周 娟，竺 青，孫桂芝，張紅衛(wèi)，郭成山，賀韋東，陳 敏

（1.山東省血液中心機采科，濟南 250014；2.深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳 518101）

我國是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染高發(fā)區(qū)，HBV 感染不僅可導致急性慢性病毒性肝炎，同時與肝硬化和肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，嚴重影響人類健康[1]。隱匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI） 即血清或肝組織中乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）檢測陰性而實時熒光定量PCR（real-time quantitative，RT-qPCR）技術檢測HBV 陽性[2-3]。OBI 是HBV 感染的一種特殊類型，可通過輸血、器官移植、血液透析等方式傳播，是導致HBV 感染發(fā)生典型乙型肝炎的主要原因之一[4]。目前研究認為OBI 可能與HBV S 基因等基因突變有關[5]，白細胞介素-28b（interleukin-28b，IL-28b）是一種重要細胞因子，在HBV 感染進程中發(fā)揮重要作用，其基因多態(tài)性與乙型肝炎病程密切相關[6-7]，但關于其rs8099917 位點、rs12979860 位點多態(tài)性與OBI 的關系尚鮮有研究。因此本研究以單采獻血者為研究對象，探究OBI 與IL-28b 基因rs8099917位點、rs12979860 位點多態(tài)性的關系，以期為臨床OBI 發(fā)生發(fā)展機制研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月～2019年12月山東省血液中心成功捐獻血小板的獻血者1 158 例為研究對象。納入標準：①年齡18～55 歲；②均經(jīng)酶免疫檢測和核酸檢測HBsAg、丙肝病毒檢測（hepatitis c virus，HCV）和人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）陰性合格者；③無血緣關系的本地常住居民；④至少成功捐獻1 次血小板者。本研究經(jīng)過山東省血液中心道德倫理委員會批準通過。

1.2 主要儀器及試劑 血清乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、表面抗體（hepatitis B surface antibody，HBsAb）、e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、e 抗體（hepatitis B e antibody，HBeAb）和核心抗體（hepatitis B core antibody，HBcAb），試劑盒貨號:YZB/國3575-2014，國食藥監(jiān)械（準）字2014 第3401094 號，購自深圳邁瑞生物醫(yī)療；DNA 提取試劑盒（貨號：DP348）購自北京雅安達生物技術有限公司；PureLink PCR 純化試劑盒（貨號：K310001）購自美國Thermo Fisher 公司；cobas HBV 定量核酸檢測試劑盒購自羅氏公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Architect 分析儀購自美國雅培公司；7500 RT-qPCR 儀購自Thermofisher 公司等。

1.3 方法

1.3.1 資料收集: 收集每個獻血者獻血時性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、獻血狀態(tài)等臨床資料及血液標本。

1.3.2 血清學指標檢測:使用Architect 分析儀采用自動化化學發(fā)光酶免疫分析法對獻血者進行HBsAg、抗HCV 抗體和抗HIV 抗體檢測。使用化學發(fā)光免疫分析法對檢測結(jié)果為陰性的受試者進行anti-HBs 和anti-HBc 的進一步檢測。anti-HBs ≥10.0 mIU/ml 和anti-HBc ≥1.0 s/CO 滴度時為陽性。

1.3.3 DNA 提取及IL-28b 基因多態(tài)性檢測 :采用全基因組DNA 提取試劑盒提取所有獻血者血液DNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。IL-28b 基因rs 8099917 位點上游引物序列（5’→3’）：TTCA CCATCCTCCTCTCATCCCTCAT，下游引物序列（5’ →3’）：TCCTAAATTGACGGGCCATCT；rs12979860 位點上游引物序列（5’→3’）：CTTAT CGCATACGGCTAGGCGTTTC，下游引物序列（5’→3’）：GGACCGCTACGTAAGTCACC。反應條件：95℃ 預變性5 min；95℃變性30 s，64℃退火1 min，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物置于4℃保存。采用DNA 純化回收試劑盒純化回收后送上海生工生物工程股份有限公司進行基因測序。

