夏思穎 楊亞楠 閆香珍 章海兵 羅禮君

受體相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1，RIP1)是受體相互作用蛋白(RIP)激酶家族中的一員，它們是一類具有特異的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白，是細(xì)胞應(yīng)激的重要傳感器，是激活多種細(xì)胞死亡途徑并控制炎癥信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[1]。RIP1與凋亡相關(guān)受體結(jié)合參與依賴半胱天冬酶(Caspase)調(diào)控的細(xì)胞凋亡[2]，也在Caspase受抑制時參與細(xì)胞壞死性凋亡[3]。同時，RIP1通過激酶依賴性和非依賴性兩種方式調(diào)節(jié)炎癥信號[4]。當(dāng)RIP1信號傳導(dǎo)失調(diào)可導(dǎo)致過度的炎癥或細(xì)胞死亡，因此RIP1對生物體穩(wěn)態(tài)的調(diào)控起重要作用[1]。在常見口腔疾病中，牙周炎作為一種與多種系統(tǒng)性疾病相關(guān)的慢性炎癥性疾病[5]，目前已有研究報道稱牙周炎涉及細(xì)胞凋亡[6]，但細(xì)胞壞死性凋亡對于牙周炎的發(fā)生發(fā)展的作用尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過構(gòu)建RIP1基因條件性敲除小鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，進(jìn)一步明確RIP1在牙周炎致病過程中的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例來源及分組

選擇2019 年就診于同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院的18～60 歲患者為研究對象，分為牙周炎組和牙周健康組，研究經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有標(biāo)本的收集均取得患者知情同意。牙周炎組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷為Ⅲ～Ⅳ期牙周炎(根據(jù)2018年牙周分類標(biāo)準(zhǔn)[7]：牙間鄰面最嚴(yán)重的位點(diǎn)附著喪失≥ 5 mm，影像學(xué)顯示牙槽骨吸收至牙根1/2或根尖1/3)；(2)不伴有其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病及免疫系統(tǒng)疾病的患者。牙周健康組納入標(biāo)準(zhǔn)[8]：(1)牙周組織健康，其特征為無探診出血、牙齦無紅腫、無附著喪失和無牙槽骨骨喪失；(2)不伴有其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病及免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

本研究采用無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級小鼠，對照組為野生型(WT)C57/BL6小鼠，實(shí)驗(yàn)組為相同背景下巨噬細(xì)胞條件性敲除RIP1基因的小鼠(RIP1-/-)。所有小鼠均為6～8 周齡雄性小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后建立牙周炎模型。

1.3 Western blot分析

實(shí)驗(yàn)組為牙周炎組患者在行翻瓣術(shù)中收集的牙齦組織，對照組為牙周健康組患者行阻生齒拔除術(shù)中收集的牙齦組織。組織在液氮中充分研磨，加入RIPA裂解液(P0013B，碧云天)和1% Cocktail tablets蛋白酶抑制劑(Bimake公司, 美國)，冰上裂解30 min后離心, 收集上清，BCA法(碧云天)檢測濃度。加入上樣緩沖液后置于100 ℃金屬浴中10 min，每組取含20 μg蛋白等體積行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜(Millipore公司，美國)，用5%脫脂奶粉室溫下封閉90 min，加入RIP1(1∶1 000)及GAPDH(1∶5 000)一抗4 ℃過夜。TBST洗膜3 次，每次15 min，加入熒光二抗避光孵育2 h，同樣方式洗膜，雙色紅外激光成像系統(tǒng)(LI-COR公司，美國)進(jìn)行熒光顯影，使用Image J繪制定量圖。

1.4 小鼠牙周炎模型的建立

分別選取6 只6～8 周RIP1條件性敲除(RIP1-/-)小鼠及6 只6～8 周野生型(WT)C57/BL6小鼠，通過腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)進(jìn)行麻醉，在右側(cè)上頜第二磨牙牙頸部用5-0絲線結(jié)扎誘導(dǎo)牙周炎。7 d后將各組小鼠頸脫位法處死，取上頜骨用4%多聚甲醛固定, 運(yùn)用Micro CT(μCT50，SCANCO，瑞士)進(jìn)行掃描成像后測量各組小鼠右側(cè)上頜第二磨牙頰側(cè)牙尖和溝裂及腭側(cè)牙尖和溝裂的釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂(cementoenamel junction to the alveolar bone crest,CEJ-ABC)的距離，分析牙槽骨喪失量(alveolar bone loss,ABL)。

1.5 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR

提取各組小鼠上頜骨對照側(cè)及實(shí)驗(yàn)側(cè)牙齦組織，在液氮中充分研磨，TRIZOL法提取各組RNA，檢測濃度后每組取1 μg RNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，日本)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用基因特異性引物和SYBR GREEN qRT-PCR試劑盒(Roche公司，瑞士)檢測兩組小鼠牙齦組織相關(guān)炎癥因子mRNA水平的表達(dá)差異。引物序列見表 1。

表 1 實(shí)時熒光定量PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 牙周炎患者牙齦組織中RIP1蛋白的表達(dá)量

Western blot結(jié)果顯示，牙周炎患者牙齦組織中RIP1蛋白表達(dá)明顯低于牙周健康者(圖 1)。

2.2 RIP1-/-敲除小鼠的實(shí)驗(yàn)性牙周炎中牙槽骨喪失量增多

Micro CT三維重建分析結(jié)果顯示，建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的RIP1-/-小鼠患側(cè)的牙槽骨喪失量均大于WT組小鼠(圖 2)。說明抑制小鼠體內(nèi)RIP1的表達(dá)可以加重其實(shí)驗(yàn)性牙周炎牙槽骨的吸收。

