王露，孫怡，趙蘇蘇，陳思敏，章宜芬

江蘇省中醫(yī)院病理科，南京210000

肺微浸潤性腺癌（MIA）是直徑≤3 cm的單個腺癌［1］，以貼壁型為主，浸潤灶≤0.5 cm［2-3］。隨著CT等影像學檢測手段的普及，肺MIA的檢出率越來越高。目前，肺MIA發(fā)生的原因尚不明確，有關其分子病因?qū)W方面的研究更是有限［1］。我們對86例肺MIA的癌組織進行肺癌基因高通量測序檢測，分析了其基因突變情況，并分析了不同臨床特征患者癌組織基因突變情況，為肺MIA的病因探討提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料經(jīng)江蘇省中醫(yī)院倫理委員會同意批準，收集本院2018年5月—2020年8月行手術治療的肺MIA患者86例，均經(jīng)病理檢查確診，男20例、女66例，年齡18～80歲、中位年齡52歲。既往有肺內(nèi)腫瘤病史2例，均是肺MIA；有肺外腫瘤病史16例，其中子宮肌瘤7例、乳腺癌4例、甲狀腺乳頭狀癌3例、垂體腫瘤1例、膀胱癌1例、闌尾腫瘤1例。有肺炎病史8例，有吸煙史6例。患者直系血緣親屬有肺癌病史10例，其中有肺癌病史者祖父1例、外祖母和母親1例、父親3例、母親3例，父親和母親都有1例，患者承認有但不愿告知具體情況1例；患者直系血緣親屬無肺癌病史41例。多數(shù)肺MIA患者沒有明顯的臨床癥狀，有14例患者影像學檢查前有一些非特異的呼吸道癥狀，如干咳、咳痰、胸悶、胸痛、氣喘等。術前胸部CT檢測：多發(fā)結(jié)節(jié)45例，單發(fā)結(jié)節(jié)35例；磨玻璃結(jié)節(jié)62個，其中23個為混雜磨玻璃結(jié)節(jié)、35個為純磨玻璃結(jié)節(jié)、4個為實性結(jié)節(jié)。58例縱隔未見腫大淋巴結(jié)，僅有5例患者縱隔有腫大淋巴結(jié)，20例未查到縱隔淋巴結(jié)影像學結(jié)果。手術標本類型：肺結(jié)節(jié)楔形切除標本76例份，肺段切除標本7例份，肺葉切除標本3例份。結(jié)節(jié)位置：右上肺30例，右中肺3例，右下肺17例，左上肺20例，左下肺17例。結(jié)節(jié)鏡下最大徑0.4～1.8 cm、中位數(shù)為0.8 cm；微小浸潤灶最大徑0.1～0.5 cm、中位數(shù)0.2 cm。病理類型均為非黏液型?；颊呔匆姺文ぜ懊}管、神經(jīng)侵犯。病理分期參照AJCC第八版分期，均為ⅠA1期。

1.2 肺MIA癌組織基因型分析手術切除標本經(jīng)甲醛固定，取材醫(yī)師取材，制成石蠟標本，并切片染色，制成HE切片。選擇有肺MIA的癌組織，使用世和定制肺癌基因檢測試劑盒，在Illuminia Hiseq高通量測序平臺進行肺癌基因高通量測序。具體步驟如下：由兩名病理醫(yī)師（一名主治醫(yī)師和一名副主任醫(yī)師）鏡下明確肺MIA的診斷，并進行顯微切割，獲取富集MIA的石蠟組織；然后使用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒從富集MIA的石蠟組織中提取基因組DNA。用Qubit熒光計（ThermoFisher，美國）測定提取的基因組DNA濃度；選取1～2 mg DNA使用Hiseq PE Cluster Kit Box1/2構建文庫。然后使用Hiseq SBS kit 300 Cycles Box1/2富集擴增子，繼而在Illuminia Hiseq高通量測序平臺測序。測序結(jié)果在生物信息學分析軟件（世和基因GSCAP pipeline）上進行比對分析。共檢測15個基因全外顯子、部分融合相關內(nèi)含子區(qū)域、可變剪切區(qū)域（覆蓋所有NCCN指南推薦的肺癌靶向用藥靶點），這些基因包括EG?FR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、MET、Her-2、AKT1、MAP2K1（MEK1）、NRAS、NF1、PIK3CA、PTEN、RET、TP53。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以率、百分比表示，根據(jù)最小理論頻數(shù)值和標本數(shù)量不同分別行χ2檢驗、連續(xù)校正χ2檢驗及Fisherχ2檢驗，根據(jù)二項分布法計算各種基因突變率的95%置信區(qū)間（CI）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 86例肺MIA患者癌組織中基因突變情況86例患者中，癌組織有基因突變80例。有12種基因發(fā)生了突變：EGFR基因突變38例（44.19%）、95%CI33.48%～55.30%，ERBB2基 因 突 變18例（20.93%）、95%CI12.90%～31.05%，KRAS基因突變8例（9.30%）、95%CI4.10%～17.51%，MAPK21基因突變8例（9.30%）、95%CI4.10%～17.51%，BRAF基因突變7例（8.14%）、95%CI3.34%～16.05%，EML4-ALK融合基因3例（3.49%）、95%CI0.73%～9.86%，PIK3CA基因突變2例（2.33%）、95%CI0.28%～8.15%，TP53基 因 突 變2例（2.33%）、95%CI0.28%～8.15%，KIF5B-RET融合基因1例（1.16%）、95%CI0.03%～6.31%，KIF5BALK融 合 基 因1例（1.16%）、95%CI0.03%～6.31%，PTEN-IGR融合基因及IGR-RET融合基因1例（1.16%）、95%CI0.03%～6.31%。14例患者同時有1個以上的突變。

