張浩 王晶 周琳 趙東峰 趙永見 衛(wèi)曉恩 王擁軍 舒冰△

慢性腎功能不全患者常遭遇一系列骨骼疾病及血鈣磷代謝紊亂，被稱為腎性骨營養(yǎng)不良或腎性骨病。其中慢性腎臟疾病及骨礦物質(zhì)代謝異常被稱為慢性腎臟病礦化性骨病(CKD-MBD)。 在中低收入的慢性腎臟病患者中，腎性骨病的患病率高達(dá)30%。在這些患者中，幾乎100%的晚期腎臟病患者都患有腎性骨病[1]。研究表明，慢性腎臟病早期即已出現(xiàn)了骨形成率的降低和低轉(zhuǎn)換型骨代謝的表現(xiàn)[2-3]，這表明在腎功能不全早期就已經(jīng)出現(xiàn)了骨代謝異常，如果能早期進(jìn)行有效干預(yù)，則有可能延緩腎性骨病的發(fā)生發(fā)展。筆者分析了中醫(yī)骨傷大家施杞教授治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥以及伴有慢性腎病患者的2 000多張中藥處方，經(jīng)過配伍網(wǎng)絡(luò)分析、核心藥物及藥對發(fā)現(xiàn)等方法，形成了防治該病的腎性骨病基礎(chǔ)方，并使用國際上經(jīng)典的了腎性骨病動物模型—兩階段5/6腎切除模型，分別于早期(手術(shù)后1周)、晚期(手術(shù)后1個月)給予腎性骨病方干預(yù)并分析早期應(yīng)用腎性骨病方治療腎性骨病的療效差異，為中醫(yī)藥治療腎性骨病奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

所有動物實(shí)驗(yàn)均按上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會規(guī)定進(jìn)行操作。選擇3個月齡SPF級成年雄性C57BL/6J小鼠(Slac Laboratory，中國)，飼養(yǎng)溫度為(23±1)℃，濕度為55%±5%，自由飲水、攝食。采用兩階段5/6腎臟切除的方法進(jìn)行造模。予以腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，待角膜反射消失、肌力下降后，俯臥位固定在手術(shù)臺上，小鼠專用剃毛刀清除手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，局部消毒后取后背正中旁開一指，肋骨下0.5 cm處縱行切口約0.5 cm，依次切開皮膚、皮下組織及肌肉組織，暴露左側(cè)腎臟，剝離腎臟包膜，保護(hù)腎上腺，于腎臟中上及中下1/3處斜形切除上下腎極，壓迫止血后，回納左腎，逐層關(guān)閉傷口。1周后完整切除右側(cè)腎臟；假手術(shù)組小鼠鈍性剝除腎臟包膜后，不切除腎臟。

70只3個月齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，分為假手術(shù)組(0個月、1個月、2個月、3個月)和模型組(1個月、2個月、3個月)。模型組行5/6腎切除術(shù)后1、2、3個月取材，假手術(shù)組分別在假手術(shù)時(shí)、假手術(shù)后1個月、2個月、3個月取材。

80只3個月齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，分別為早期組(包括假手術(shù)組、模型組、腎性骨病方組和羅蓋全組)和晚期組(包括假手術(shù)組、模型組、腎性骨病方組和羅蓋全組)。早期組于術(shù)后1周開始給藥，晚期組于術(shù)后1個月開始給藥，各組均采用灌胃給藥，1次/d，給藥8周后取材。其中假手術(shù)組和模型組小鼠給予等量的生理鹽水。

1.2 試驗(yàn)藥物

腎性骨病方由淫羊藿12 g、補(bǔ)骨脂9 g、女貞子12 g，墨旱蓮9 g，蛇床子12 g、枸杞子12 g、骨碎補(bǔ)15 g、桃仁12 g、雞血藤12 g、海螵蛸12 g、三棱9 g、莪術(shù)9 g、熟地黃15 g、牛膝15 g、知母12 g、制大黃12 g組成。腎性骨病方中各藥材及羅蓋全膠丸( 0.25 μg×10粒/盒 ，羅氏制藥)均購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院。腎性骨病方采用傳統(tǒng)方法煎煮2次后濃縮保存，羅蓋全于生理鹽水中制成混懸液備用。腎性骨病方濃縮煎劑和羅蓋全混懸液的小鼠用量按照Meeh-Rubner氏公式，根據(jù)人與小鼠體表面積進(jìn)行換算，等效劑量為0.186付(片)/kg/d。將每付中藥煎成50 mL湯劑，每粒羅蓋全配制成50 mL混懸液，按每只小鼠每次0.1 mL/10 g灌胃。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

