張煒強(qiáng) 傅麗琴 黎秋生

創(chuàng)面愈合是復(fù)雜的連續(xù)性生物過(guò)程， 通過(guò)炎癥反應(yīng)、 新生組織形成及組織重塑序貫交叉進(jìn)行。 慢性難愈合創(chuàng)面是指無(wú)法通過(guò)常規(guī)程序及時(shí)修復(fù)恢復(fù)解剖和功能完整狀態(tài)的創(chuàng)面［1］。 近年來(lái)， 由于大面積軟組織損傷、 開(kāi)放性骨折等所致的慢性難愈合創(chuàng)面越來(lái)越常見(jiàn)。 隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)的發(fā)展以及創(chuàng)面愈合過(guò)程研究的不斷深入， 慢性難愈合創(chuàng)面的治療方法也越來(lái)越多， 具有去腐生肌等多種作用的燒傷創(chuàng)瘍?cè)偕t(yī)療技術(shù) （moist exposed burn therapy／moist exposed burn ointment， MEBT／MEBO） 及具備多向分化潛能的脂肪干細(xì)胞 （adipose-derived stem cells， ADSC） 在創(chuàng)面修復(fù)、 骨組織再生等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［2－3］， 但目前有關(guān)兩者聯(lián)合應(yīng)用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。 基于此， 本研究將 MEBT／MEBO 與ADSC 聯(lián)合應(yīng)用于慢性難愈合創(chuàng)面的治療， 取得了較為滿意的臨床療效， 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取2017 年1 月至2020 年1 月龍巖市第一醫(yī)院收治的61 例慢性難愈合創(chuàng)面患者作為研究對(duì)象，并按照隨機(jī)數(shù)表法將其隨機(jī)分為研究組 （31 例）與對(duì)照組 （30 例）， 兩組患者性別、 年齡、 病程等一般資料對(duì)比，P均＞0.05， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性 （表1）。 本研究經(jīng)龍巖市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)， 且所有患者均簽署了知情同意書(shū)。

表1 兩組慢性難愈合創(chuàng)面患者一般資料對(duì)比Table 1 Comparison of general data of patients with chronic refractory wounds between the two groups

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)： 符合慢性難愈合創(chuàng)面的診斷標(biāo)準(zhǔn)；依從性好， 能夠配合完成全程治療； 對(duì)本研究知情同意。 排除標(biāo)準(zhǔn)： 合并有濕性壞疽； 合并有惡性腫瘤或全身嚴(yán)重感染； 合并有嚴(yán)重心肺腦等重要臟器疾?。?合并有認(rèn)知功能障礙或因特殊原因無(wú)法堅(jiān)持治療中途退出。

2 方法

2.1 治療方法

對(duì)照組： 無(wú)菌操作下， 創(chuàng)面于生理鹽水、 雙氧水及碘伏反復(fù)沖洗消毒后， 在保護(hù)創(chuàng)面周圍血管和神經(jīng)的前提下徹底清除壞死組織、 異物及游離藥痂，繼而均勻涂抹濕潤(rùn)燒傷膏 （moist exposed burn ointment， MEBO）， 厚約0.5 ～1.0 mm， 范圍超過(guò)創(chuàng)緣1.0 cm， 并依次覆蓋MEBO 藥紗及無(wú)菌敷料包扎，根據(jù)創(chuàng)面滲出情況每天換藥1 ～2 次， 直至創(chuàng)面完全愈合。

研究組： 腹部或腹股溝局部浸潤(rùn)麻醉后， 采用吸脂針吸取患者自體脂肪不少于35 mL， 8 h 內(nèi)行ADSC 分離和培養(yǎng)。 采用含青霉素、 鏈霉素的磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffer solution， PBS） 洗滌后， 加入等體積Ⅰ型膠原酶和含10%胎牛血清的Hank’s溶液， 37 ℃消化 1 h； 消化完畢后， 200 目細(xì)胞篩過(guò)濾去除未消化的組織碎片， 2000 r／min 離心10 min 后棄去上清液； 加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 稀釋為細(xì)胞懸液； 取10 μL細(xì)胞懸液， 加入30 μL 錐蟲(chóng)藍(lán)染色， 顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)脂肪干細(xì)胞 ＞ 5 × 103／L 即為提取成功［4］； 將細(xì)胞懸液接種至培養(yǎng)瓶中 （密度約2 ×105／mL），置于37 ℃、 5% CO2、 95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 待細(xì)胞貼壁 70% ～80% 時(shí)， PBS 漂洗 2 次， 棄去PBS， 培養(yǎng)瓶中加入胰蛋白酶37 ℃消化3 min， 并反復(fù)吹打， 加入等量培養(yǎng)基中和胰蛋白酶后， 轉(zhuǎn)移至離心管， 1000 r／min 離心 5 min， 棄去上清液；培養(yǎng)基重懸沉淀， 細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；選擇第3 或第4 代生長(zhǎng)良好的ADSC， 經(jīng)胰蛋白酶消化后收集上清液， 配制 ADSC 液， 置于凍存盒中， －80 ℃凍存?zhèn)溆谩?無(wú)菌操作下清創(chuàng)后， 創(chuàng)面均勻涂抹MEBO （方法同對(duì)照組）； 創(chuàng)緣注射ADSC液， 每周注射 1 ～ 2 次， 每次注射 5 ～6 mL， 直至創(chuàng)面完全愈合。