1.3.4 HBV-DNA 病毒載量檢測:采用cobas HBV定量核酸檢測試劑盒檢測獻血者血液HBV-DNA 載量，具體操作參照試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0 版軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2或Fisher 確切概率法檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗。采用Pearsonχ2檢驗IL-28b 基因rs8099917 位點、rs12979860位點哈代-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡。采用Logistic 回歸分析影響OBI 發(fā)生的因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴增結(jié)果分析 見圖1。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，產(chǎn)物條帶單一，產(chǎn)量高且無明顯引物二聚體。

圖1 PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 OBI 與非OBI 獻血者IL-28b 基因多態(tài)性Hardy-Weinberg 平衡檢驗 1 158 例單采獻血者中anti-HBs 或（和）anti-HBc 陽性者301 例（25.99%），其 中18～30 歲133 例（11.48%），31～49 歲100例（8.64%），50～55 歲68 例（5.87%）。進一步進行HBV-DNA 檢測發(fā)現(xiàn)301 例獻血者中HBVDNA 陽性即OBI 者46 例（15.28%），非OBI 者255 例（84.72%）。OBI 與非OBI 獻血者IL-28b基因rs8099917 位點、rs12979860 位點基因型分布均符合哈代-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡定律（χ2=4.589，0.812 和3.535，4.889，P=0.101，0.666和0.171，0.087），具有群體代表性。

2.3 OBI 與非OBI 獻血者IL-28b 基因rs8099917位點、rs12979860 位點多態(tài)性 見表1。與非OBI比較，OBI 獻血者IL-28b 基因rs8099917 位點G 等位基因頻率、TG+GG 基因型頻率顯著降低，T 等位基因頻率、TT 基因型頻率顯著增加（P＜0.01）；rs12979860 位點T 等位基因頻率、CT+TT 基因型頻率顯著降低，C 等位基因頻率、CC 基因型頻率顯著增加，以上比較差異均有統(tǒng)計學意義。

表1 IL-28b 基因rs8099917 位點、rs12979860 位點等位基因、基因型分布[%（n）]

2.4 OBI 獻血者IL-28b 基因rs8099917 位點、rs12979860 位點多態(tài)性與HBV-DNA 載量的關系 見表2。OBI 獻血者IL-28b 基因rs8099917 位點、rs12979860 位點多態(tài)性與HBV-DNA 載量有關（P＜0.01），其中rs8099917 位點，與TT 基因型比較，TG+GG 基因型患者HBV-DNA 載量顯著降低（P＜0.01）；rs12979860 位點，與CC 基因型比較，CT+TT 基因患者HBV-DNA 載量顯著降低，以上比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表2 OBI 獻血者IL-28b 基因rs8099917 位點、rs12979860 位點多態(tài)性與HBV-DNA 載量關系（±s）

表2 OBI 獻血者IL-28b 基因rs8099917 位點、rs12979860 位點多態(tài)性與HBV-DNA 載量關系（±s）

基因型nHBV-DNA（IU/ml）tP rs8099917 TT3713.76±1.42 5.2570.000 TG+GG911.03±1.29 rs12979860 CC3528.94±2.41 17.3980.000 CT+TT1115.37±1.63

2.5 IL-28b 基因rs8099917 位點、rs12979860 位點多態(tài)性與OBI 發(fā)生的關系 見表3。采用Logistic 回歸分析IL-28b 基因rs8099917 位點、rs12979860 位點多態(tài)性與OBI 發(fā)生的關系，結(jié)果顯示，rs8099917位點，與TT 基因型比較，TG+GG 基因型可顯著降低OBI 發(fā)生風險（P＜0.05）；rs12979860 位點，與CC 基因型比較，CT+TT 基因型可顯著降低OBI發(fā)生風險（P＜0.05）。

