張欣 王佩 馬良坤 劉俊濤 趙繼志

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是最常見的妊娠并發(fā)癥之一，表現(xiàn)為糖代謝異常，與胰島素抵抗和慢性炎癥密切相關(guān)。目前GDM的發(fā)病機(jī)制尚完全未明了，且治療方法相對有限[1-2]。人體微生物組被稱為人類第二基因組，是內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的重要組成部分，與疾病和健康密切相關(guān)[3]。研究證實(shí)口腔菌群與腸道菌群在心腦血管疾病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病等多種系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[4]。牙周疾病與妊娠關(guān)系密切，牙齦炎癥可隨孕程進(jìn)展加重，且慢性牙周炎被證實(shí)是先兆子癇、GDM、早產(chǎn)和低體重兒的危險因素[5-7]。研究表明牙周致病菌牙齦卟啉單胞(Porphyromonasgingivalis)在口腔的定植可能引起腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂變，引發(fā)腸道炎癥，與血糖變化水平相關(guān)[4,8-10], 提示口腔菌群可能通過單獨(dú)作用或與腸道菌群交互作用等形式參與了GDM的發(fā)病機(jī)制。關(guān)于口腔菌群以及腸道菌群與GDM關(guān)系的研究較少，口腔菌群多取自于唾液樣本,且研究結(jié)果不一[2,11-12]。

本研究旨采用16S rRNA基因擴(kuò)增子測序技術(shù)進(jìn)一步分析GDM患者口腔菌群和腸道菌群的特點(diǎn)，為GDM的臨床診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究共納入中孕期(孕24～28 周)婦女51 例，其中GDM組11 例，健康對照組40 例。研究對象來自參加本課題組“妊娠期腸道微生物隊(duì)列研究”孕中期的孕婦，均招募于自北京協(xié)和醫(yī)院普通產(chǎn)科門診，于孕13+6周前首次建檔并入組，規(guī)律產(chǎn)檢。排除標(biāo)準(zhǔn)：入組時患消化系統(tǒng)疾病如胃炎、胃潰瘍、炎癥性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病)；患高血壓、糖尿病、血脂異常等代謝疾病；系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫疾??；合并惡性腫瘤；近3 個月內(nèi)服用過抗生素或抗菌素；患妊娠期高血壓，子癇前期和子癇；孕期服用過抗生素和益生菌；孕期曾接受過口腔檢查和治療。

GDM的診斷在孕24～28 周時進(jìn)行，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會及圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)分會制定的《妊娠合并糖尿病診治指南(2014)》，行標(biāo)準(zhǔn)化口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，口服75 g糖，如服糖前及服糖后1、2 h(分別標(biāo)注為OGTT.0 h，OGTT.1 h和OGTT.2 h)，3 項(xiàng)血糖值中任何一項(xiàng)達(dá)到或超過5.1、10.0、8.5 mmol/L(92、180、153 mg/dl)，即診斷為GDM。

1.2 口腔檢查及樣本采集

1.2.1 唾液樣本采集 唾液樣本在OGTT檢測當(dāng)天的上午8～11 時于產(chǎn)科門診采集，受試者當(dāng)天不刷牙，采集前用清水漱口，用5 mL無菌離心管收集無刺激性唾液約2 mL，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存。

1.2.2 口腔檢查 所有受試者在口腔科門診經(jīng)由同一名口腔科醫(yī)師進(jìn)行口腔檢查，口腔檢查時記錄齲失補(bǔ)指數(shù)(decayed, missing, filled teeth,DMFT)和牙周臨床指標(biāo)包括探診深度(probing depth,PD)和探診后牙齦出血指數(shù)(bleeding index,BI),并計(jì)算平均PD(mean PD)和平均BI(mean BI)值。

1.2.3 牙菌斑樣本采集 口腔檢查后即刻采集牙菌斑樣本，棉卷隔濕后用無菌刮治器分別采集指數(shù)牙16，17，11，26，27，36，37，31，46，47近中牙面的齦上和齦下集合菌斑，分置于1.5 mL無菌離心管中，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃保存。