1.3.1實(shí)驗(yàn)試劑 兔IgG免疫組化試劑盒(SA1022)，武漢博士德生物工程有限公司；蘇木素染液(D005)，南京建成科技有限公司；阿爾辛藍(lán)染液(A5268-25G)，美國Sigma；橙黃 G(O3756-25G)，美國Sigma；萘酚AS-BI磷酸鹽，美國Sigma；薔薇苯胺，美國Sigma；馬松染試劑盒(D026-1-1)，南京建成生物工程研究所；Rb mAb to beta catenin(ab32572，1∶500稀釋)，Abcam；抗骨鈣蛋白抗體(ab13420，1∶200稀釋)，Abcam；抗Osterix抗體(ab22552，1∶200稀釋)，Abcam；抗MMP9抗體(ab38898，1∶200稀釋)，Abcam。

1.3.2主要試驗(yàn)儀器 徠卡輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(RM2135)、徠卡攤片機(jī)(HI1210)、徠卡烘片機(jī)(HI1220)、徠卡組織脫水機(jī)(TP1020)、徠卡石蠟包埋機(jī)(EG1150 C+H)，德國Leica公司；Micro-CT儀(CT80)，瑞士Bassersdorf公司。

1.4 方法

1.4.1標(biāo)本收集 腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉小鼠后，迅速摘除小鼠眼球并取血，全血室溫靜置30 min后，于4 ℃以3 500 r/min的速度離心10 min，收集血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。頸椎脫位處死小鼠，取L5椎體放于10%中性福爾馬林固定液24 h，隨后流水沖洗2 h，放于75%酒精中備用。

1.4.2小鼠腎臟功能檢測 采用雙位點(diǎn)免疫放射測定法檢測小鼠血尿氮(BUN)和血清肌酐(Scr)水平。具體操作按試劑盒說明書操作(Immutopics，Inc.，San Clemente，美國)。血清鈣、磷總濃度分別采用鄰甲酚他林絡(luò)合物法和磷鉬酸鹽紫外比色法測定。

1.4.3Micro-CT掃描和三維重建 采用Micro-CT，以55 kV電壓，72 μA電流，300 ms積分時(shí)間，10 μm橫斷面厚度及空間分辨率的參數(shù)掃描小鼠L5腰椎椎體，并以CT閾值參數(shù)250～1 000范圍，重建三維結(jié)構(gòu)和測量形態(tài)。采用μCT評估軟件系統(tǒng)分析BV/TV結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括骨小梁的體積(BV)、樣本總體積(TV)及二者比值骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)；骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)等骨小梁參數(shù)。

1.4.4小鼠腰椎骨組織形態(tài)學(xué)檢測 小鼠腰椎Micro-CT掃描完成后，于10% EDTA(pH7.4)脫鈣液中脫鈣，每2 d換液，脫鈣10 d后常規(guī)脫水浸蠟后石蠟包埋。腰椎石蠟標(biāo)本進(jìn)行4 μm冠狀位連續(xù)切片，晾干后60 ℃烤箱過夜進(jìn)行阿爾辛蘭/橙黃G染色。切片常規(guī)脫蠟至水，在1%阿爾辛藍(lán)染液中染色30 min，清水沖洗后分別在1%鹽酸乙醇溶液中分化5 s，0.5%氨水中返藍(lán)20 s。95%乙醇溶液放置1 min，0.05%橙黃G染液染色1 min。常規(guī)脫水透明后中性樹脂封片，60 ℃烤箱過夜后，于普通光鏡下觀察，圖像分析系統(tǒng)采片。

