王夢伊,李倩竹,張世武,舒 鳳,張偉華
(哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室,黑龍江 哈爾濱 150080)
線粒體是大多數(shù)真核細胞有氧呼吸的主要場所,負責(zé)為機體生命活動提供ATP,也參與維持離子平衡、傳遞信號、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和調(diào)控細胞凋亡。線粒體雙層膜上有負責(zé)運輸線粒體蛋白的轉(zhuǎn)運系統(tǒng),以保證其與胞質(zhì)間的物質(zhì)交換和信號傳遞。線粒體自身存在蛋白質(zhì)量控制機制,可以監(jiān)測線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)。線粒體轉(zhuǎn)運障礙會引起一系列應(yīng)激反應(yīng),激活線粒體降解途徑來恢復(fù)線粒體功能。線粒體功能障礙是代謝性疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生機制之一。近年來,很多研究表明糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者發(fā)生心力衰竭的主要原因。因此,研究糖尿病患者的心肌線粒體病變具有重要意義。
哺乳動物線粒體中,13種參與氧化磷酸化的核心蛋白由線粒體基因(mtDNA)編碼,另外1 000多種蛋白由核基因編碼,這些蛋白在胞質(zhì)合成前體,再進入線粒體進行加工整合。
TOM(translocase of the outer mitochondrial membrane)復(fù)合物是90%以上前體的入口,它由7種亞基構(gòu)成:Tom5、Tom6、Tom7、Tom20、Tom22、Tom40和Tom70。核心通道Tom40是一個跨外膜的β-桶狀蛋白。Tom20和Tom22可以識別前體N端的基質(zhì)定位信號(matrix-targeting signals,MTSs)。含有MTS樣信號(internal MTS-like signals,iMTS-Ls)的線粒體蛋白Atp1進入線粒體需要Tom70的存在,證明了Tom70主要識別iMTS-L[1]。Tom5和Tom6參與各亞基間的功能性連接,Tom7則與復(fù)合物的解離有關(guān)[2]。外膜SAM(sorting and assembly machinery)復(fù)合物由Sam35、Sam37、Sam50和輔因子Mdm10組成,負責(zé)整合外膜β-桶狀蛋白。β-桶狀蛋白參與線粒體和胞質(zhì)的物質(zhì)交換,Sam35(在哺乳動物中為metaxin2)特異性識別其C端的反向平行鏈。Sam37(在哺乳動物中為metaxin1)穩(wěn)定復(fù)合物的結(jié)構(gòu),還參與β-桶狀蛋白的釋放。Sam50是通道蛋白,Mdm10參與TOM復(fù)合物的組裝。外膜MIM(mitochondrial import machinery)復(fù)合物是一種陽離子門控通道,負責(zé)整合含α跨膜信號的外膜蛋白。在酵母菌中,Tom70識別到的前體經(jīng)MIM復(fù)合物插入外膜,而與SAM復(fù)合物結(jié)合的MIM還能促進TOM復(fù)合物的早期裝配過程[3]。
內(nèi)膜TIM23(translocase of the inner mitochondrial membrane)和PAM(presequence translocase-associa-ted motor)復(fù)合物介導(dǎo)大部分基質(zhì)蛋白和內(nèi)膜蛋白的轉(zhuǎn)運。TIM23復(fù)合物由Tim17、Tim21、Tim23和Tim50組成。Tim23是復(fù)合物的中心通道,與其結(jié)合的Tim17參與介導(dǎo)TIM23-PAM復(fù)合物的連接。最近的一項研究總結(jié)了Tim50的作用:識別前體蛋白的前導(dǎo)序列,并促進其轉(zhuǎn)移至Tim23通道中[4]。Tim21與Tom40和Tom22結(jié)合,連接TIM23-TOM復(fù)合物。PAM復(fù)合物主要包括Pam16/Tim16、Pam17、Pam18/Tim14、Tim44和mtHsp70。核心成分mtHsp70水解ATP供能,促進底物在Tim23通道中移動,其輔因子Pam18/Tim14和Pam16/Tim16調(diào)控ATP的水解與再生。Tim44維持PAM復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,介導(dǎo)TIM23-PAM復(fù)合物相互作用,Pam17促進前導(dǎo)序列穿過內(nèi)膜,Tim44幫助加工后的蛋白導(dǎo)入基質(zhì)。TIM22復(fù)合物由Tim18、Tim22、Tim54和Sdh3組成,負責(zé)整合內(nèi)膜載體蛋白。