杜 昆，杜寧超，劉安文，廖木春，陳小嵐

(1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭 515041；2．深圳市第二人民醫(yī)院肛腸外科，廣東 深圳 518035；3．深圳市第二人民醫(yī)院胃腸外科，廣東 深圳 518035)

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球結(jié)直腸癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第4位，死亡率排名第2位[1]。我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率在所有癌癥中居第3位，死亡率居第5位，且發(fā)病人數(shù)與死亡人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)[2-3]。手術(shù)是非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者最主要的治療方式，探究影響手術(shù)患者預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)并在術(shù)前和術(shù)后進(jìn)行預(yù)后分層有利于制定個(gè)體化的治療策略。TNM分期系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的腫瘤分期系統(tǒng)，在腫瘤規(guī)范化診斷和治療方面有著極為重要的作用，自其誕生以來(lái)便進(jìn)行不斷的完善。美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第 8 版腫瘤分期系統(tǒng)基于一些基礎(chǔ)及臨床研究做出一系列的更新，如將腹膜轉(zhuǎn)移更新為M1c期，增加了微衛(wèi)星不穩(wěn)定和KRAS、NRAS、BRAF基因突變等附加的相關(guān)指標(biāo)[4]。

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是一種參與細(xì)胞黏附的糖蛋白，目前已成為結(jié)直腸癌臨床應(yīng)用最為廣泛的腫瘤標(biāo)志物，在術(shù)后隨訪過(guò)程中CEA水平升高應(yīng)警惕腫瘤的進(jìn)展、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的可能[5]。這提示CEA可能是結(jié)直腸腫瘤生物學(xué)侵襲性的標(biāo)志物，但是臨床中并非所有的結(jié)腸癌患者術(shù)前CEA水平均會(huì)升高，因此術(shù)前CEA水平升高的患者相較于術(shù)前CEA水平正常的患者預(yù)后是否更差？本研究探討術(shù)前CEA水平對(duì)Ⅰ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者術(shù)后預(yù)后的影響及將術(shù)前CEA水平與結(jié)腸癌AJCC分期相結(jié)合后能否提高對(duì)Ⅰ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)能力，并最終也能成為AJCC分期中指導(dǎo)臨床實(shí)踐的附加指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

SEER數(shù)據(jù)庫(kù)(https://seer.cancer.gov/)記錄了美國(guó)部分州縣上百萬(wàn)名惡性腫瘤患者的患病情況信息。數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)信息通過(guò)SEERStat軟件進(jìn)行統(tǒng)一和規(guī)范，并定期更新發(fā)布。我們申請(qǐng)獲得SEER數(shù)據(jù)庫(kù)的授權(quán)，從數(shù)據(jù)庫(kù)“SEER Research Data，9 Registries，Nov 2019 Sub(1975—2017)”中納入2010—2015年診斷為結(jié)腸癌的患者。排除AJCC分期不明、AJCC分期0期及Ⅳ期、未行結(jié)腸癌根治性切除術(shù)、術(shù)前CEA水平缺失以及結(jié)局指標(biāo)不明確(死因不明)的患者。根據(jù)術(shù)前CEA水平將患者分為正常組(≤5.0 ng/mL)與升高組(＞5.0 ng/mL)。

