的功能研究。

目前新型動物模型構(gòu)建常用基因編輯方法有三種：鋅指核酸酶技術(shù)（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)（TALEN）和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)（CRISPR/Cas9）技術(shù)。ZFNs的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸酶結(jié)構(gòu)域的設(shè)計和模塊化裝配非常復(fù)雜且耗時，且成功率和平均突變率低；TALEN的結(jié)構(gòu)較大，轉(zhuǎn)染困難［8］；與ZFN、TALEN技術(shù)相比，CRISPR/Cas技術(shù)使用的是單一的酶，不僅不需要根據(jù)目標序列的不同而改變，只需要設(shè)計一個特異的向?qū)NA（sgRNA）就可以實現(xiàn)對不同靶基因位置的基因編輯，而且成本低廉、簡便和高效。目前，利用CRIS?PR/Cas技術(shù)構(gòu)建的Kdm2b基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠還未見報道。2018年1月–2019年12月，我們采用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了Kdm2b基因大片段敲除的小鼠模型，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠：C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。細胞：NIH3T3（福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學重點實驗室保存）；菌和質(zhì)粒：pEASY Blunt Cloning Vector（TransGen），PX459（Addgene），Trans1-T1（TransGen），PX458（Addgene），Top10（Ta?KaRa），pBlueScript II KS Vector（STRATAGENE）；試劑：Lipo2000（Invitrogen），嘌呤霉素（Life technolo?gies），胎牛血清（Amresco），氨芐青霉素（上海生工），DMEM（GIBCO），質(zhì)粒提取試劑盒（ROCHE），T7E1（NEW ENGLAND Biolabs），青霉素/鏈霉素（Amres?co）。主要儀器：電泳槽（北京六一），凝膠電泳儀（北京六一），紫外凝膠成像系統(tǒng)（Syngene），PCR儀（5333型，Eppendorf），生物安全柜（HealForce），CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo），相差倒置顯微鏡（CKX-41型，Olympus）。

1.2 小鼠Kdm2b基因sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建①設(shè)計sgRNA：在網(wǎng)站http：//crispr.mit.edu/中分別粘貼第7個外顯子5’端的內(nèi)含子序列和第9個外顯子3’端的內(nèi)含子序列；各尋找評分最高的兩個序列；在選定的序列5’端加入BbsI位點。Kdm2b的第7個外顯子的兩個sgRNA識別的靶序列分別命名為sgRNA5-1及sgRNA5-2（圖1）。第9個外顯子的兩個sgRNA識別的靶序列分別命名為sgRNA3-1及sgRNA3-2（圖1）。②構(gòu)建RNA（sgRNA）重組質(zhì)粒：根據(jù)所設(shè)計的序列，分別合成sgRNA核苷酸正反兩條 單 鏈，將sgRNA5-1、sgRNA5-2和sgRNA3-1、sgRNA3-2兩條單鏈退火（95℃、5 min，37℃、75 min）形成雙鏈結(jié)構(gòu)，將得到的雙鏈插入到已用BbsⅠ酶切后的線性pSpCas9（BB）-2A-Puro（PX459）載體中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，用氨芐抗性的LB培養(yǎng)基平板篩選，挑取單克隆搖菌培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。以提取的質(zhì)粒作為PCR模板，以U6-F和sgRNA5-1-R、sgRNA5-2-R、sgRNA3-1-R、sgRNA3-2-R作為引物進行PCR，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判斷sgRNA是否正確插入到PX459質(zhì)粒載體中。

圖1 Kdm2b基因的sgRNA的設(shè)計圖

1.3 Kdm2b基因大片段敲除最佳sgRNA重組質(zhì)粒組合的篩選將4種sgRNA的重組質(zhì)粒兩兩組合，形成四個sgRNA共同作用的組合，分別為sgRNA3-1和sgRNA5-1、sgRNA3-1和sgRAN5-2、sgRNA3-2和sgRNA5-1、sgRNA3-2和sgRAN5-2的重組質(zhì)粒組合。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將4種質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)入NIH3T3細胞中，24 h后進行嘌呤霉素篩選，12 d后形成陽性單克隆細胞。收集陽性克隆，并且提取基因組，對基因組進行PCR，得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定是否成功敲除Kdm2b基因片段。設(shè)計鑒定引物（Kdm2b-5臂鑒定正向引物：GT?GCCCTCCTCTTACTCAGGTTTCG和反向引物：AT?GTGGAAGTCAGTGAAACAGCCCT；Kdm2b-3臂鑒定正向引物：GGCTACACCTTTTTCATCCCTTC和反向引物：ACCGACTATTACCTCCCTCATTG）。結(jié)果顯示，sgRNA3-1和sgRAN5-2共同轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，切割效率為7.2%；gRNA3-2和sgRAN5-2切割效率為11.5%；以上兩種質(zhì)粒組合能實現(xiàn)Kdm2b基因的大片段敲除。根據(jù)切割效率的比較，選取了sgRNA3-2和sgRAN5-2為Kdm2b基因 敲 除的最 佳組合。