1.4.5免疫組織化學(xué)染色 小鼠腰椎石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，放入3%H2O2甲醇溶液(1∶50稀釋)中15 min消除內(nèi)源性過氧化物酶；0.1%胰蛋白酶37 ℃消化10 min，5%胎牛血清(BSA)室溫封閉1 h后加入一抗(anti-Osterix，ab22552，Abcam；anti-Cathpesin K，ab19027，Abcam)，4 ℃搖床孵育過夜，PBS清洗后，給予相應(yīng)生物素化二抗室溫孵育30 min；DAB溶液顯色后依次蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，常規(guī)脫水透明后中性樹膠封片。

1.4.6抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 小鼠腰椎石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，將1.5 mL萘酚ASBI磷酸鹽/乙二醇單乙醚溶液加入150 mL的Basic stock中，37 ℃孵育切片10 min；取3 mL的亞硝酸鈉水溶液和3 mL副薔薇苯胺/鹽酸溶液混合，靜置2 min后加入150 mL的Basic stock中，37 ℃孵育切片5 min。切片依次經(jīng)蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化、氨水返藍(lán)，常規(guī)脫水透明后中性樹膠封片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 5/6腎切除術(shù)后小鼠腎功能下降及骨丟失

為驗(yàn)證小鼠5/6腎切除模型的建立及藥物干預(yù)時(shí)間，分別于5/6腎切除術(shù)后1、2、3個月收集小鼠血清檢測CREA和BUN水平，并收集L5椎體檢測骨密度變化。和假手術(shù)0個月組相比，5/6腎切除術(shù)后第1個月開始，小鼠血清CREA和BUN水平就出現(xiàn)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在手術(shù)第2個月和3個月時(shí)，血清CREA和BUN仍維持在顯著高于假手術(shù)組的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1a-b，P<0.01)。與此一致的是，5/6腎切除術(shù)后第1個月開始，模型組小鼠腰椎BV/TV顯著降低，并維持至手術(shù)3個月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1c-d)。這些結(jié)果表明，5/6腎切除1個月后，小鼠已經(jīng)出現(xiàn)無法自行恢復(fù)的腎功能降低和骨量減少。骨小梁形態(tài)分析顯示，Tb.N在術(shù)后1個月出現(xiàn)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，變化早于Tb.Th和Tb.Sp，后兩者從術(shù)后2個月時(shí)出現(xiàn)顯著降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道的腎功能不全首先出現(xiàn)骨形成降低相吻合(圖1e-f)。

圖1 給與兩階段5/6腎臟切除后，假手術(shù)組和模型組小鼠腎臟功能及骨代謝指標(biāo)變化(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.2 腎性骨病方早期干預(yù)改善5/6腎切除小鼠腎功能

和模型組相比，腎性骨病方早期干預(yù)后，5/6腎切除小鼠血清CREA和BUN水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而腎性骨病方晚期干預(yù)小鼠血清CREA和BUN水平?jīng)]有明顯變化。羅蓋全無論早期干預(yù)或晚期干預(yù)，小鼠血清CREA和BUN均未見明顯改善 (見圖2)。

圖2 早晚期應(yīng)用腎性骨病方后，不同組小鼠腎臟功能(CREA/BUN)變化(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.3 腎性骨病方早期干預(yù)改善5/6腎切除小鼠骨丟失

與模型組相比，腎性骨病方和羅蓋全早期干預(yù)后，5/6腎切除小鼠L5椎體BV/TV均顯著增加(見圖3a)，與腎性骨病方組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與羅蓋全組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中腎性骨病方可以顯著提高小鼠L5腰椎Tb.N，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見圖3b)，降低Tb.Sp，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見圖3d)；羅蓋全可以顯著提高Tb.N和Tb.Th，降低Tb.Sp，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見圖3b-d)。腎性骨病方晚期干預(yù)則對BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp均無顯著作用，羅蓋全晚期干預(yù)可以提高5/6腎切除小鼠L5椎體BV/TV，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，增加Tb.Th，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，腎性骨病方對Tb.N和Tb.Sp亦沒有顯著作用(見圖3e-h)。