Tim22是復(fù)合物的核心通道,其缺乏會導(dǎo)致TIM22復(fù)合物失去結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[5]。Tim54與周圍的小Tim分子作用。呼吸復(fù)合物Ⅱ的亞基Sdh3也可以與Tim22相連,參與TIM22復(fù)合物的組裝[6]。膜間隙的小TIM復(fù)合物主要由Tim8、Tim9、Tim10、Tim12和Tim13組成,最近的一項研究揭示了其三維結(jié)構(gòu)特點[7]:Tim9-Tim10和Tim8-Tim13分別形成六聚體,可以特異性結(jié)合不同前體并使其保持易運輸?shù)纳扉L狀態(tài)。Tim12對內(nèi)膜的親和力較強,可以促進Tim9-Tim10靠近TIM22復(fù)合物。
60%的線粒體蛋白經(jīng)前導(dǎo)序列途徑進入線粒體,Tom20和Tom22負責(zé)識別此類蛋白N端帶正電的MTS(前導(dǎo)序列),前體通過Tom40通道后再由Tim50引導(dǎo)通過TIM23復(fù)合物,然后在mtHsp70的作用下單向運動進入基質(zhì)。線粒體加工肽酶(mitochondrial processing peptidase,MPP)切除前導(dǎo)序列后,在其他肽酶進一步的作用下,前體蛋白最終轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煨问?。沉默信息調(diào)節(jié)因子SIR2(silent information regulator 2)家族的Sirt3是一種由核基因編碼的線粒體去乙?;福梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)線粒體蛋白的乙?;絹碚{(diào)控線粒體的生理活動。Ⅱ型糖尿病小鼠心肌細胞線粒體中Sirt3的水平明顯下降,多種代謝關(guān)鍵酶處于高度乙?;癄顟B(tài),導(dǎo)致線粒體能量代謝紊亂[8]。Sirt3含有MTS,通過前導(dǎo)序列途徑進入線粒體。因此,檢測糖尿病心肌線粒體中TOM復(fù)合物或TIM23復(fù)合物各亞基的含量和活性可能有助于明確Sirt3減少的分子機制。
在MTS后含有疏水分選信號的內(nèi)膜蛋白經(jīng)過TIM23復(fù)合物,再由小疏水蛋白Mgr2介導(dǎo)側(cè)向釋放到內(nèi)膜;已進入基質(zhì)的內(nèi)膜蛋白(如Tim18)由內(nèi)膜蛋白Oxa1(oxidase assembly)介導(dǎo)整合。Tom70識別含iMTS-L的內(nèi)膜載體蛋白,然后蛋白經(jīng)Tom40跨越外膜,在小TIM復(fù)合物的幫助下經(jīng)TIM22橫向整合到內(nèi)膜。外膜β-桶狀蛋白(如Tom40)先經(jīng)Tom40進入膜間隙與小TIM復(fù)合物作用,然后經(jīng)SAM復(fù)合物整合到外膜。外膜α-螺旋蛋白(如Tom20)由Tom70識別后經(jīng)MIM直接插入外膜。膜間隙蛋白(如Tim12)多含特征性半胱氨酸序列,經(jīng)Tom40進入膜間隙。
線粒體蛋白的導(dǎo)入途徑復(fù)雜且靈活,各轉(zhuǎn)位酶可以重新組合成新的通路發(fā)揮作用,不同物種之間、同一物種不同組織之間,復(fù)合物的成分也有所改變。更多元的轉(zhuǎn)運途徑及其分子機制還有待進一步研究。
線粒體降解系統(tǒng)能在蛋白發(fā)生異常折疊、錯誤定位或結(jié)構(gòu)損傷時維持蛋白穩(wěn)態(tài)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)在線粒體質(zhì)量控制中起重要作用。泛素蛋白是UPS的降解標簽,其與底物的共價結(jié)合需要3種泛素酶催化:E1激活酶活化泛素,驅(qū)動其轉(zhuǎn)移至E2結(jié)合酶處,E3連接酶催化泛素與底物連接。第一個泛素與底物結(jié)合后,后續(xù)的泛素與其賴氨酸殘基相連,形成結(jié)構(gòu)不同的泛素鏈。泛素化蛋白的降解主要由26S蛋白酶體完成,這種蛋白酶體包含兩種亞基:19S識別并結(jié)合泛素化蛋白,引導(dǎo)其進入20S通道進行水解。
在線蟲中,線粒體未折疊蛋白應(yīng)答(mitochon-drial unfolded protein response,mtUPR)由轉(zhuǎn)錄因子Atfs-1(activating transcription factor associated with stress-1)介導(dǎo)。Atfs-1含有線粒體定位序列和核定位序列,正常情況下,線粒體基質(zhì)蛋白酶會迅速降解進入線粒體的Atfs-1。蛋白過度積累時,Atfs-1進入胞核,上調(diào)保護性分子伴侶和蛋白酶的表達,通過促進蛋白導(dǎo)入和折疊、增強UPS活性以及增加ATP的單獨產(chǎn)生來恢復(fù)線粒體功能;Atfs-1還會下調(diào)三羧酸循環(huán)途徑和氧化磷酸化途徑的酶來減少轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累。