張訓(xùn)男，彭春艷，李顯東，張吉才

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)十堰市太和醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北十堰 442000；2.十堰市太和醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北十堰 442000）

冠心?。╟oronary artery disease，CAD）是影響世界人口的主要心血管疾病之一，也是導(dǎo)致發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家死亡的主要原因[1]。高血壓是CAD 的重要致病因子[2]，血壓升高可以引起微血管病變，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈儲(chǔ)備能力下降，引起冠狀動(dòng)脈病變[3]；也可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化。脂代謝紊亂，其癥狀表現(xiàn)為血漿三酰甘油（TG）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平的升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平的降低，被認(rèn)為是CAD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化[4-5]。SREBPs 作為脂質(zhì)合成轉(zhuǎn)錄因子，是處于調(diào)控脂質(zhì)代謝核心的一類關(guān)鍵基因[6]，大量研究表明固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element binding protein SREBPs）是導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂的重要分子[7]。其中與膽固醇合成和攝取相關(guān)的基因，是由SREBP-2 控制的，而SREBP-1 主要調(diào)控脂肪生成關(guān)鍵酶[8-9]。

在本研究中，我們檢測(cè)了CAD 患者SREBPs相對(duì)表達(dá)水平，以探討其表達(dá)水平與冠心病并發(fā)高血壓患者發(fā)病的相關(guān)性，以及與脂代謝紊亂的關(guān)系，旨在對(duì)CAD 并發(fā)高血壓的早期診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

急性心力衰竭等其他系統(tǒng)嚴(yán)重性疾病。最終納入CAD 患者196 例，根據(jù)患者血壓和血脂水平，將患者分為CAD 并發(fā)高血壓組（共126 例，平均年齡59.68±8.78 歲，其中男性76 例，女性50 例）和單純CAD 組（共70 例，平均年齡57.73±10.27歲，其中男性51 例，女性19 例）。在體檢中心選擇178 例健康體檢者作為對(duì)照組，平均年齡57.74±8.48 歲，其中男性106 例，女性72 例。三組研究對(duì)象間年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性（P> 0.05）。所有研究對(duì)象均簽訂知情同意書。使用SYNTAX 網(wǎng)頁（www.syntaxscore.com）對(duì)CAD 并發(fā)高血壓組126 例患者的造影結(jié)果進(jìn)行評(píng)分：低危組0～22 分，中危組23 ～32 分，高危組≥33 分。其中0～22 分為低風(fēng)險(xiǎn)組，共71 例；≥ 33 分為高風(fēng)險(xiǎn)組，共55 例。

1.1 研究對(duì)象 選取2017年6月～2018年5月十堰市太和醫(yī)院心內(nèi)科經(jīng)冠脈造影確診為CAD 的患者為研究對(duì)象。診斷標(biāo)準(zhǔn)：高血壓參照2018年修訂版《中國高血壓防治指南》[10]；血脂異常參照2016年修訂版《中國成人血脂異常防治指南》[11]。冠心病患者納入標(biāo)準(zhǔn)：一支及以上主冠狀動(dòng)脈狹窄> 70%，或左主冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有冠狀動(dòng)脈搭橋或冠狀動(dòng)脈支架植入手術(shù)史、陳舊性心肌梗死、嚴(yán)重心臟瓣膜疾病病史、

1.2 儀器與試劑 TRIZOL 試劑來自美國Invitrogen 公司，HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR 試劑盒和ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix 試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。qPCR 引物購自武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。ABI ViiA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀來自美國Life 公司。TC，TG，HDL-C，LDL-C，脂蛋白a[LP（a）]和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒購自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司；Apo-A1， Apo-B，高敏C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）和同型半胱氨酸（HCY）采用重慶中元生物技術(shù)有限公司試劑盒檢測(cè)；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）和羥丁酸脫氫酶（HBDH）試劑盒購自北京利德曼生化股份有限公司；胱抑素C（Cys-C）和糖化血清蛋白（GSP）采用浙江夸克生物科技有限公司試劑盒檢測(cè)。以上生化指標(biāo)的檢測(cè)均采用德國西門子生物醫(yī)療電子有限公司ADVIA 2400 全自動(dòng)生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 生化代謝指標(biāo)檢測(cè)： 所需檢測(cè)的血清/血漿樣品凍存于-80 ℃，所有指標(biāo)的檢測(cè)均在十堰市太和醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。