圖3 早晚期用藥后，各組小鼠骨代謝指標(biāo)(Micro-CT)結(jié)果(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

小鼠L5椎體重建(見圖4a)及阿爾辛蘭/橙黃G染色(見圖4b)表明：腎性骨病方、羅蓋全早期干預(yù)及羅蓋全晚期干預(yù)，5/6腎切除小鼠L5椎體骨量及骨小梁微結(jié)構(gòu)較模型組均有所提高。

圖4 晚期用藥后，不同組小鼠L5椎體Micro-CT重建結(jié)果及阿爾辛蘭/橙黃G染色結(jié)果

2.4 腎性骨病方早期干預(yù)緩解5/6腎切除小鼠的骨形成下降，抑制破骨細(xì)胞數(shù)量

筆者進(jìn)一步檢測了小鼠L5椎體中成骨特異性指標(biāo)Osterix、破骨細(xì)胞數(shù)量和特異性指標(biāo)Cathpesin K的表達(dá)。

免疫組織化學(xué)染色顯示，與假手術(shù)組相比，5/6腎切除小鼠L5椎體中Osterix表達(dá)顯著降低，腎性骨病方及羅蓋全早期干預(yù)后，Osterix表達(dá)明顯升高。腎性骨病方晚期干預(yù)對Osterix蛋白表達(dá)無明顯作用，而羅蓋全晚期干預(yù)則仍可以提高Osterix的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖5，P<0.01)。

與之一致的是，腎性骨病方及羅蓋全早期干預(yù)可以顯著降低5/6腎切除小鼠L5椎體Cathpesin K表達(dá)。腎性骨病方晚期干預(yù)對Cathpesin K蛋白表達(dá)無明顯作用，而羅蓋全晚期干預(yù)則仍可以抑制Cathpesin K的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖5，P<0.01)。

圖5 早晚期用藥后，不同組小鼠L5椎體免疫組化蛋白表達(dá)-成骨相關(guān)蛋白Osterix/破骨相關(guān)蛋白表達(dá)Cathepsin K(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.5 TRAP染色顯示

TRAP 染色結(jié)果顯示，與模型組相比，腎性骨病方和羅蓋全早期干預(yù)后，5/6腎切除小鼠L5椎體破骨細(xì)胞數(shù)量明顯下降，其中早期給予羅蓋全處理的小鼠椎體破骨細(xì)胞數(shù)量最少；晚期組中，羅蓋全組較模型組有破骨細(xì)胞數(shù)量明顯下降，其他各組均未見明顯改變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖6，P<0.01)。

圖6 早晚期用藥后，不同組小鼠L5椎體TRAP染色結(jié)果(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

3 討論

3.1 腎性骨病發(fā)病特點(diǎn)

慢性腎臟疾病(CKD)已成為當(dāng)今全球范圍的流行病，是非傳染性疾病的一部分，嚴(yán)重影響著世界各國衛(wèi)生保健和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。研究指出在腎臟疾病的每個階段即使是早期，CKD患者的骨折風(fēng)險(xiǎn)較正常患者也明顯升高，這表明了CKD和骨質(zhì)疏松以及骨質(zhì)疏松性骨折之間的關(guān)系。其中，CKD-MBD合并有心血管疾病的患者臨床死亡率極高[4-5]。然而，對于腎性骨病的研究多集中于腎功能不全晚期尿毒癥階段，而對于腎功能不全早期骨代謝的研究相對很少。實(shí)際上，腎功能不全早期就已經(jīng)出現(xiàn)了骨代謝的異常，以骨形成減低為主，因此在腎功能不全早期開始防治腎性骨病可能會收到更好的療效。

3.2 中醫(yī)病因病機(jī)及治療方法

腎性骨病可歸于中醫(yī)“骨痿”“虛勞”“骨范疇痹”等。一般認(rèn)為腎性骨病的病機(jī)是各種先后天的病理因素致使腎氣衰弱，造成慢性腎功能不全，精不生髓，骨失所養(yǎng)，即腎精衰退致骨骼退變[6]。