2.2 不同臨床特征的肺MIA患者癌組織基因突變率比較不同臨床特征［病灶部位（左側(cè)或右側(cè)）、性別（男性或女性）、肺小結(jié)節(jié)術前影像學表現(xiàn)（是否是磨玻璃結(jié)節(jié)、多發(fā)或單發(fā)、是否有淋巴結(jié)腫大）、是否有肺炎病史、術前是否有臨床癥狀］的肺MIA患者癌組織基因突變率比較，P均＞0.05，見表1。

表1 不同臨床特征的肺MIA患者癌組織中基因突變情況（例）

無肺癌病史的肺MIA患者癌組織中ERBB2突變18例、無突變66例；有肺癌病史的肺MIA患者癌組織中ERBB2突變1例、無突變1例。有無肺癌病史的肺MIA患者癌組織ERBB2基因突變率比較，P＜0.05。直系親屬有肺癌病史的肺MIA患者癌組織中EGFR突變8例，無突變2例；直系親屬無肺癌病史的肺MIA患者癌組織中EGFR突變15例，無突變24例；直系親屬中有無肺癌病史的肺MIA患者癌組織中EGFR突變率比較，連續(xù)矯正χ2=3.972，P＜0.05。其他基因改變與是否有肺癌病史、是否吸煙、直系親屬是否有肺癌病史均無關（P均＞0.05）。

3 討論

近年肺MIA的發(fā)生率越來越高，雖然目前發(fā)現(xiàn)肺MIA的存活率近100%，但是還是存在一定復發(fā)率［4-7］。為明確肺MIA的發(fā)病原因，本研究對肺MIA癌組織行肺癌基因高通量測序，結(jié)果顯示93.0%的患者有基因突變，只有7.0%的患者未檢測到基因突變，但并不排除這些患者可能會有本研究檢測基因以外的基因改變。本研究檢測的15個基因中，有12個基因發(fā)現(xiàn)有突變，其中最常見的是EGFR（44.19%），其次是ERBB2（20.93%）；在具體突變類型中，最常見的是ERBB2（HER2）基因第20外顯子發(fā)生非移碼插入突變（出現(xiàn)19次，占19.59%），其次是EGFR基因第21外顯子錯義突變（L858R，出現(xiàn)18次，占18.56%），第三是EGFR第19外顯子非移碼缺失突變（出現(xiàn)11次，占11.34%）；提示肺MIA的發(fā)生與EGFR和ERBB2相關，這兩種基因可能是肺腺癌發(fā)生的最早期分子事件。

ERBB2（同義詞：HER2）是EGFR家族的成員［8］。有研究表明，ERBB2基因在非小細胞肺癌中，2%發(fā)生擴增［9］，2%～4%發(fā)生基因突變［10］。目前發(fā)現(xiàn)只有腺癌這一組織學類型才發(fā)生這種基因突變，并且主要是外顯子20的插入和重復。ERBB2擴增和ERBB2突變互不相關［11］。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，部分ERBB2突變的腫瘤患者對廣譜ERB抑制劑阿法替尼敏感［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，肺MIA中最常見的基因突變類型是ERBB2基因第20外顯子發(fā)生非移碼插入突變，與文獻報道一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，ERBB2基因突變的發(fā)生與是否有肺MIA病史有關，在有肺MIA病史的人群中ERBB2的突變發(fā)生率較高（50%vs.21.43%），提示有這類突變的患者需要密切隨訪，以便在再次復發(fā)或疾病進展時能及時治療。對于多發(fā)、反復復發(fā)的肺MIA患者或者手術無法完全切除的患者，也許可以考慮使用ERB抑制劑治療。