表3 IL-28b 基因rs8099917 位點、rs12979860 位點多態(tài)性與OBI 發(fā)生Logistic 回歸分析

3 討論

近年來盡管隨著核酸檢測（nucleic acid testing，NAT）技術的發(fā)展普及，HBsAg（-）/HBV-DNA（+）血樣檢出率顯著提高，可在一定程度上降低HBV輸血傳播風險，但NAT 檢測存在窗口期，對于感染HBV 40 天內(nèi)患者其檢出率極低[8-9]，另HBV S基因存在免疫逃逸突變等特點[10-11]，臨床應用存在一定局限。有研究報道，高流行區(qū)70%～90%人口先前暴露于HBV 流行區(qū)供血者中，OBI 發(fā)生率可達7%～19%，而低流行區(qū)也有近0%～9%OBI患者[12-13]。本研究結(jié)果顯示，1 158 例單采獻血者中anti-HBs 或（和）anti-HBc 陽性者301 例，占25.99%，進一步進行HBV-DNA 檢測發(fā)現(xiàn)301 例獻血者中HBV-DNA 陽性即OBI 者46 例，高達15.28%，非OBI 者255 例，占84.72%。本研究結(jié)果與上述有關研究結(jié)果存在一定的沖突，導致此種現(xiàn)象的原因可能是由于納入樣本量不同以及研究地區(qū)不同導致結(jié)果存在一定的差異，同時也提示我們對單采獻血者僅采用常規(guī)檢測方法可能存在OBI 漏診或誤診的風險，因此急需尋找靈敏度高的檢測手段加以輔助，另探究OBI 發(fā)生機制可能對減少OBI發(fā)生及增加其檢出率具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，宿主年齡、性別及基因多態(tài)性可能影響其抵抗HBV 感染的效果[14]，IL-28b 基因編碼的λ3 干擾素具有抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等生物作用，IL-28b 基因變異，其中位于其啟動子上游8 kb的rs8099917 位點及基因上游3 kb 的rs12979860位點與丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、HBV 對感染后自發(fā)清除及對干擾素治療應答效果密切相關[15-16]。LI 等[17]研究報道，IL-28b 基因變異與HBV 病毒載量和肝臟炎癥有關，IL-28b 基因rs12979860 位點、rs12980275 位點及rs8099917 變異可能通過降低病毒載量和肝臟炎癥來阻止HBV進展。談國蕾等[18]研究報道，江蘇地區(qū)漢族人群IL-28b 基因多態(tài)性與HBV 感染后不同疾病表型相關，IL-28b 基因rs12979860 位點C 等位基因和rs8099917 位點T 等位基因可能是促進HBV 感染后病情進展的影響因素?；诖?，本研究推測IL-28b基因rs12979860 位點及rs8099917 位點多態(tài)性可能與OBI 發(fā)生存在一定相關性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非OBI 比較，OBI 獻血者IL-28b 基因rs8099917位點G 等位基因頻率、TT+GG 基因型頻率顯著降低，T 等位基因頻率、TT 基因型頻率顯著增加；rs12979860 位點T 等位基因頻率、CT+TT 基因型頻率顯著降低，C 等位基因頻率、CC 基因型頻率顯著增加，且均與OBI 獻血者HBV-DNA 載量有關，與談國蕾等[18]研究基本相符，提示本研究推測正確，IL-28b 基因rs12979860 位點及rs8099917 位點多態(tài)性與OBI 發(fā)生發(fā)展及HBV 感染有關。

為進一步探究IL-28b 基因rs8099917 位點、rs12979860 位點多態(tài)性與OBI 發(fā)生的關系，本研究采用Logistic 回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs8099917 位點，與TT 基因型比較，TG+GG 基因型可顯著降低OBI發(fā)生風險；rs12979860 位點，與CC 基因型比較，CT+TT 基因型可顯著降低OBI 發(fā)生風險，提示檢測IL-28b 基因rs8099917 位點、rs12979860 位點多態(tài)性可能對OBI 發(fā)生評估及對其檢出率增加有一定輔助作用，可能對臨床應用有一定參考價值。

綜上所述，單采獻血者中OBI 可能與IL-28b基因rs8099917 位點、rs12979860 位點多態(tài)性有關，本研究可能對OBI 治療及檢出提供了一個有價值的基因工具。但關于IL-28b 基因rs8099917 位點、rs12979860 位點多態(tài)性與OBI 發(fā)生發(fā)展的關系可能會受到不同地區(qū)種族遺傳結(jié)構(gòu)及樣本量選擇的影響，具體機制也尚不明確，可能導致結(jié)果存在一定偏倚，提示后期應擴大樣本量，采取多中心全方面的研究，同時也提示在臨床輸血中應嚴格掌握用血適應癥，提倡對患者實施自體輸血，以減少感染發(fā)生。