腎精虧虛是腎性骨病的重要病機(jī)，因此合理運(yùn)用補(bǔ)腎填精壯骨方藥對于改善腎性骨病有重要作用；由于肝腎同源、脾為后天之本，臨床施治亦常采用健脾益腎、肝脾腎同治等法；此外腎性骨病是繼發(fā)性骨病，在臨床診治時(shí)，需要兼顧患者原發(fā)病即慢性腎病的病理特點(diǎn)和腎功能狀態(tài)，常綜合運(yùn)用補(bǔ)虛、化瘀、祛濁、解毒等法。臨床報(bào)道中，淫羊藿、補(bǔ)骨脂、女貞子、墨旱蓮、蛇床子等中藥最長被用于骨質(zhì)疏松的治療[7-12]。這些中藥的活性成分主要有淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、女貞苷、特女貞苷，多項(xiàng)研究表明，這些活性成分具有顯著的抗骨質(zhì)疏松的作用。

實(shí)驗(yàn)表明淫羊藿苷能增加BMSC來源的成骨細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)前成骨細(xì)胞的成熟，同時(shí)抑制原代成骨細(xì)胞的脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。淫羊藿苷體外介導(dǎo)成骨多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括：BMP(骨形態(tài)形成蛋白)、NO(一氧化氮)、MAPK(增殖蛋白激酶)和Wnt/β-catenin途徑[13-16]。淫羊藿苷還可通過抑制活性氧生成而發(fā)揮成骨作用；淫羊藿苷在人成骨細(xì)胞hFob1.19和小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1中均可激活BMP-2/Smad4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[17-18]。在MC3T3-E1細(xì)胞中，淫羊藿苷可以誘導(dǎo)ERK(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶)和JNK (c-Jun-N末端激酶)的活化，但p38激酶活性不受影響[14]。另外阻斷雌激素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可減弱淫羊藿苷誘導(dǎo)骨形成的作用。淫羊藿苷也能通過提升β-catenin mRNA表達(dá)，促進(jìn)β-catenin亞細(xì)胞再分配，提高鼠BMSC GSK-3β(糖原合成酶激酶3)磷酸化水平[14]。補(bǔ)骨脂素處理的CD4+T細(xì)胞可顯著促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7向破骨細(xì)胞分化，而補(bǔ)骨脂素處理CD4+T可顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7破骨細(xì)胞的分化和骨吸收[19]。Li 等[20]用30只激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型的家兔，每天給予(6 g) 35 mg/kg補(bǔ)骨脂素提取物連續(xù)灌胃給藥8周，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組的PPARγ明顯減少，骨鈣素的表達(dá)顯著增加，實(shí)驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)骨脂素能降低骨髓細(xì)胞的脂肪生成，促進(jìn)鈣沉積，預(yù)防骨質(zhì)疏松。Dong等[21]發(fā)現(xiàn)，給予女貞子有效提取物女貞苷處理(700 mg/kg 灌胃) 12周可刺激卵巢切除術(shù)(OVX)大鼠腎臟1-25-羥化酶和維生素D受體(VDR)表達(dá)，增加循環(huán)水平1，25-(OH)2D3水平，進(jìn)而改善OVX大鼠骨質(zhì)疏松情況。應(yīng)用蛇床子中的主要有效組分蛇床子素腹腔注射，可以有效緩解5/6腎切除小鼠的骨量減少，其主要機(jī)制與抑制5/6腎切除導(dǎo)致的破骨細(xì)胞形成增加有關(guān)[22]。而在體外研究中，NIU等發(fā)現(xiàn)蛇床子素可以提高成骨細(xì)胞BMP-2表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成骨分化[23]；Zhao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷通過誘導(dǎo)Runx2表達(dá)激活BMP信號通路，在MC3T3-E1細(xì)胞和小鼠原代成骨細(xì)胞中發(fā)揮了強(qiáng)大的成骨作用；Zhang等[28]給予雌性O(shè)VX大鼠墨旱蓮提取物 (1.4 g/kg灌胃) 12周后，給藥組大鼠BMD以及血清降鈣素(CT)明顯高于對照組，脛骨mRANKL表達(dá)明顯降低，但是對甲狀旁腺激素?zé)o明顯影響，這是其對OVX大鼠骨保護(hù)作用的部分原因。