受損蛋白通過影響Atfs-1的定位來充當激活mtUPR的信號[9],可見mtUPR能通過調(diào)節(jié)多種代謝途徑來保護線粒蛋白穩(wěn)態(tài)和正常功能。酵母菌線粒體蛋白的導(dǎo)入減慢或過度積累會導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成抑制和蛋白酶體活性增強,這一過程稱為錯誤定位蛋白應(yīng)答(unfolded protein response activated by mistargeting of proteins,UPRam)[10]。在低等真核生物中,mtUPR和UPRam可能同時發(fā)生,也可能存在還未發(fā)現(xiàn)的特異性底物識別能力。哺乳動物的蛋白應(yīng)激反應(yīng)更復(fù)雜,mtUPR途徑中核基因表達的調(diào)控機制和關(guān)鍵蛋白還有待進一步研究。
線粒體相關(guān)降解(mitochondria-associated degradation,MAD)主要清除聚集在線粒體表面的蛋白。結(jié)合在酵母菌TOM復(fù)合物的降解蛋白Ubx2在外膜出現(xiàn)蛋白聚集體時招募ATP酶Cdc48/VCP,后者捕獲聚集體并交由蛋白酶體降解[11]。Ufd3(ubiquitin-fusion degradation protein 3)/Doa1和Vms1(VCP-associated mitochondrial stress-responsive 1)是Cdc48發(fā)揮作用所需的輔因子[12]。此外,外膜蛋白Msp1 (mitochondrial sorting of proteins 1)可以作為Cdc48的提取酶,負責(zé)清除來自其他細胞器的錯定位蛋白[13]。
受損蛋白應(yīng)答(mitochondrial compromised pro-tein import response,mitoCPR)是在酵母菌中新發(fā)現(xiàn)的質(zhì)量控制機制,積累的受損蛋白激活轉(zhuǎn)錄因子Pdr3(pleiotropic drug-resistant 3),上調(diào)轉(zhuǎn)位酶相關(guān)蛋白Cis1,促進Msp1移除受損蛋白。mitoCPR途徑還能保護mtDNA、恢復(fù)氧化還原電位并促進脂質(zhì)代謝[14]。哺乳動物中尚未發(fā)現(xiàn)mitoCPR,其分子機制也有待進一步研究。
線粒體內(nèi)的蛋白酶既負責(zé)降解受損蛋白,也參與正常生理條件下蛋白質(zhì)的加工和更新。Lon/Pim1(proteolysis in mitochondria 1)和ClpP(caseinolytic protease proteolytic subunit)是線粒體基質(zhì)中參與蛋白質(zhì)量控制的主要蛋白酶。Lon的底物是輕度氧化損傷的蛋白,如烏頭酸酶、轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)等[15]。小鼠體內(nèi)ClpP缺乏引起的代償反應(yīng)能預(yù)防飲食誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗[16]。m-AAA(matrix AAA prote-ase)和i-AAA(intermembrane space AAA protease)位于內(nèi)膜,分別降解基質(zhì)和膜間隙的受損蛋白。哺乳動物線粒體內(nèi)膜的Parl(presenilin associated rhomboid-like protein)蛋白酶參與Pgam5(phosphoglycerate mutase 5)等蛋白的更新[17]。凋亡相關(guān)蛋白酶HtrA2存在于膜間隙,HtrA2基因敲除鼠表現(xiàn)為線粒體ATP減少、ATP合成酶缺陷和膜電位下降,說明HtrA2可能參與ATP合成酶成分的翻譯后修飾[18]。
線粒體嚴重受損時會觸發(fā)自噬,哺乳動物中存在調(diào)控自噬的多條途徑。急性應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體自噬由Pink1(PTEN induced putative kinase 1)和E3連接酶Parkin介導(dǎo)。正常情況下,線粒體蛋白酶會立即降解進入線粒體的Pink1。線粒體去極化時,Pink1在外膜積累,招募并活化Parkin啟動自噬。缺乏Tom40會影響Pink1在線粒體的定位,降低線粒體自噬的效率,說明轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的缺陷不僅阻礙前體轉(zhuǎn)入,也會影響質(zhì)量控制機制[19]。哺乳動物的自噬受體Fundc1特異性調(diào)節(jié)低氧引起的自噬。正常情況下,磷酸化的Fundc1穩(wěn)定存在于線粒體外膜上,而低氧時,線粒體表面的Pgam5去磷酸化Fundc1而激活自噬。同時,外膜E3連接酶March5促進Fundc1泛素化降解,通過抑制線粒體自噬來增加低氧時的能量供應(yīng)。Fundc1基因敲除鼠在高脂喂養(yǎng)時表現(xiàn)出更嚴重的肥胖和胰島素抵抗,其白色脂肪組織的線粒體質(zhì)量控制機制受損[20]。線粒體各降解途徑共同維持線粒體和胞質(zhì)的蛋白穩(wěn)態(tài),未來的研究重點仍在于揭示這些途徑的分子機制。