1.2 收集變量

患者基線指標(biāo)包括年齡、種族和性別，腫瘤相關(guān)指標(biāo)包括腫瘤位置、分化程度、淋巴結(jié)檢出數(shù)目、神經(jīng)浸潤(rùn)情況、癌結(jié)節(jié)及AJCC分期(第7版)。結(jié)局指標(biāo)為患者癌癥特異性生存期(cancer specific survival，CSS)，定義為患者從明確診斷到觀察到因?yàn)榻Y(jié)腸癌而死亡的時(shí)間，死于其他原因或末次隨訪中仍然存活的患者定義為刪失數(shù)據(jù)，記錄末次隨訪時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用EmpowerStats、R軟件及GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的連續(xù)變量以xˉ±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的連續(xù)變量以中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(Q1,Q3)]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。分類(lèi)變量表示為例數(shù)及百分比，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Kaplan-Meier法估計(jì)CSS，采用Log-rank檢驗(yàn)對(duì)生存差異進(jìn)行評(píng)估，采用Cox回歸模型分別進(jìn)行單因素及多因素回歸分析評(píng)估術(shù)前CEA水平的預(yù)后作用。為了進(jìn)一步進(jìn)行敏感性分析，我們分別構(gòu)建3個(gè)回歸模型，結(jié)果為風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)并給出95%置信區(qū)間。在模型1中，未校正其他混雜因素；在模型2中，校正協(xié)變量的篩選原則為基本模型中引進(jìn)協(xié)變量或在完整模型中剔除協(xié)變量對(duì)術(shù)前CEA水平效應(yīng)值的影響＞10%；在模型3中，校正的協(xié)變量的篩選原則為單因素分析中協(xié)變量對(duì)結(jié)局指標(biāo)的效應(yīng)值P＜0.1。為了探究術(shù)前CEA水平對(duì)患者CSS的影響在不同層級(jí)水平與結(jié)局變量之間的效應(yīng)值(HR)大小及方向是否穩(wěn)定，進(jìn)行分層分析并繪制森林圖。隨后分別繪制患者AJCC分期及AJCC分期聯(lián)合術(shù)前CEA水平的CSS的列線圖預(yù)測(cè)模型，列線圖根據(jù)回歸模型中各個(gè)預(yù)測(cè)變量對(duì)結(jié)局變量的貢獻(xiàn)程度(回歸系數(shù)的大小)將其按照比例對(duì)每個(gè)預(yù)測(cè)變量進(jìn)行賦分，這些變量的評(píng)分相加得到總評(píng)分，從而得出結(jié)局事件的預(yù)測(cè)值，最后繪制時(shí)間依賴(lài)性受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線并計(jì)算曲線下面積(area under curve，AUC)以評(píng)估模型的區(qū)分度。

2 結(jié)果

2.1 研究人群的臨床特征

最終納入患者17 921例，其中男性8 825例(49.24%)，女性9 096例(50.76%)。術(shù)前CEA水平正常組11 467例(64.0%)，CEA水平升高組6 454例(36.0%)，兩組患者年齡、性別、種族、腫瘤位置、分化程度、淋巴結(jié)檢出數(shù)目、神經(jīng)浸潤(rùn)情況、癌結(jié)節(jié)、T分期、N分期及AJCC分期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)，見(jiàn)表1。所有患者中位隨訪時(shí)間為45(29，66)個(gè)月，末次隨訪中因結(jié)腸癌死亡的患者2 910例(16.24%)，患者總體5年癌癥特異性生存率為81.48%(95%CI：80.82%～82.14%)。

表1 術(shù)前CEA水平正常組與升高組結(jié)腸癌患者臨床基線資料比較 [例(%)]

2.2 術(shù)前CEA水平正常與升高人群預(yù)后情況比較

術(shù)前CEA水平升高組中AJCC分期更晚的患者、發(fā)生周?chē)窠?jīng)浸潤(rùn)的患者及分化程度更低的患者所占比例更大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，見(jiàn)圖1。在所有患者中，術(shù)前CEA水平升高組的5年癌癥特異性生存率為72.75%(95%CI：71.48% ～74.03%)， 正 常 組 為 86.25%(95%CI：85.52%～86.98%)；在AJCC分期為Ⅰ期的患者中，術(shù)前CEA水平升高組的5年癌癥特異性生存率為 89.73%(95%CI：87.40%～92.12%)，正常組為95.65%(95%CI：94.81%～96.49%)；在AJCC分期為Ⅱ期的患者中，術(shù)前CEA升高組的5年癌癥特異性生存率為80.22%(95%CI：78.45%～82.02%)，正常組為89.49%(95%CI：88.42%～90.58%)；在AJCC分期為Ⅲ期的患者中，術(shù)前CEA升高組的5年癌癥特異性生存率為61.61%(95%CI：59.59%～63.70%)，正常組為75.67%(95%CI：74.16%～77.20%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