1.3.2 SREBPs 相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)：使用TRIZOL法提取外周血白細(xì)胞總RNA，取1 μg 總RNA 經(jīng)42℃ 2min，50℃ 15min，85℃ 5s 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板采用SYBR Green I 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)，PCR 引物序列見表1。

表1 qPCR 引物序列

反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，62 ℃ 34 s，72℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)，采用2－△△Ct進(jìn)行結(jié)果分析及計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0 軟件（Chicago，美國）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK 法檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)[四分位數(shù)間距]表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。分類變量采用卡方檢驗(yàn)。運(yùn)用Pearson（符合正態(tài)分布的計(jì)量資料）或Spearman（非正態(tài)分布的計(jì)量資料）分析SREBPs 與各生化代謝指標(biāo)之間的相關(guān)性，采用ROC 曲線及曲線下面積反映SREBPs 相對(duì)表達(dá)水平在CAD 診斷中的準(zhǔn)確性（0.7～0.9 表示有一定準(zhǔn)確性，0.9 ～1.0 表示準(zhǔn)確性較高）。P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組研究對(duì)象各生化指標(biāo)結(jié)果比較 見表2。單 純CAD 組TC，HDL-C，LDL-C，Apo-A1 和Apo-B 水平均低于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P< 0.001）；CAD 并發(fā)高血壓組LP(a)高于對(duì)照組，而TC，HDL-C，LDL-C，Apo-A1 和Apo-B水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001）。相較于對(duì)照組，單純CAD 組及CAD 并發(fā)高血壓組hs-CRP 和CK-MB 增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P< 0.001）。

表2 對(duì)照組、單純CAD 組和CAD 合并高血壓組間各生化指標(biāo)結(jié)果比較

2.2 SREBPs mRNA 表達(dá)水平 見圖1。單純CAD 組SREBP-1 及SREBP-2 mRNA 表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P> 0.05），而CAD 并發(fā)高血壓組SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平低于對(duì)照組及單純CAD 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。

圖1 三組SREBPs mRNA 表達(dá)水平散點(diǎn)圖

2.3 SREBPs mRNA 表達(dá)水平與各生化指標(biāo)的相關(guān)性 見表3。分析所有研究對(duì)象的SREBPs 相對(duì)表達(dá)水平與各生化代謝指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示SREBP-1 與TC，LDL-C，HDL-C，Apo-A1，Apo-B，CysC 和GSP 呈正相關(guān)（均P< 0.05），與CK-MB，HBDH，hs-CRP 和HCY 呈負(fù)相關(guān)（均P< 0.05）。SREBP-2 與AST，LDH，HBDH 呈負(fù)相關(guān)（均P< 0.05）。

表3 SREBPs 相對(duì)表達(dá)水平與各生化代謝指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 對(duì)照組及CAD 并發(fā)高血壓組SREBP-1 mRNA表達(dá)與血壓水平的相關(guān)性 見圖2。將對(duì)照組及CAD 并發(fā)高血壓組SREBP-1 分別與各組的舒張壓及收縮壓做相關(guān)性分析，兩組研究對(duì)象中SREBP-1與舒張壓及收縮壓均無相關(guān)性（均P> 0.05）。

圖2 SREBP-1 與血壓相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.5 SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平與CAD 并發(fā)高血壓的相關(guān)性 見表4。為了探究SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平與CAD 相關(guān)性，在校正了相關(guān)混雜因素后進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析。結(jié)果所示，SREBP-1是CAD 并發(fā)高血壓的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，OR = 0.210，95% CI = 0.079～0.561（P= 0.002），與年齡、性別、糖尿病及高脂血癥無關(guān)。