腎性骨病方以淫羊藿、補(bǔ)骨脂、女貞子，墨旱蓮，蛇床子等補(bǔ)腎中藥為基礎(chǔ)方，佐以制大黃，知母、牛膝清熱解毒，利濕去濁；熟地黃、菟絲子，海螵蛸補(bǔ)腎填精；雞血藤，桃仁、三棱、莪術(shù)活血祛瘀，通經(jīng)去濁。全方以補(bǔ)腎填精益髓為法則，佐以利濕去濁，通調(diào)水道之法。本方劑為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院施杞教授治療骨質(zhì)疏伴慢性腎臟病患者的經(jīng)驗(yàn)方，為臨床治療腎性骨病的經(jīng)典方和有效方。

3.3 腎性骨病方治療腎性骨病的機(jī)制

腎性骨病早期骨代謝呈低轉(zhuǎn)換特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為血清骨代謝指標(biāo)降低；隨著疾病的發(fā)展，由于機(jī)體代償機(jī)制，中期骨代謝出現(xiàn)緩慢恢復(fù)，但此時(shí)腎臟就已經(jīng)出現(xiàn)了不可逆的損傷；到了疾病晚期，腎臟失代償，血清骨代謝指標(biāo)變化同時(shí)還出現(xiàn)骨密度的顯著降低，此期的骨代謝特點(diǎn)為高轉(zhuǎn)換型[26-28]。因此筆者在小鼠慢性腎臟病早期就給予補(bǔ)腎填精益髓治療，收到良好效果。結(jié)果證明在小鼠5/6腎臟切除術(shù)后早期應(yīng)用腎性骨病方干預(yù)可有效降低小鼠血清肌酐及血清尿素氮(CREABUN)水平，而晚期應(yīng)用腎性骨病方未觀察到小鼠腎臟功能的明顯變化。有趣的是筆者同時(shí)觀察到早期應(yīng)用腎性骨病方可以顯著改善腎性骨病不鼠骨丟失情況。和模型組相比，早期用藥后各組小鼠L5椎體BV/TV、 Tb.N值均顯著升高，Tb.Sp下降，而晚期組只有羅蓋全骨結(jié)構(gòu)較模型組有明顯改善。與之相一致的是：阿爾辛蘭/橙黃G染色、L5椎體的三維重建。除此之外，筆者還發(fā)現(xiàn)早期應(yīng)用腎性骨病方還可以促進(jìn)成骨相關(guān)蛋白Osterix表達(dá)，抑制破骨相關(guān)蛋白Cathpesin K表達(dá)，TRAP破骨相關(guān)染色與之結(jié)果一致。

綜上所述筆者得出結(jié)論，在早期應(yīng)用腎性骨病方可以有效改善5/6腎臟切除后小鼠的腎臟功能，從而緩解因腎臟功能降低導(dǎo)致的繼發(fā)性骨丟失。其對骨丟失的保護(hù)機(jī)制筆者推測：早期在腎臟功能尚具有代償能力階段給與腎性骨病方可以改善腎臟功能，延緩甚至改善繼發(fā)性甲旁抗，調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷平衡，促進(jìn)腸道鈣吸收，從而糾正骨丟失情況；其次腎性骨病方中大劑量的早期應(yīng)用補(bǔ)腎中藥可以直接作用于成骨/破骨細(xì)胞，抑制破骨細(xì)胞活性，降低破骨細(xì)胞數(shù)量并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，從而改善腎性骨病繼發(fā)骨丟失，相關(guān)進(jìn)一步的機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。目前，臨床對于腎性骨病往往收不到較滿意的理臨床療效，本研究依據(jù)“腎主骨”理論，從腎論治，早期干預(yù)，在豐富“腎主骨”的科學(xué)理論內(nèi)涵的基礎(chǔ)上為腎性骨病的臨床治療提供更有效安全的中醫(yī)治療方法。