EGFR是一種跨膜蛋白，具有胞質(zhì)內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構域［13］。目前已有研究表明，西方肺腺癌患者的EGFR突變率為19%，亞洲肺腺癌患者的EGFR突變率為48%［14］。突變攜帶者主要是非吸煙者、女性和年齡較小的人群［15］。盡管在EGFR基因中檢測到超過200種不同的突變，但最常見的兩種突變是EG?FR19外顯子的缺失突變和21外顯子的點突變（L858R），這兩種突變占所有EGFR突變的85%～90%［16］。這些突變被稱為激活或致敏突變，對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（TKIs），如厄洛替尼、吉非替尼和阿法替尼敏感［16］。本研究中，第二常見的突變是EGFR基因第21外顯子錯義突變（L858R，出現(xiàn)18次，占18.56%），第三是EGFR第19外顯子非移碼缺失突變（出現(xiàn)11次，占11.34%），總體趨勢與文獻報道類似。發(fā)生EGFR突變患者中女性占73.5%，非吸煙者占91.8%，平均年齡51.51歲，提示EGFR突變的肺MIA患者主要是女性、非吸煙者人群。這兩種突變都屬于激活突變，導致EG?FR的激活，繼而同二聚體或異二聚體（與其他HER成員）形成、特異性酪氨酸殘基的磷酸化和細胞內(nèi)信號傳導，細胞內(nèi)信號反過來導致細胞增殖增加、遷移增加，細胞死亡減少［17］，提示這類基因突變可能參與了肺MIA的發(fā)生發(fā)展，并且與靶向藥物治療敏感性有關。

雖然吸煙和空氣污染被認為是最重要的肺癌危險因素，但是已有研究證實某些基因胚系突變與肺癌的遺傳易感性相關［18-19］。其中EGFR-T790M胚系突變被證實有遺傳易感性［20-21］。本研究中肺MIA患者直系親屬有肺癌病史的僅占19.6%，絕大部分患者直系親屬沒有肺癌病史。經(jīng)統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)EGFR突變與直系親屬肺癌病史有一定關系，顯示直系親屬無肺癌病史者發(fā)生EGFR的突變頻率相對較高，且這些直系親屬有肺癌病史的患者均未發(fā)現(xiàn)有EGFR-T790M突變。其他基因突變均未發(fā)現(xiàn)與直系親屬的肺癌病史有關。我們推測直系親屬無肺癌者發(fā)生EGFR突變者多，可能的情況有：直系親屬有肺癌的患者可能存在其他的易感基因多態(tài)性，這些基因多態(tài)性有可能與EGFR突變是互斥的關系；這需要進一步大樣本研究證實。

本研究結(jié)果顯示，不同臨床特征［包括病灶部位、性別、肺小結(jié)節(jié)術前影像學表現(xiàn)（是否是磨玻璃結(jié)節(jié)、多發(fā)或單發(fā)、是否有淋巴結(jié)腫大）、是否有肺炎病史、術前是否有臨床癥狀］的肺MIA患者癌組織中基因突變率比較無統(tǒng)計學差異，提示肺MIA的基因突變不受臨床因素的影響。而本研究中肺MIA患者的年齡在49.21歲左右，其中24.4%在40歲以下，54.7%的患者在50歲以上；提示肺癌越來越年輕化，早期發(fā)現(xiàn)及診斷尤其重要，早期發(fā)現(xiàn)肺MIA并及時手術切除可獲得100%無病生存率。本研究中雖然發(fā)現(xiàn)性別與基因突變發(fā)生無統(tǒng)計學差異，但肺MIA中女性患者居多，而且這些女性患者大部分沒有吸煙史，僅部分認為自己有被動吸煙史（25.8%）；提示肺MIA的發(fā)生與吸煙史無關，可能與其他的因素（如：女性會更容易進行CT體檢所以檢出率高［4］、環(huán)境、心理等）相關。

綜上所述，肺MIA癌組織易發(fā)生基因突變，其中最常見的是EGFR及ERBB2基因突變。有肺癌病史的肺MIA患者，癌組織中ERBB2突變發(fā)生率相對較高；直系親屬無肺癌病史的患者癌組織中發(fā)生EGFR突變相對較多。