表4 SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平與CAD 并發(fā)高血壓組風(fēng)險(xiǎn)因素分析

2.6 SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平在CAD 并發(fā)高血壓中的診斷價(jià)值 見表5。采用ROC 曲線分析低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組的SREBP-1 表達(dá)水平，同時(shí)將SREBP-1 分別與血脂（TC，TG，HDL，LDL）進(jìn)行聯(lián)合分析。結(jié)果顯示SREBP-1 單獨(dú)作為預(yù)測(cè)CAD 并發(fā)高血壓嚴(yán)重程度的指標(biāo)時(shí)，AUC 面積及敏感度較低，AUC 為0.580(0.503～0.657），敏感度為38.9%（P= 0.045）；聯(lián)合TC 時(shí)敏感度較高，特異度不高，AUC 為0.600(0.522～0.677），敏感度為86.3%，特異度為33.3%（P= 0.013）；聯(lián)合HDL 后敏感度不高，特異度較高，AUC 為0.603(0.527～0.679），敏感度為38.9%，特異度為78.2%（P= 0.010）。

表5 外周血白細(xì)胞SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平用來預(yù)測(cè)CAD 并發(fā)高血壓危險(xiǎn)程度的ROC 曲線分析結(jié)果

3 討論

CAD 是一種由遺傳、環(huán)境等多因素和多機(jī)制參與的復(fù)雜心血管疾病。動(dòng)脈粥樣硬化作為一種慢性炎癥性疾病，是CAD 的病理基礎(chǔ)，其發(fā)生發(fā)展的過程涉及血管壁沉積的脂質(zhì)、細(xì)胞因子、炎癥因子等[12-13]。

脂質(zhì)代謝紊亂是CAD 發(fā)病進(jìn)程中的重要一環(huán)，過剩的脂質(zhì)沉積在動(dòng)脈管壁是導(dǎo)致動(dòng)脈斑塊形成的始動(dòng)因素。脂質(zhì)代謝受到一系列轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后機(jī)制的調(diào)控。SREBPs 是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞內(nèi)膽固醇敏感的脂代謝調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，通過INSIGSREBP-SCAP 途徑對(duì)胞內(nèi)的膽固醇進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)。主要包含兩個(gè)家族成員SREBP-1 和SREBP-2。其中SREBP-1 基因定位于17p11.2，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1 是控制脂肪生成的關(guān)鍵因子，可激活其下游效應(yīng)器乙酰輔酶A（CoA）羧化酶、脂肪酸合成酶、硬脂酰輔酶A 去飽和酶和甘油3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶，調(diào)控脂肪酸和三酰甘油的代謝[14-16]。SREBP-2 基因定位于22q13.2，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子SREBP-2 是調(diào)節(jié)膽固醇代謝的主轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)參與膽固醇生物合成的基因具有高選擇性[17-18]，例如羥甲基戊二酰（hydroxymethylglutaryl，HMG）-CoA合酶、HMG-CoA 還原酶、法呢酰焦磷酸合成酶、角鯊烯合成酶和低密度脂蛋白受體。這些轉(zhuǎn)錄因子增加缺乏脂質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)膽固醇和脂肪酸的合成和攝取[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者和單純CAD 患者相比，CAD 并發(fā)高血壓患者SREBP-1 表達(dá)水平顯著降低。從轉(zhuǎn)錄水平上來說，SREBP-1 mRNA 可以在胰島素的刺激下激活肝臟X 受體對(duì)其的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，同時(shí)SREBP-1 本身的調(diào)控也存在負(fù)反饋調(diào)控環(huán)路，此外,PI3K/SKT/mTORC1 通路可以激活SREBP 的表達(dá)，促進(jìn)其對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)控[20]。作為脂質(zhì)調(diào)控通路特別是脂肪酸和三酰甘油代謝中重要的轉(zhuǎn)錄因子，下調(diào)的SREBP-1 可能與高血壓CAD 患者血漿中增高的TG 水平有關(guān)；另外一個(gè)重要的原因可能是脂質(zhì)的堆積阻滯了SREBP-SCAP符合體的轉(zhuǎn)運(yùn)和剪切成熟，從而破壞了細(xì)胞脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài)；過量的脂質(zhì)并未有效地激活SREBP 的表達(dá)。