1.2.4 糞便樣本收集 糞便樣本由受試者在家中自行采集，排便在一次性便盆內(nèi)，取便中末段內(nèi)部標(biāo)本，置于收集管保存液中。

1.3 DNA提取和測序

采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB)方法提取樣本基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度后，使用帶Barcode的特異引物515F-806R對16S rDNA的V4測序區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增。

PCR產(chǎn)物混樣和純化后，使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit(Illumina公司,美國)建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

1.4.1 測序數(shù)據(jù)處理 根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V 1.2.7, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)，對每個樣本的reads進(jìn)行拼接，從而獲得原始Tags數(shù)據(jù)。參照Qiime(V 1.9.1 http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.h tml)的Tags質(zhì)量控制流程，過濾處理后得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)。隨后去除嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。

1.4.2 OTU聚類和物種注釋 利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)對所有樣本的全部 Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，用Mothur方法與SILVA132(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1)。使用MUSCLE(Version 3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/)軟件進(jìn)行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。 最后對各樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

1.4.3 功能預(yù)測 提取KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫原核生物全基因組16S rRNA基因序列并利用BLASTN算法將其比對到SILVA SSU Ref NR數(shù)據(jù)庫(BLAST bitscore>1500)建立相關(guān)矩陣， 將通過UProC(ultra-fast protein domain classification)注釋的KEGG數(shù)據(jù)庫原核生物全基因組功能信息對應(yīng)到SILVA數(shù)據(jù)庫中，實(shí)現(xiàn)SILVA數(shù)據(jù)庫功能注釋。測序樣品以SILVA數(shù)據(jù)庫序列為參考序列聚類出OTU，進(jìn)而獲取功能注釋信息。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

唾液樣本用A表示，牙菌斑樣本用B表示，腸道樣本用C表示，其中G代表GDM組，H代表健康對照組。兩組間物種多樣性差異用T-test或Mann-Whitney-Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行分析，利用MetaStat方法進(jìn)行物種顯著性差異分析。Spearman相關(guān)性分析方法分析物種豐度與臨床相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象基本情況

納入中孕期(24～28 周)婦女51 例，其中GDM組11 例，健康對照組40 例，兩組間在年齡，孕前體重，整個孕期增重，孕次，產(chǎn)次，孕周以及口腔健康指標(biāo)，包括平均探診深度，平均探診出血水平，齲失補(bǔ)牙數(shù)上均無顯著差異。GDM組OGTT.0 h，OGTT.1 h, OGTT.2 h的血糖水平均顯著高于健康對照組(P<0.05)(表 1)。

表 1 研究對象基本情況

2.2 物種注釋情況

通過對Reads拼接，平均每樣品測得88 406 條tags，經(jīng)過質(zhì)控平均得到84 447 條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達(dá)75 707，質(zhì)控有效率達(dá)85.69%。 以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)，共得到12 139 個OTUs，然后對OTUs序列與Silva132數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋。其中，能夠注釋到數(shù)據(jù)庫的OTUs數(shù)目為 12 119(99.84%)，注釋到界水平的比例為99.84%，門水平的比例為91.88%，綱水平的比例為85.62%，目水平的比例為74.98%，科水平的比例為63.76%，屬水平的比例為37.60%，種水平的比例為10.93%。

2.3 GDM組和健康對照組間的比較

2.3.1 OTUs分析 圖 1的結(jié)果顯示，在唾液，牙菌斑和腸道樣本中，GDM組的OTU數(shù)均小于各自對照組。牙菌斑樣本的OTU數(shù)最多，腸道和唾液樣本間無明顯差異。

2.3.2 各組間Top10豐度菌群的比較 如圖 2所示唾液，牙菌斑，腸道3 類樣本top10豐度菌群的比例在門、屬水平上均存在明顯差異，在同類樣本中GDM組和健康組間top10豐度菌群構(gòu)成比類似，屬水平上GDM組唾液中擬桿菌屬(Bcteroides)的豐度以及牙菌斑中葉桿菌屬(Phyllobacterium)的豐度均高于各自的健康對照組。