圖1 患者術(shù)前CEA水平與腫瘤生物學(xué)特性的相關(guān)性

2.3 患者癌癥特異性生存期的單因素及多因素分析

單因素Cox回歸分析顯示，年齡、種族、腫瘤位置、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)檢出數(shù)目、神經(jīng)浸潤(rùn)情況、癌結(jié)節(jié)、術(shù)前CEA水平及AJCC分期與患者術(shù)后CSS相關(guān)(P＜0.05)。多因素Cox回歸分析顯示，年齡、種族、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)檢出數(shù)目、神經(jīng)浸潤(rùn)情況、癌結(jié)節(jié)、術(shù)前CEA水平及AJCC分期是患者術(shù)后CSS縮短的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)，見(jiàn)表2。分別構(gòu)建3個(gè)Cox回歸模型進(jìn)行敏感性分析，結(jié)果均顯示術(shù)前CEA水平升高是患者術(shù)后CSS縮短的危險(xiǎn)因素，在考慮了隨訪時(shí)間后，術(shù)前CEA水平升高的患者發(fā)生癌癥特異性死亡的風(fēng)險(xiǎn)比術(shù)前CEA水平正常的患者增加了74%(HR=1.74，95%CI：1.62～1.87)，見(jiàn)表 3。同時(shí)分層分析顯示，在不同亞組中術(shù)前CEA升高均為患者術(shù)后CSS縮短的危險(xiǎn)因素(HR均＞1)，見(jiàn)圖2。

圖2 術(shù)前CEA水平與患者癌癥特異性死亡風(fēng)險(xiǎn)的分層分析

表2 患者癌癥特異性生存期的單因素及多因素分析

表3 術(shù)前CEA水平與患者癌癥特異性生存期的Cox回歸模型分析

2.4 預(yù)測(cè)模型的建立

分別建立AJCC分期及AJCC分期聯(lián)合術(shù)前CEA水平的CSS的列線圖預(yù)測(cè)模型，見(jiàn)圖3。AJCC分期聯(lián)合術(shù)前CEA水平預(yù)測(cè)模型的時(shí)間依賴(lài)性AUC曲線高于單純AJCC分期模型，在時(shí)間依賴(lài)性ROC曲線中，AJCC分期聯(lián)合術(shù)前CEA水平的模型的AUC大于單純AJCC分期模型的AUC(0.71比0.68，時(shí)間為41個(gè)月)，見(jiàn)圖4。

圖3 患者癌癥特異性生存期的列線圖預(yù)測(cè)模型

圖4 時(shí)間依賴(lài)性AUC曲線及ROC曲線分析

3 討論

本研究顯示術(shù)前CEA水平升高與Ⅰ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者的不良預(yù)后獨(dú)立相關(guān)，與既往研究[6-8]結(jié)果一致。術(shù)前CEA水平升高患者的AJCC分期更晚，分化程度更低，更易發(fā)生周?chē)窠?jīng)浸潤(rùn)，總體的5年癌癥特異性生存率比術(shù)前CEA正常的患者低13.5%，在AJCC分期Ⅰ～Ⅲ期中的患者也分別得到了相似的結(jié)果。多因素Cox回歸分析顯示術(shù)前CEA水平升高為患者術(shù)后CSS縮短的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且在隨后的亞組分析中顯示結(jié)果穩(wěn)定可靠。同時(shí)AJCC分期聯(lián)合術(shù)前CEA水平預(yù)測(cè)模型的區(qū)分度比單純應(yīng)用AJCC分期的區(qū)分度更高，即將術(shù)前CEA水平納入AJCC分期后可部分改善其預(yù)后分層作用。