高血壓及血脂代謝紊亂是CAD 的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素[3]。有證據(jù)表明血脂異常和高血壓的發(fā)生密切關(guān)聯(lián)[21]。高血壓患者血壓升高，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血小板和單核細(xì)胞黏附于血管壁上，內(nèi)膜表面不平滑，導(dǎo)致更多的血小板和單核細(xì)胞黏附聚集在內(nèi)膜上，這些黏附物釋放生長因子，與炎癥因子及沉積的脂質(zhì)聯(lián)合觸發(fā)動(dòng)脈粥樣斑塊的形成；血壓升高造成微血管病變，進(jìn)而導(dǎo)致冠脈儲(chǔ)備能力下降，誘發(fā)冠脈病變。隨著高血壓患病時(shí)間的延長，動(dòng)脈硬度增加，順應(yīng)性降低，動(dòng)脈硬化性心腦血管病的發(fā)生率顯著增加[22]。HALPERIN 等[23]報(bào)道，與具有最低五分位數(shù)（0～20%）的TC，非HDL-C 和TC / HDL-C比例的男性相比，具有最高五分位數(shù)（80%～100%）的男性患高血壓風(fēng)險(xiǎn)比例分別增加23%，39%和54%。VALLE 等[24]研究發(fā)現(xiàn)重組松弛素Serelaxin可以減輕心肌缺血/再灌注損傷，WANG 等[25]進(jìn)一步證明Serelaxin 通過下調(diào)SREBP-1c 和SREBP-2的表達(dá)來減少脂質(zhì)積累，顯著降低脫氧皮質(zhì)酮醋酸鹽大鼠的收縮壓。此外，據(jù)報(bào)道SREBP 裂解激活蛋白（SREBP cleavage-activating protein，SCAP）的遺傳多態(tài)性rs12487736 和rs12490383 與超重/肥胖的中國兒童的血壓相關(guān)[26]。另有研究證實(shí)，纖維母細(xì)胞生長因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）的治療性給藥可能通過抑制SREBP-1 降低飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠血清和肝臟三酰甘油水平并改善脂肪肝。用FGF21 治療4 周后肥胖小鼠的血壓恢復(fù)正常，同時(shí)改善高血壓大鼠血清脂質(zhì)譜[27-29]。LEE 等[30]通過致動(dòng)脈粥樣硬化飲食建立動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，使用代謝和脂質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)小鼠的血清樣本存在代謝紊亂。在致動(dòng)脈粥樣硬化飲食早期階段（8 周），小鼠心臟中SREBP-1 表達(dá)水平升高；在連續(xù)喂養(yǎng)至25 周后，SREBP-1 表達(dá)呈下降趨勢(shì)。以上研究均證明SREBP-1 可能參與高血壓的發(fā)病機(jī)制。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SREBP-1 水平的降低是高血壓CAD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在高風(fēng)險(xiǎn)復(fù)雜性CAD 患者中，SREBP-1 mRNA 的水平顯著降低。因此我們推測(cè)異常的脂質(zhì)代謝水平可能和高血壓互為致病促進(jìn)因子。然而在對(duì)SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平與血壓進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析后，我們發(fā)現(xiàn)兩者并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的相關(guān)性，這一結(jié)果提示高血壓和脂質(zhì)代謝可能具有復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，在心血管疾病的發(fā)生機(jī)制中可能構(gòu)建了調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要的一環(huán)。此外本研究存在的局限性也可能對(duì)血壓和SREBP-1基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)產(chǎn)生了影響：樣本量較少；缺乏對(duì)于冠心病疾病嚴(yán)重程度的分層研究；研究對(duì)象使用藥物對(duì)于結(jié)果潛在的影響。這些內(nèi)容需在下一步的研究中加以完善。