2.2 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)比觀察兩組患者臨床療效， 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor， VEGF）、 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （basic fibroblast growth factor， bFGF） 表達(dá)水平， 創(chuàng)面愈合時(shí)間， 愈后皮膚瘢痕增生情況。

治療4 周后， 評(píng)估兩組患者臨床療效： 創(chuàng)面縮小40%以上， 滲出液明顯減少， 新生肉芽組織新鮮無(wú)水腫為顯效； 創(chuàng)面縮小20% ～40%， 滲出液有所減少， 創(chuàng)緣軟化， 新生肉芽組織紅潤(rùn)無(wú)水腫為有效； 創(chuàng)面縮小20%以下或擴(kuò)大， 滲出液無(wú)明顯減少， 肉芽組織老化為無(wú)效； 總有效率＝ （顯效例數(shù) ＋ 有效例數(shù)） ／總例數(shù) ×100%［5］。

分別于治療前及治療4 周后， 切取適量創(chuàng)面組織， PBS 洗滌后稱重剪碎， 按1∶9重量體積比加入含蛋白酶抑制劑的 PBS 勻漿， 5000 r／min 離心10 min， 取上清液； 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)， 采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定VEGF、 bFGF 表達(dá)水平。

創(chuàng)面愈合后采用溫哥華瘢痕量表 （Vancouver scar scale， VSS） 評(píng)估瘢痕增生情況， 共包含厚度、色澤、 柔軟性和血管分布4 個(gè)維度， 總分為0 ～15分， 分值越高表示瘢痕增生越嚴(yán)重［6］。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 其中計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分比表示， 采用卡方檢驗(yàn)或等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)； 符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示， 組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)； 均以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 兩組患者臨床療效對(duì)比

治療4 周后， 研究組患者中顯效17 例、 有效11 例、 無(wú)效 3 例， 總有效率為 90.32% ， 明顯優(yōu)于對(duì)照組患者中顯效10 例、 有效11 例、 無(wú)效9 例，總有效率70.00% （Z＝ －2.070，P＝0.038）。

3.2 兩組患者VEGF、 bFGF 表達(dá)水平對(duì)比

治療前， 兩組患者創(chuàng)面組織中 VEGF、 bFGF表達(dá)水平無(wú)明顯差異 （P均＞0.05）， 具有可比性；治療4 周后， 兩組患者創(chuàng)面組織中VEGF、 bFGF 表達(dá)水平均明顯升高， 且研究組明顯高于對(duì)照組 （P均 ＜0.05）， 詳見(jiàn)表2。

表2 兩組慢性難愈合創(chuàng)面患者創(chuàng)面組織中VEGF、 bFGF 表達(dá)水平對(duì)比 （）Table 2 Comparison of expression levels of VEGF and EGF in the wound tissues of patients with chronic refractory wounds between the two groups （）

表2 兩組慢性難愈合創(chuàng)面患者創(chuàng)面組織中VEGF、 bFGF 表達(dá)水平對(duì)比 （）Table 2 Comparison of expression levels of VEGF and EGF in the wound tissues of patients with chronic refractory wounds between the two groups （）

注： VEGF 為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子， bFGF 為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子； 研究組患者局部創(chuàng)面采用燒傷創(chuàng)瘍?cè)偕t(yī)療技術(shù)聯(lián)合脂肪干細(xì)胞治療， 對(duì)照組患者局部創(chuàng)面采用燒傷創(chuàng)瘍?cè)偕t(yī)療技術(shù)治療Note： VEGF － vascular endothelial growth factor， bFGF － basic fibroblast growth factor； The local wounds of patients in study group were treated with MEBT ／MEBO combined with adipose-derived stem cell，while the control group were treated with MEBT／MEBO only

