鄭立娟 劉健偉 秦華民 湯晨 趙旭

根尖周病是繼發(fā)于牙髓感染和損傷的一種骨破壞性炎癥病理損傷。細菌作為其始動因子可激發(fā)宿主產(chǎn)生一系列免疫應答，大量炎癥細胞在被激活后產(chǎn)生和釋放炎癥介質、細胞因子和酶類等物質，導致根尖區(qū)組織破壞和牙槽骨的吸收[1]。

他汀類調脂藥(Simvastatin)是3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)抑制劑，常用于降低膽固醇水平，此外還有保護內皮、抗炎、抗氧化等多種功能[2]，近年來發(fā)現(xiàn)他汀類藥物在調節(jié)成骨破骨平衡，抑制口腔相關炎癥中也具有重要作用[3]。

核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)是在成骨細胞和骨髓間充質干細胞等表面表達的配體，其與核因子-κB受體活化因子(RANK)結合是誘導破骨細胞活化和發(fā)揮功能的必要條件，在破骨細胞的分化和成熟中起到重要作用，而RANK/RANKL的表達又受到諸多因素的調節(jié)[4]。本研究將其用在大鼠實驗性根尖周炎中，觀察用藥后白介素-6(interleukin-6，IL-6)和RANKL在實驗性根尖周炎發(fā)展中的變化，以及辛伐他汀對成骨細胞的影響，探討辛伐他汀在根尖周病損中的作用，為輔助根管治療的新方法提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8 周齡SD雄性大鼠32 只，體重(250±20) g，由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.1.2 實驗細胞 人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cell，HMSC，廣州吉妮歐生物科技有限公司)。

1.1.3 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone公司，美國)；胎牛血清(FBS)、青鏈霉素試劑(GIBCO公司，美國)；辛伐他汀(simvastatin，上海遠慕生物)；LPS內毒素、NC薄膜(Sigma公司，美國)；胰蛋白酶、 蛋白裂解液(上海碧云天)；蛋白marker(Thermo Fisher公司，美國)；脫脂奶粉(BD公司，美國)； RANKL抗體、 GAPDH 抗體及羊抗兔IgG-HRP抗體(武漢三鷹生物有限公司)；人白介素6 ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

1.1.4 主要儀器 二氧化碳恒溫細胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(Thermo Scientific Biological公司,美國)；倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；酶標儀(Perkin Elmer公司，美國)；HC-2518R高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器公司)；凝膠PAGE電泳儀、SDS-PAGE轉膜儀(北京六一廠)；ECL成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠牙根尖周炎用藥模型建立 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，小號球鉆于下頜第一磨牙遠中窩處開髓，放入蘸有脂多糖內毒素(Lipopolysaccharide，LPS)的棉球并壓緊，動物清醒后，正常飼養(yǎng)。大鼠分組情況：A組(正常對照組)：16 只，開髓后每日生理鹽水灌胃，分別于開髓術后1、7、14、21 d處死大鼠；B組(模型觀察組)：16 只，開髓后每日辛伐他汀灌胃給藥，劑量為5 mg/kg·d，分別于開髓術后1、7、14、21 d處死大鼠。所有處死的大鼠剝離下頜骨，儲存于4%多聚甲醛溶液中。需要進行免疫組化的骨組織提前用EDTA溶液脫鈣處理。

1.2.2 X線掃描 X線牙片機拍攝下頜骨標本，8 mA、70 kV、0.08 s條件下曝光。將X線影像導入Image-Pro Plus 6.0生物圖像處理軟件進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 骨組織RANKL免疫組織化學染色 (1)脫蠟，將組織切片用二甲苯及乙醇脫蠟；(2)水化，緩慢水流下沖洗10 min，之后用PBS溶液洗滌；(3)抗原修復，將洗滌后的組織切片放入檸檬酸鹽緩沖液中，于微波爐解凍檔修復20 min，室溫冷卻后，PBS溶液洗滌；(4)內源性過氧化酶滅活，滴加3%過氧化氫溶液，放置10 min，之后用PBS溶液沖洗3 次，每次5 min；(5)血清封閉及孵一抗，滴加山羊血清，在室溫下封閉30 min，吸干封閉液后滴加稀釋的RANKL抗體(1∶150)，于4 ℃冰箱過夜孵育；(6)孵二抗，次日取出切片，室溫下恢復1 h后滴加生物素化二抗，室溫孵育45 min，PBS溶液洗滌；(7)標記二抗，滴加相應工作液標記二抗，室溫下孵育45 min，PBS溶液洗滌；(8)顯色，滴加新配制的DAB顯色液，于顯微鏡下觀察顯色；(9)復染，在緩慢水流下洗滌切片，滴加蘇木精染液復染，并用流水沖洗；(10)脫水，中性樹脂封片。于顯微鏡下觀察染色結果。

