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檸檬精油對(duì)白假絲酵母菌在純鈦義齒支架表面黏附的影響

2021-10-19 11:19張學(xué)思張向宇
關(guān)鍵詞:口炎義齒菌落

張學(xué)思 張向宇

義齒性口炎是指戴有活動(dòng)義齒者的義齒基托下黏膜局部或彌漫性炎癥。研究表明大約90%的義齒性口炎是由真菌引起的,其中最主要為白假絲酵母菌(C.albicans),義齒性口炎患者C.albicans的檢出率為60%~100%[1-2]。

檸檬精油(LEO)是在水果檸檬中提取的一種淡黃色液體,本研究通過比較LEO與0.2%氯己定溶液(0.2%Chlorhexidine,0.2%CHX)、3%碳酸氫鈉溶液(3%NaHCO3)對(duì)C.albicans在純鈦義齒支架表面黏附的清潔和洗脫作用效果,進(jìn)而探討其用于預(yù)防和輔助治療義齒性口炎的可行性,以期實(shí)現(xiàn)口腔疾病的生態(tài)防治。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

純鈦試件(北京市海龍達(dá)義齒研究所);LEO(廣州東方生物科技股份有限公司);PBS緩沖液(福州飛凈生物科技有限公司);0.2%氯己定消毒液(福建維真園醫(yī)藥科技有限公司);3%碳酸氫鈉溶液(青島華潔清潔用品有限公司);牛血清白蛋白BSA(上海金穗生物科技有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司);DL-CJ-2N醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);電子天平(上海精天電子儀器有限公司);紫外分光光度計(jì)(Eppendorf,德國);激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司,日本);醫(yī)用離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);旋渦震蕩器(SI Vortex-Genie2,Scientific Industries公司,美國)。

1.2 材料準(zhǔn)備與分組

材料:純鈦試件,制備成7.5 mm×8 mm×2 mm 標(biāo)本;LEO。實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)組:LEO(A)、50%LEO(B);陽性對(duì)照組:0.2%CHX(C)、3%NaHCO3(D);空白對(duì)照組:無菌蒸餾水(E)。實(shí)驗(yàn)共分5 組,每組12 個(gè)鈦板。

1.3 方法

1.3.1C.albicans菌液制備 將菌種接種于沙氏液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,PBS緩沖液稀釋成1×108CFU/ml,備用。

帶菌試件的制備 配置含1%小牛血清蛋白的PBS液,將純鈦試件放入浸泡10 min。試件取出置于24 孔板中,每微孔加入1 mL菌液、1 mL沙氏液體培養(yǎng)基和0.1 mL牛血清蛋白液,37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h,使C.albicans在試件上充分生長黏附。

取出試件,1 mL PBS液輕輕漂洗3 次,分別放入上述各組中,室溫下浸泡6 h[3]。將浸泡后的試件取出后,PBS液輕輕沖掉表面藥物,放入每孔含2 mL液體沙氏培養(yǎng)基的24 孔板中,37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

1.3.2 抑菌效果評(píng)價(jià)

1.3.2.1 分光光度計(jì)檢測 每組隨機(jī)抽取試件各8 塊,PBS溶液漂洗3 次,洗去表面未黏附的C.albicans,將試件放入含有1 mL PBS溶液的試管中,放置在旋渦振蕩器上震蕩90 s,使黏附在試件表面的菌體充分洗脫于PBS溶液中,分光光度計(jì)測定洗脫液A600 nm值。

1.3.2.2 菌落計(jì)數(shù) 每組中隨機(jī)抽取2 塊試件,PBS液漂洗3 次,置于含有5 mL無菌生理鹽水的試管中,在旋渦振蕩器上震蕩90 s,無菌生理鹽水將其10 倍稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6,取不同濃度的稀釋液0.1 mL涂布于沙氏固體培養(yǎng)基表面,每個(gè)稀釋濃度做3 個(gè)平行樣本。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后菌落計(jì)數(shù),計(jì)算均數(shù)。

激光共聚焦顯微鏡觀察 隨機(jī)選取每組2 塊試件,PBS液漂洗3 次,AO/EB(吖啶橙/溴乙錠)染色,激光共聚焦顯微鏡下觀察生物膜形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組洗脫菌液

A值平均值結(jié)果如下: 0.2%CHX組0.05);50%LEO組、LEO組、陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖 1)。表明:LEO對(duì)C.albicans的黏附有清潔和洗脫作用,作用強(qiáng)度與藥物濃度有關(guān)。

a vs b, P<0.05; a vs c, P<0.05; b vs c, P<0.05; ac vs a or c, P>0.05

2.2 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

比較細(xì)菌生長情況,排除菌落數(shù)過高或過低值,選取稀釋到10-2濃度時(shí)所劃平板的菌落數(shù)進(jìn)行比較分析,菌落數(shù)3%NaHCO3組<0.2%CHX組0.05)(圖 2)。

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察各組

藥物處理后C.albicans在鈦板上的黏附狀態(tài)。結(jié)果示: 無菌蒸餾水組鈦板表面幾乎全部為活菌,死菌比例最??;50%LEO組死菌比例明顯增多;LEO組、0.2%CHX、3%NaHCO3組鈦板表面死菌數(shù)目明顯多于活菌。表明LEO可以降低C.albicans在純鈦試件表面的黏附量,與2.1和2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(圖 3)。

圖 2 各組菌落個(gè)數(shù)比較(稀釋到10-2濃度)