VEGF bFGF例數(shù)Number of cases組別Group 治療前Before treatment治療后After treatment治療前Before treatment治療后After treatment Study group 31 438.9 ±24.5研究組721.7 ±34.4 65.8 ±18.2 130.8 ±31.8 Control group 30 433.2 ±21.6對(duì)照組115.5 ±23.3 t 值t value 0.965 3.431 0.310 2.138 695.1 ±25.3 67.3 ±19.5 P 值P value 0.339 0.001 0.757 0.036

3.3 兩組患者創(chuàng)面愈合情況對(duì)比

最終兩組患者創(chuàng)面均完全愈合， 研究組患者創(chuàng)面愈合時(shí)間為 （36.53 ±5.83） d， 明顯短于對(duì)照組患者的創(chuàng)面愈合時(shí)間 （41.07 ± 7.07） d （t＝2.740，P＝0.008）。 研究組患者愈后皮膚 VSS 評(píng)分為 （4.33 ±0.73） 分， 明顯低于對(duì)照組患者的愈后皮膚 VSS 評(píng)分 （5.02 ± 0.85） 分 （t＝ 3.405，P＝0.001）。

4 討論

隨著人口老齡化的加劇和疾病譜的改變， 除創(chuàng)傷、 燒傷等急性創(chuàng)傷所致的慢性難愈合創(chuàng)面外， 糖尿病足、 壓瘡等各類慢性疾病導(dǎo)致的慢性難愈合創(chuàng)面患者數(shù)量也逐年增加。 創(chuàng)面經(jīng)久不愈不僅會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量， 還會(huì)給患者造成沉重的心理負(fù)擔(dān)。 MEBO 作為 MEBT／MEBO 的核心藥物， 主要由芝麻油、 β-谷甾醇、 小檗堿等中草藥成分組成，可通過(guò)改善局部微循環(huán)、 液化和排除壞死組織、 減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)［7］， 加速血管再生， 促進(jìn)創(chuàng)面愈合［8－9］。 但臨床研究顯示， MEBT／MEBO 在慢性難愈合創(chuàng)面的治療中雖具有顯著療效， 但治療周期較長(zhǎng)。 為進(jìn)一步縮短慢性難愈合創(chuàng)面的愈合時(shí)間， 本研究將ADSC 與MEBT／MEBO 聯(lián)合應(yīng)用于慢性難愈合創(chuàng)面的治療。

ADSC 可分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子， 促進(jìn)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)、 血管生成、 膠原沉積等， 加快創(chuàng)面愈合［10］， 利用未分化細(xì)胞的自我更新和功能細(xì)胞分化能力， 提高創(chuàng)面愈合率［11］。 本研究將其與MEBT／MEBO 聯(lián)合應(yīng)用于慢性難愈合創(chuàng)面的治療，與單純應(yīng)用 MEBT／MEBO 相比， 創(chuàng)面愈合時(shí)間更短、 瘢痕評(píng)分更低、 臨床療效更高， 且 VEGF 和bFGF 的表達(dá)水平更高。 可見(jiàn)， ADSC 能夠分泌VEGF 和 bFGF， 以進(jìn)一步促進(jìn)創(chuàng)面愈合［12］。 創(chuàng)面愈合涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞的遷移、 增殖、 分化， VEGF 作為血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長(zhǎng)因子， 對(duì)血管生成至關(guān)重要［13－14］， 可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化， 促進(jìn)血管生成［15］； bFGF可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖分化， 同時(shí)能夠上調(diào)VEGF 的表達(dá)水平［16］。 但慢性難愈合創(chuàng)面中缺乏具有再生潛能的細(xì)胞， 故分泌 VEGF、 bFGF 水平不足， 成纖維細(xì)胞遷移受限， 創(chuàng)面愈合較慢。 而脂肪中含有的大量間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于中胚層， 可向脂肪細(xì)胞、 成骨細(xì)胞、 軟骨細(xì)胞等多胚層細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且能夠分泌VEGF、 bFGF 等部分細(xì)胞因子參與創(chuàng)面修復(fù)的各個(gè)時(shí)期， 向創(chuàng)面組織中注射ADSC，解決了創(chuàng)面中缺乏潛能再生細(xì)胞的問(wèn)題［17－18］， 且MEBO 內(nèi)含有的碳水化合物、 脂肪酸、 氨基酸等成分， 為其增殖分化提供了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［19］， 進(jìn)而促進(jìn)了創(chuàng)面的再生修復(fù)。

綜上所述， MEBT／MEBO 聯(lián)合 ADSC 可提高VEGF、 bFGF 的表達(dá)水平， 縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間， 有效緩解創(chuàng)面愈合后病理性瘢痕的形成， 療效顯著，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。