圖 1 基于OTU的韋恩圖

圖 2 門和屬水平TOP10菌群累積柱狀

2.3 Alpha多樣性的比較

Alpha多樣性比較的結(jié)果示3 類樣本中GDM組observed-species指數(shù)和chao1指數(shù)均低于各自的健康對照組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖 3)。

圖 3 GDM組和健康對照組菌群alpha多樣性指數(shù)的比較

2.4 Beta多樣性和Tax4Fun功能預(yù)測的比較

如圖4所示牙菌斑、唾液和腸道樣本基于 Beta多樣性的 PCoA 在不同類型樣本間呈現(xiàn)很好分離，各自聚類，同類型樣本GDM組與健康組聚集，顯示不同類型樣本間菌群結(jié)構(gòu)有顯著差異性，同類樣本的GDM組與健康組間的差異不明顯。腸道樣本的功能與牙菌斑和唾液樣本功能分類聚合，其功能組成存在明顯差異。唾液樣本和牙菌斑樣本功能分離不明顯。整體水平上同類樣本中GDM組和健康對照組功能差異均不明顯。

圖 4 基于主成分1和2的weighted PCoA圖(A)和Tax4Fun功能注釋PCA圖(B)

2.5 GDM組和健康組差異菌屬分析

Metastat分析的結(jié)果顯示在屬水平，唾液樣本和牙菌斑樣本中GDM組氣單胞菌屬(Aeromonas)的豐度均顯著低于健康對照組(P分別為0.044和0.048)。唾液樣本中代爾夫特菌屬(Delftia)和卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)的豐度均顯著低于健康對照組(P分別為0.011和0.044)。腸道樣本中GDM組嗜血桿菌屬(Haemophilus)的豐度顯著低于健康對照組(P=0.019)。

圖 5 GDM組和健康組Metastat分析屬水平差異物種的豐度分布箱型圖

2.6 菌群豐度與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.g)的豐度不僅與牙周臨床指標(biāo)平均PD，平均BI顯著正相關(guān)(PDr=0.396P<0.001, BIr=0.350,P<0.001)，還與OGTT.0 h顯著正相關(guān)(r=0.243,P=0.001)。除此之外OGTT.0 h與Prevotella_copri的豐度顯著正相關(guān)(r=0.176,P=0.016)，與Cercis_gigantea的豐度顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.159,P=0.03)。OGTT.1 h與Bacteroides dorei和Leptotrichia_sp_oral_clone_EI 013的豐度均顯著正相關(guān)(r分別為0.206和0.167,P分別為0.005和0.023)。OGTT.2 h與Bacteroides_massiliensis的豐度顯著正相關(guān)(r=0.149，P=0.043)，與Corynebacterium_durum的豐度顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.154，P=0.035)。

圖 6 種水平菌群豐度與臨床指標(biāo)的Spearman相關(guān)性分析

3 討 論

本研究通過16S rRNA擴(kuò)增子測序技術(shù)對中孕期11 例GDM患者和40 例妊娠期健康對照進(jìn)行了口腔和腸道菌群的微生物特征分析，進(jìn)一步探討身體不同部位菌群與GDM的關(guān)系。在本研究中所有受試者除糖代謝水平不同外，在孕周，孕前BMI，孕期GWG，口腔健康指標(biāo)(包括Mean PD, Mean BI, DMFT)以及年齡，孕產(chǎn)次上均無顯著差異。兩組間混雜因素匹配性良好。