3 討 論

義齒性口炎臨床表現(xiàn)為承托區(qū)黏膜呈猩紅色或點(diǎn)狀出血,紅斑,有偽膜,患者自覺口干,有燒灼感,咀嚼疼痛,無法正常進(jìn)食。義齒性口炎的主要病因是真菌和細(xì)菌感染,最主要是C.albicans感染。研究表明,在義齒微生物的黏附實(shí)驗(yàn)中C.albicans檢出率是69.7%,變形鏈球菌和金黃色葡萄球菌的共同檢出率是45.3%[4]。C.albicans為機(jī)會(huì)致病菌,可存在于健康人的口腔、消化道、陰道等,在宿主防御功能降低時(shí)可致病。C.albicans主要聚集在義齒的組織面及相對(duì)應(yīng)的病損黏膜上,通過黏附、侵入上皮細(xì)胞,引起口腔黏膜感染。致病機(jī)制主要為:(1)細(xì)胞壁黏附物質(zhì):C.albicans細(xì)胞壁的主要成分是甘露聚糖-蛋白質(zhì),其為疏水性并可通過與黏膜和義齒材料的疏水端的相互作用來促進(jìn)其黏附[5];黏附素也是介導(dǎo)C.albicans對(duì)口腔黏膜黏附作用的主要物質(zhì),代表性的有Als1、凝集素樣黏附素1、菌絲孔蛋白1等[6];(2)C.albicans可產(chǎn)生多種侵襲酶,破壞宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜,其蛋白酶的活性與毒力呈線性正相關(guān)[7],其中主要致病的是分泌型細(xì)胞外酸性蛋白酶,它將蛋白質(zhì)分解作為氮源在皮膚及深部組織中定植,并可將白蛋白、角蛋白、血紅蛋白和凝血因子等分解使C.albicans在組織中更容易擴(kuò)散;(3)C.albicans還可以通過酵母相和菌絲相兩種表型的轉(zhuǎn)換來達(dá)到致病性,C.albicans的菌絲具有更強(qiáng)的致病性,在義齒性口炎患者中檢出率非常高[8]。

圖 3 各組激光共聚焦顯微鏡下C.albicans的黏附狀態(tài)

義齒性口炎的形成與基托材質(zhì)和光滑度有關(guān)。微生物在數(shù)小時(shí)內(nèi)就能黏附于義齒基托材料上,24 h后達(dá)高峰,在樹脂基托表面的黏附量顯著高于金屬表面[9]。C.albicans黏附于不同金屬材料的能力也不同,有學(xué)者研究了鈷鉻合金和純鈦金屬材料的可摘局部義齒修復(fù)牙列缺損后的咀嚼功能、牙齦狀態(tài)、義齒性口炎的發(fā)生等情況,發(fā)現(xiàn)純鈦均優(yōu)于鈷鉻合金,可能是因?yàn)榧冣伇砻孑^高的自由能和TiO2成分[10]。純鈦有良好的物理性能,低密度,所制作的基托輕便,異物感小,患者戴用舒適,對(duì)發(fā)音影響小,有利于余留牙和口腔黏膜的保??;純鈦支架不會(huì)引起口腔黏膜類似排斥的反應(yīng),如微血管流速的變化、組織液滲出的增加等;無致畸致癌性,生物相容性好。純鈦鑄件越來越多被口腔醫(yī)生所選擇。

對(duì)義齒支架表面C.albicans的清除和抑制在預(yù)防和減少義齒性口炎方面具有重要意義。理想的義齒清潔劑需要有很強(qiáng)的殺菌能力,對(duì)口腔黏膜無刺激性,對(duì)義齒支架表面無損傷。目前義齒清潔劑根據(jù)作用機(jī)理可分為堿性過氧化物類、堿性次氯酸鹽類、酶類等[11],過氧化物類遇水反應(yīng)生成活性氧而起到殺菌作用,同時(shí)生成氣泡可以達(dá)到物理清潔作用,酶類可以破壞菌斑附著,抑制菌斑形成,但沒有一種成分能達(dá)到理想的清潔效果。研究顯示,長期使用義齒清潔劑會(huì)對(duì)義齒的色澤、氣味、彈性等物理化學(xué)性能產(chǎn)生影響[12]。

天然藥物因?yàn)閬碓簇S富、取材方便、生物安全性較好引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注和研究[13]。LEO是在水果檸檬中提取的一種淡黃色液體,有天然的清香氣味。LEO含量最多的成分檸檬烯可以抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌[14],對(duì)黑曲霉菌、黃曲霉菌及青霉菌等真菌也有較強(qiáng)的抑制作用[15],研究發(fā)現(xiàn)檸檬烯具有抗牙齦卟啉單胞菌的作用[16]。本項(xiàng)目前期研究發(fā)現(xiàn)LEO有抑制C.albicans生長的作用,而且在應(yīng)用濃度未發(fā)現(xiàn)毒副作用。檸檬精油可以降低變形鏈球菌乳酸脫氫酶活性減少酸的產(chǎn)生,減少齲病發(fā)生[17]。體外研究發(fā)現(xiàn)其可以抑制變形鏈球菌對(duì)牙體等硬組織表面的黏附[18-19]。具有開發(fā)成口腔輔助用品的潛能。

本研究探究了LEO對(duì)C.albicans在純鈦義齒支架表面黏附的影響和洗脫作用,結(jié)果表明LEO可以降低其在可摘義齒表面的黏附,對(duì)于預(yù)防義齒性口炎發(fā)生,可能具有重要研究價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用的是體外研究LEO對(duì)C.albicans的作用效果,與口內(nèi)復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境差距較大,今后將進(jìn)一步進(jìn)行口內(nèi)實(shí)驗(yàn)等深入研究。

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