糖尿病心肌病(DCM)是除冠心病、高血壓、先天性心臟病等已知心臟疾病之外,由糖尿病引起的心室收縮和舒張障礙,而心力衰竭是DCM嚴重的并發(fā)癥[21]。Ⅱ型糖尿病小鼠的心肌線粒體活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增多,氧化呼吸鏈復(fù)合物(如復(fù)合物Ⅰ、復(fù)合物Ⅲ和ATP合酶)酶活性減弱,ATP合成減少。此外,線粒體自噬標志物L(fēng)C3Ⅱ(light chain 3 Ⅱ)減少,表明DCM患者心肌線粒體的電子傳遞鏈(electron transport chain,ETC)活性降低,ROS生成增多,ATP產(chǎn)生減少,線粒體自噬能力下降。能量不足會降低轉(zhuǎn)運效率,引起前體積累和蛋白錯折疊,激活mtUPR;蛋白聚集體可能在轉(zhuǎn)位酶上積累,激活MAD。線粒體內(nèi)ROS增多會激活Lon-ClpP途徑,通過降解呼吸復(fù)合物減少ROS的產(chǎn)生[15]。ETC功能障礙引起的線粒體去極化導(dǎo)致自噬,缺乏Parkin的糖尿病小鼠心肌線粒體自噬受到抑制,并伴有脂質(zhì)蓄積和DCM加重,而激活線粒體自噬則可以預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的DCM[22]。
Hsp60上調(diào)可以看作低等生物發(fā)生mtUPR的標志,而Ⅱ型糖尿病小鼠細胞中Hsp60含量下降[24]。這可能是DCM中mtUPR途徑受阻而導(dǎo)致受損蛋白過度積累的原因。糖尿病心肌線粒體的ETC復(fù)合物成分缺失導(dǎo)致其活性受到抑制,ATP產(chǎn)生減少。缺乏能量既可以通過影響心肌線粒體的蛋白平衡間接損傷心肌,也可以直接降低心臟舒張和收縮能力,造成心力衰竭。此外,ROS增多也會降低UPS的效率。環(huán)境改變或線粒體缺陷引起的急性氧化應(yīng)激使蛋白酶體26S解離,導(dǎo)致有待降解的蛋白積累。這種蛋白酶體分解是可逆的,去除應(yīng)激源或給予抗氧化劑可以改善泛素化蛋白的更新效率,最近的一項研究進一步確定了線粒體代謝與泛素依賴性蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)之間存在密切關(guān)系[25]。相比之下,長期暴露在高ROS和高糖高脂環(huán)境中造成的UPS失活更容易導(dǎo)致線粒體破碎和細胞死亡,因此保護糖尿病患者心肌的UPS可能成為改善心功能的關(guān)鍵措施之一。
轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和降解系統(tǒng)的正常運作是保證線粒體健康的重要前提。在TOM、PAM、TIM23和TIM22等轉(zhuǎn)位酶復(fù)合物的協(xié)作下,轉(zhuǎn)運系統(tǒng)將重要的線粒體蛋白以前體形式運送至對應(yīng)的亞區(qū)進行下一步加工和組裝;而降解系統(tǒng)則通過mtUPR、MAD等途徑最大限度地維持蛋白穩(wěn)態(tài)平衡。通過對已有研究的梳理發(fā)現(xiàn),DCM與這兩個系統(tǒng)的關(guān)系密不可分。ETC的破壞導(dǎo)致ATP生成減少和ROS積累,ROS增多進一步損傷ECT復(fù)合物,形成惡性循環(huán)。這些因素都會對轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和降解系統(tǒng)造成不同程度的負面影響(圖1)。
圖1 DCM線粒體功能障礙的機制Fig 1 Mechanisms of mitochondrial dysfunction in DCM
目前為止,大部分的實驗以酵母菌、線蟲等為主要對象,但人類線粒體中轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和降解系統(tǒng)的成分與低等真核生物之間仍存在不同程度的差異,未來的研究應(yīng)圍繞哺乳動物以及人類細胞展開,致力于確定線粒體蛋白質(zhì)量控制的分子機制和糖尿病心肌線粒體存在的相關(guān)缺陷。mtUPR在人體中如何調(diào)控核基因表達和胞質(zhì)蛋白翻譯?MAD途徑所能降解的底物還有哪些?糖尿病心肌細胞中有哪些相關(guān)基因的表達受到抑制?在今后的科研中,線粒體仍然是糖尿病等代謝疾病的研究熱點,通過實驗進一步探究其在糖尿病心肌中發(fā)生的變化及分子機制可能為治療DCM提供新的思路。