1.2.4 HMSC細胞培養(yǎng) HMSC細胞于37 ℃，5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗。在達到指數(shù)生長期時，用含有成骨誘導劑的培養(yǎng)基進行成骨誘導。實驗分組情況：A組：常規(guī)培養(yǎng)；B組：常規(guī)培養(yǎng)+1 μg/mL LPS(或+50 ng/mL IL-6)；C組：B組+10-7mol/L 辛伐他??；D組：B組+10-5mol/L 辛伐他汀。

1.2.5 ELISA法測定IL-6 按實驗分組對細胞進行相應處理，收集細胞上清液。向空白樣品孔中加入樣品稀釋液100 μL，向標準樣品孔加入稀釋后的標準品溶液100 μL，向待測樣品孔加入待測細胞上清樣品100 μL，膠紙封板后箱孵育90 min。加生物素化抗體工作液，膠紙封板后孵育60 min，棄去孔內液體后甩干洗板。加酶聯(lián)工作液，膠紙封板后孵育60 min，棄去孔內液體后甩干洗板。加顯色液顯色30 min，加終止液。使用酶標儀檢測各孔在450 nm波長處的A值，記錄并分析處理數(shù)據(jù)。

1.2.6 Western blot法檢測RANKL蛋白表達 按實驗分組對細胞進行相應處理，收集蛋白并定量后進行SDS-PAGE電泳。按照濃縮膠80 V恒壓，分離膠120 V恒壓的條件進行電泳，待蛋白指示劑到達膠底時停止電泳。取出聚丙烯酰胺凝膠，按照蛋白質Marker的指示切下所需部分，按照凝膠的大小裁切NC膜，并在兩側加放數(shù)層濾紙，從負極到正極的順序為濾紙、凝膠、NC膜、濾紙，轉膜條件為250 mA恒流1 h。完成轉膜后，對NC膜進行裁切并將其放入新鮮配制的5%的脫脂奶粉中封閉2 h。滴加稀釋后的一抗溶液(RANKL，1∶500)，4 ℃冰箱過夜孵育。次日取出，于搖床上洗去多余一抗，擦干后孵育二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜。將發(fā)光液A、B以1∶1比例混合均勻后放入顯影儀顯影，并對樣本條帶結果記錄分析。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結 果

2.1 實驗性根尖周炎牙槽骨吸收病灶X線影像分析

X線片示：術后7 d，對照組和辛伐他汀干預組大鼠出現(xiàn)根尖病灶，牙槽骨和牙骨質有輕微的破壞，但對照組與辛伐他汀干預組無明顯差異; 此后，病灶的面積逐漸增大，21 d 時病灶的面積達到最大值。術后14 d起，辛伐他汀干預組的病灶區(qū)域面積開始小于對照組(P<0.05)，術后21 d辛伐他汀干預組的病灶區(qū)域面積明顯小于對照組(P<0.001)(圖 1)。

2.2 RANKL免疫組化染色

普通光學顯微鏡觀察根尖組織病理切片。免疫組化陽性結果呈棕黃色，對照組和用藥組的RANKL表達在術后1 d時少量出現(xiàn)，7 d時開始增加。對照組在14 d時繼續(xù)增加，在21 d左右達峰值; 而辛伐他汀用藥組的RANKL表達從14 d開始少于對照組，21 d時對照組的RANKL表達量明顯高于辛伐他汀用藥組(圖 2)。

圖 1 實驗性根尖周炎牙槽骨吸收病灶X線掃描影像分析

圖 2 RANKL在各組大鼠根尖病灶中的表達

2.3 細胞培養(yǎng)上清液中IL-6的測定

按細胞培養(yǎng)分組收集藥物刺激后的上清培養(yǎng)液,根據(jù)ELISA試劑盒說明建立標準曲線。分組檢測各組IL-6水平，實驗結果顯示，與正常培養(yǎng)組相比，LPS感染組中IL-6的表達明顯增高(P<0.001)，而在此基礎上辛伐他汀會抑制細胞IL-6的表達(P<0.001)，且辛伐他汀的劑量越高，抑制效果越明顯(圖 3)。