1.4 Kdm2b基因大片段敲除小鼠模型的構(gòu)建對3～6周齡C57BL/6母鼠進行誘導(dǎo)排卵，下午1～2點每只C57BL/6母鼠注射0.2 mL 25 U/mL孕馬血清促性腺激素（PMSG）；46～48 h后，每只C57BL/6母鼠注射0.1 mL 50 U/mL人絨毛膜促性腺激素（hCG）；在注射hCG之后的當天晚上，將一只或者兩只處于發(fā)情期的C57BL/6母鼠與一只C57BL/6的公鼠合籠，第二天早晨檢查是否有交配后形成的陰道栓；如發(fā)現(xiàn)陰道栓說明小鼠授精成功。處死母鼠，取出輸卵管并撕開獲得受精卵，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)。利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄sgRNA3-2、sgRNA5-2和Cas9的mRNA，然后利用細胞質(zhì)顯微注射技術(shù)在小鼠原核期的受精卵胚胎中注射sgRNA和Cas9的mRNA。共注射了130個胚胎，注射后胚胎的存活率為53%。體外培養(yǎng)后的存活胚胎移植入假孕母鼠的輸卵管壺腹部。待小鼠出生1周左右，剪取裂解尾尖，用酚/氯仿法抽提尾尖中的基因組DNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳及測序。純合子小鼠在初生4周后，觀察其表型。

2 結(jié)果

最終獲取13只小鼠。經(jīng)過鼠尾DNA鑒定，Kdm2b基因大片段缺失的純合子小鼠有1只，雜合子小鼠有3只，另外9只Kdm2b基因未見缺失；進一步測序分析發(fā)現(xiàn)，在Kdm2b基因中缺失的片段為外顯子7至外顯子9序列（圖2）。純合子小鼠在初生4周后，出現(xiàn)卷尾（圖3）。

圖2 Kdm2b基因大片段敲除小鼠鼠尾基因組的測序圖

圖3 Kdm2b基因大片段敲除小鼠

3 討論

轉(zhuǎn)基因小鼠模型是致癌機制研究的有效工具，將極大地豐富對卵巢癌發(fā)病機制和分子機制的研究。轉(zhuǎn)基因小鼠是表達外源基因或DNA序列的小鼠品系。改變小鼠基因組的常用方式有兩種：①傳統(tǒng)同源重組：將外源基因（帶有同源臂片段和抗性篩選基因）電轉(zhuǎn)染到胚胎干細胞中，通過攜帶的抗性進行篩選，選擇陽性的胚胎干細胞顯微注射到囊胚腔中，再將其移入假孕母體子宮內(nèi)，得到嵌合體小鼠。經(jīng)過多次雜交繁育可獲得純合個體。但是同源重組在體細胞中發(fā)生的概率非常低，只能達到10-6，所以只應(yīng)用在胚胎干細胞中［9］。②新型的基因編輯技術(shù)：是利用非同源性末端連接修復(fù)機制和隨后觸發(fā)同源重組機制，將基因編輯需要的組分直接顯微注射到受精卵后，移植到假孕母體的輸卵管中，待其發(fā)育成個體即為雜合子或者是純合子，不用進行多次的雜交繁育?？茖W家可以直接將CRISPR系統(tǒng)注入受精卵和單倍體胚胎干細胞，而不是胚胎干細胞，以縮短繁殖時間。與ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas9技術(shù)具有簡便、基因編輯效率高等特點，已經(jīng)成功用于果蠅、斑馬魚、小鼠和人等物種中［10］。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是研究人員巧妙將細菌和古細菌中用來抵御外來噬菌體入侵的機制運用到基因編輯中一種新型的基因編輯技術(shù)，通過sgRNA介導(dǎo)核酸酶Cas9對基因組特定位點進行識別、切割，激活細胞內(nèi)非同源末端連接修復(fù)，引發(fā)移碼突變實現(xiàn)靶基因的敲除［11］。非同源端連接（NHEJ）是一種容易出錯的修復(fù)機制，經(jīng)常導(dǎo)致插入或刪除（in?del）。這些indels可導(dǎo)致移碼突變、過早的停止密碼子或（和）非意義介導(dǎo)的靶基因衰退，從而導(dǎo)致功能喪失。而兩個sgRNA同時導(dǎo)入宿主細胞中可以實現(xiàn)對靶基因的大片段敲除。

本研究使用PX459質(zhì)粒作為載體，根據(jù)Kdm2b基因5’端和3’端DNA序列設(shè)計多個sgRNA。在進行構(gòu)建基因敲除小鼠前，首先，需要檢測sgRNA的可行性和效率，并且篩選有效的切割組合。為了減少工作量，這個過程在NIH3T3細胞中先進行驗證。實驗表明，組合sgRNA3-2和sgRNA5-2能夠在細胞中成功地實現(xiàn)Kdm2b基因大片段敲除，并且效率最高。因此，篩選得到最佳組合是sgRNA3-2和sgRNA5-2。最后，將sgRNA3-2和sgRNA5-2組合注射到小鼠中，成功獲得Kdm2b基因大片段敲除小鼠。據(jù)文獻［12］報道，Kdm2b基因敲除可致小鼠出現(xiàn)顱面部發(fā)育不全、腦癱和低外顯率的卷尾。本研究中的純合子小鼠生長到4周時，出現(xiàn)了卷尾的表現(xiàn)，進一步支持Kdm2b基因大片段敲除小鼠模型構(gòu)建成功。

總之，我們首次利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功制備了Kdm2b基因大片段敲除小鼠，為深入研究Kdm2b基因在卵巢癌的發(fā)生中的作用機制、確定藥物開發(fā)的靶點提供了動物模型。