CEA可通過(guò)不同的分子生物學(xué)機(jī)制促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移。利用RNA測(cè)序?qū)Ρ磉_(dá)CEA的結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行全基因組分析結(jié)果顯示近100個(gè)基因的表達(dá)水平出現(xiàn)過(guò)表達(dá)或下調(diào)，結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生的CEA可通過(guò)誘導(dǎo)上皮—間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增加腫瘤細(xì)胞對(duì)周?chē)M織的侵襲性以及抑制應(yīng)激和凋亡信號(hào)來(lái)觸發(fā)結(jié)直腸癌的進(jìn)展[9]。在結(jié)直腸腺癌中，CEA基因發(fā)生突變，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)，導(dǎo)致干細(xì)胞特征的基因過(guò)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和集落形成[10]。而且CEA影響結(jié)直腸癌微環(huán)境中的免疫細(xì)胞濃度，CEA抑制CD8+T細(xì)胞向腫瘤中心的遷移，刺激M0巨噬細(xì)胞向M2分化，而癌細(xì)胞可以與M2巨噬細(xì)胞相互作用，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤新生血管生成[11-12]。在腫瘤微環(huán)境中，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞可通過(guò)釋放可溶性因子來(lái)增強(qiáng)腫瘤遷移或創(chuàng)造有利于癌細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成的生態(tài)微環(huán)境。CEA可作為癌細(xì)胞分泌的循環(huán)成纖維細(xì)胞活化因子，以旁分泌的方式刺激幼稚成纖維細(xì)胞局部分化為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞[13]。因而術(shù)前CEA水平升高患者與正?；颊叩哪[瘤生物學(xué)特性可能存在差異，進(jìn)而影響患者的預(yù)后，在本研究中也發(fā)現(xiàn)術(shù)前CEA水平升高的患者AJCC分期更晚，分化程度更低，更易發(fā)生周?chē)窠?jīng)浸潤(rùn)。

指南建議對(duì)于結(jié)腸癌患者術(shù)后的CEA水平進(jìn)行規(guī)律的隨訪復(fù)查[14]，而目前結(jié)腸癌患者術(shù)后的治療及隨訪策略主要根據(jù)其AJCC分期來(lái)制定。本研究結(jié)果表明，術(shù)前CEA水平升高的患者，預(yù)后也較相同AJCC分期的CEA水平正?；颊卟?。因此可考慮在傳統(tǒng)AJCC分期中加入術(shù)前CEA水平作為一項(xiàng)預(yù)后分層指標(biāo)，以便制定更為合理的治療方案，如術(shù)后更密切的監(jiān)測(cè)及更積極的治療等。

相對(duì)于既往研究，本研究利用SEER數(shù)據(jù)庫(kù)樣本量大、統(tǒng)計(jì)效能高的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)多個(gè)回歸方程及分層分析來(lái)進(jìn)行敏感性分析以檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，發(fā)現(xiàn)將AJCC分期聯(lián)合術(shù)前CEA水平能夠進(jìn)一步改善AJCC分期的區(qū)分度。然而本研究存在以下局限性，首先未能收集到脈管浸潤(rùn)情況、微衛(wèi)星不穩(wěn)定和KRAS、NRAS、BRAF基因突變等目前已證實(shí)能夠影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的指標(biāo)，已收集到的指標(biāo)中也有部分?jǐn)?shù)據(jù)存在缺失的情況，但我們將這些缺失數(shù)據(jù)單獨(dú)分組納入最終多因素統(tǒng)計(jì)分析，因此這些數(shù)據(jù)缺失不影響本研究核心結(jié)果。其次本研究中未能從SEER數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到患者術(shù)后放療及化療的數(shù)據(jù)，使得無(wú)法納入統(tǒng)計(jì)分析。最后本研究?jī)H納入了Ⅰ～Ⅲ期行根治性切除術(shù)的結(jié)腸癌患者，因此結(jié)論不適用于0期、Ⅳ期及未行根治性手術(shù)的結(jié)腸癌患者。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)術(shù)前CEA水平升高的Ⅰ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者預(yù)后較術(shù)前CEA水平正常的患者差，這提示術(shù)前CEA水平可以作為Ⅰ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者術(shù)后分層管理和個(gè)體化監(jiān)測(cè)策略的一項(xiàng)臨床指標(biāo)。未來(lái)還需進(jìn)一步探究CEA水平對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響及其分子生物學(xué)機(jī)制。