2.4 細胞RANKL蛋白表達情況

Western blot結果顯示，與正常培養(yǎng)組相比，IL-6刺激組中RANKL的表達明顯增高(P<0.001)，辛伐他汀會抑制細胞的RANKL蛋白的表達(P<0.001)，且辛伐他汀的劑量越高，抑制效果越明顯。與對照組相比，LPS感染組中RANKL的表達明顯增高(P<0.001)，而在此基礎上辛伐他汀會降低細胞的RANKL蛋白的表達(P<0.001)，同時辛伐他汀的劑量越高，抑制效果越明顯。表明辛伐他汀可抑制IL-6所導致的RANKL的激活，進而抑制炎癥反應(圖 4)。

圖 3 LPS及辛伐他汀對HMSCs IL-6表達的影響

3 討 論

成骨細胞和骨髓間充質干細胞表達RANKL，RANKL的胞外受體結合結構域能夠與破骨細胞前體細胞表達的RANK相結合，激活RANK信號通路[5]。RANK接收到的信號將經(jīng)由TRAF-6等一系列信號分子傳導至核因子-κB，進而信號入細胞核，增加c-Fos的表達，啟動破骨細胞生成基因的轉錄，最終產(chǎn)生成熟的破骨細胞[4]。所以RANK/RANKL信號通路是維持成骨破骨平衡的重要信號通路。該通路受到激素、細胞因子和生長因子等多種物質的調節(jié)[6-8]，故研究其在炎癥過程中的變化具有重要意義。

本研究通過X線掃描發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀處理根尖周炎模型大鼠可抑制炎癥反應，在第14天和21天時病灶面積小于未處理組，同時免疫組化染色檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠根尖炎模型生理鹽水組中，RANKL的表達逐漸增多，在第3周末時達到高峰，而辛伐他汀用藥處理會減少大鼠根尖炎模型中RANKL的表達，在第14天和21天時最為明顯。以上結果表明辛伐他汀可抑制大鼠根尖周炎的炎癥進程。

圖 4 辛伐他汀和IL-6對HMSC細胞RANKL蛋白表達的影響

IL-6是一種多功能的細胞因子，有廣泛的生物學效應，在骨結合初期，可由成骨細胞分泌[9]。以往研究表明IL-6與牙齦炎和牙周炎的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，是引起根尖周骨質破壞的重要炎癥因子[10]。IL-6由成骨細胞激活分泌，可直接作用于成骨細胞，提高RANKL的表達[11]，抑制成骨細胞活性；或通過其他炎癥因子，間接作用于破骨細胞[12]，引起破骨細胞的增殖分化，增加周圍炎癥，促進骨基質的降解，骨吸收發(fā)生，從而打破骨形成與骨吸收的這一動態(tài)平衡[13]。研究表明，應用人工合成的IL-6刺激骨細胞后，通路中的JAK2蛋白磷酸化程度增加，提示IL-6 可以促進骨細胞表達RANKL，并且與JAK2 的活化密切相關[11]。為了探究辛伐他汀在根尖周炎中的作用機制，實驗研究了LPS刺激成骨細胞后其對IL-6的影響。ELISA檢測細胞上清液發(fā)現(xiàn)，LPS可促進IL-6的表達，而辛伐他汀可抑制LPS引起的IL-6上調。進一步研究表明，在成骨細胞中IL-6刺激可上調RANKL蛋白的表達，同樣辛伐他汀可抑制這種上調作用。以上結果表明，用內毒素處理細胞后，RANKL的表達增多，而辛伐他汀會通過抑制IL-6的表達減小這種作用，且辛伐他汀的濃度越高，對RANKL的抑制效果越明顯，Western blot檢測也證明了以上結論。

總之，本實驗證實了適當劑量的辛伐他汀能夠抑制成骨細胞中IL-6的表達，并通過RANK-RANKL信號通路影響破骨細胞的成熟和炎癥進程。這些實驗數(shù)據(jù)也為臨床根尖周炎發(fā)病機制的研究及新的治療方法提供了一定的理論依據(jù)。