本研究的結(jié)果顯示在唾液，牙菌斑和腸道樣本中，GDM組與各自的健康對照組相比，菌群豐富度略低，Alpha多樣性指數(shù)的差異未及統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TOP10豐度菌群構(gòu)成比類似，菌群Beta多樣性和功能預(yù)測均無顯著差異，提示孕中期三類樣本核心菌群的結(jié)構(gòu)和功能是相對穩(wěn)定的。目前關(guān)于菌群與GDM關(guān)系的研究多關(guān)注于腸道菌群和唾液菌群，且結(jié)論不一。一項(xiàng)基于 PacBio SMRT 測序技術(shù)的GDM患者腸道菌群分析的結(jié)果顯示：GDM患者與健康對照者之間的observed-species多樣性和Shannon多樣性差異顯著，而Beta多樣性和功能構(gòu)成均無顯著差異[13]。而另一項(xiàng)GDM腸道菌群宏基因組研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GDM婦女Shannon多樣性低于健康對照者，但差距無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Beta多樣性顯著高于健康對照[14]。在一項(xiàng)以晚孕期婦女為研究對象的病例對照研究中，Xu等[2]學(xué)者利用16S rRNA測序方法同時分析了GDM患者和健康對照腸道菌群和唾液菌群的特點(diǎn)，腸道菌群的分析結(jié)果顯示GDM組與健康組相比Alpha多樣性指數(shù)以及基于weighted-UniFrac距離的Beta多樣性指數(shù)均無顯著差異，與本研究腸道菌群分析結(jié)果一致。唾液菌群的分析結(jié)果顯示GDM組Alpha多樣性指數(shù)顯著低于健康對照組，Beta多樣性指數(shù)無顯著差異。與本研究中唾液樣本中分析結(jié)果略有不同。在另一項(xiàng)關(guān)于唾液菌群與GDM關(guān)系的文章中，作者同樣利用16S rRNA測序技術(shù)比較了晚孕期GDM患者和健康對照間唾液菌群的差異，結(jié)果顯示，兩組間菌群多樣性和結(jié)構(gòu)均無顯著差異[11]，與本研究中結(jié)果一致。唾液和腸道菌群研究結(jié)果的不一致性可能與研究對象所在孕期，年齡，孕前BMI混雜因素的影響以及檢測方法不同有關(guān)。

Metastat分析在屬水平的結(jié)果顯示，與健康對照組相比，GDM組唾液氣單胞菌屬，代爾夫特菌屬和卟啉單胞菌屬以及牙菌斑氣單胞菌屬水平和腸道組嗜血桿菌屬水平顯著降低。其中腸道組嗜血桿菌屬的結(jié)果與Cortez等[15]研究中結(jié)果一致。Top10豐度菌群構(gòu)成比在屬水平上分析的結(jié)果顯示，GDM組唾液中擬桿菌屬(Bcteroides)的豐度以及牙菌斑中葉桿菌屬(Phyllobacterium)的豐度均高于各自的健康對照組。而在差異菌屬M(fèi)etastat分析的結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)唾液擬桿菌屬和牙菌斑葉桿菌屬在疾病組和健康組間的差異。其原因可能與組內(nèi)差異大于組間差異有關(guān)。以上豐度表達(dá)差異菌屬的結(jié)果均需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

Spearman分析的結(jié)果顯示牙齦卟啉單胞菌和Bacteroidesdorei的豐度分別與OGTT.0 h和OGTT.1 h顯著相關(guān)，提示牙齦卟啉單胞菌和Bacteroidesdorei可能對GDM患者體內(nèi)的血糖水平產(chǎn)生影響。牙齦卟啉單胞菌是重要的牙周致病菌，與牙周炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究報告顯示牙齦卟啉單胞菌可以引起試驗(yàn)動物體內(nèi)糖代謝異常和胰島素抵抗[8]，人體內(nèi)唾液和牙菌斑中的牙齦卟啉單胞菌與糖尿病患者體內(nèi)血糖水平相關(guān)[9-10]。本研究的結(jié)果顯示，牙齦卟啉單胞菌的水平不僅與牙周臨床BI和PD顯著正相關(guān)，還與OGTT-0 h的血糖水平顯著正相關(guān)。與既往研究結(jié)果一致。Bacteroidesdorei水平與OGTT.1 h的顯著正相關(guān)的結(jié)果與Wu等[14]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

GDM組和健康對照組間差異表達(dá)菌屬如唾液中氣單胞菌屬和代爾夫特菌屬，牙菌斑中氣單胞菌屬，腸道中嗜血桿菌屬或可成為疾病的生物標(biāo)記物。牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌與血糖水平顯著相關(guān)，牙周健康對GDM的影響值得關(guān)注。