2.3 RIP1-/-小鼠的牙齦組織中炎癥因子表達(dá)

qRT-PCR(LightCycler96，Roche，瑞士)檢測野生型小鼠及RIP1敲除小鼠牙齦組織相關(guān)炎癥因子TNF-α(A)、IL-6(B)、iNOS(C)、IL-11(D)、Arg-1(E)和IL-10(F)mRNA的相對表達(dá)量。

qRT-PCR結(jié)果顯示，在未建立牙周炎模型的對照側(cè)牙齦組織中，RIP1-/-組小鼠相比于WT組小鼠促炎因子TNF-α、IL-11及抑炎因子IL-10的mRNA表達(dá)升高，在已建立牙周炎模型的實(shí)驗(yàn)側(cè)牙齦組織中，RIP1-/-組小鼠相比于WT組小鼠促炎因子IL-6、IL-11及抑炎因子IL-10的mRNA表達(dá)升高，促炎因子iNOS的表達(dá)反而降低(圖 3)，同時，WT組小鼠的實(shí)驗(yàn)側(cè)牙齦組織中抑炎因子Arg-1與對照側(cè)相比有所升高，而RIP1-/-組小鼠的實(shí)驗(yàn)側(cè)牙齦組織中促炎因子IL-6和抑炎因子Arg-1與對照側(cè)相比有所升高，結(jié)果說明抑制小鼠體內(nèi)RIP1的表達(dá)可以改變小鼠牙齦組織中炎癥因子的表達(dá)。

圖 1 牙周炎患者及牙周健康者牙齦組織RIP1蛋白的表達(dá)

圖 2 RIP1-/-敲除小鼠及WT小鼠上頜骨Micro CT掃描結(jié)果

圖 3 野生型小鼠及RIP1-/-敲除小鼠牙齦組織相關(guān)炎癥因子mRNA的表達(dá)

3 討 論

本研究結(jié)果顯示牙周炎患者的牙齦組織中RIP1表達(dá)下降，同時在巨噬細(xì)胞條件性敲除RIP1基因小鼠上建立牙周炎模型后觀察到與對照組相比牙槽骨的喪失量增加，并且牙齦組織中炎癥相關(guān)因子的表達(dá)趨勢改變，提示抑制RIP1可能會改變小鼠本身對于炎癥的反應(yīng)，并且會促進(jìn)小鼠牙周炎中的促炎和抗炎進(jìn)程。

牙周炎作為一種慢性炎癥性疾病，涉及多種細(xì)胞死亡方式。牙周炎患者牙齦組織中與凋亡相關(guān)的基因表達(dá)上升[9]，且細(xì)胞凋亡受牙齦組織中特定的腺苷受體調(diào)節(jié)[10]，并會造成成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、骨鈣素等的表達(dá)降低[11]。壞死性凋亡在牙周炎中的具體作用尚未明確，但已有研究表明，牙齦卟啉單胞菌通過RIP1/RIP3/混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(mixed lineage kinase domain like pseudokinase，MLKL)信號通路誘導(dǎo)單核細(xì)胞的死亡[12]，并且單核細(xì)胞釋放的損傷相關(guān)的分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)可以觸發(fā)炎癥和牙周膜成纖維細(xì)胞的壞死性凋亡[13]。也有研究顯示，抑制RIP3/caspase-8可以保護(hù)牙周膜干細(xì)胞并促進(jìn)炎性微環(huán)境中牙周組織再生[14]，但是，缺乏更多的研究證實(shí)與壞死性凋亡密切相關(guān)的RIP1在牙周炎中的作用。

RIP1參與炎癥和多種細(xì)胞死亡方式，現(xiàn)有研究顯示，RIP1在受到某些蛋白泛素化或去泛素化修飾時，與FADD(fas-associating protein with a novel death domain，F(xiàn)as相關(guān)死亡域蛋白)、caspase-8形成復(fù)合體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1]；當(dāng)caspase-8受抑制時，RIP1與RIP3形成復(fù)合體誘導(dǎo)壞死性凋亡，激活MLKL破壞細(xì)胞膜造成細(xì)胞死亡[15]。有研究報道，當(dāng)抑制炎癥浸潤巨噬細(xì)胞中的RIP1會增加caspase-3的激活，并且改變巨噬細(xì)胞極化，發(fā)揮抑炎作用M2巨噬細(xì)胞減少而促炎相關(guān)的M1巨噬細(xì)胞增加[16]。RIP1參與NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，當(dāng)泛素化RIP1受到與NF-κB通路正向調(diào)節(jié)物轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(transforming growth factor β-activated kinase 1，TAK1)復(fù)合物等調(diào)控，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)；當(dāng)RIP1受到NF-κB的負(fù)調(diào)控因子泛素編輯酶A20和去泛素化酶CYLD等作用時可發(fā)揮抑炎反應(yīng)[1]。也有研究發(fā)現(xiàn)，造血細(xì)胞中的RIP1缺乏會刺激細(xì)胞因子及趨化因子的釋放并產(chǎn)生一定的組織炎癥后造成造血功能衰竭并影響骨髓的生成[17]。因此，根據(jù)本研究的結(jié)果推測RIP1可能參與牙周炎癥的過程，但由于RIP1功能的多重性，同時炎癥與細(xì)胞死亡也存在多種復(fù)雜的關(guān)聯(lián)[18]以及牙周炎病因的復(fù)雜性[19]，本研究尚無法準(zhǔn)確解釋RIP1影響牙周炎的具體機(jī)制，這也是本實(shí)驗(yàn)中RIP1基因條件性敲除小鼠牙齦組織中促炎和抗炎因子表達(dá)趨勢不同的可能原因。

在RIP1的結(jié)構(gòu)中包含一個氨基端激酶域、一個中間域和一個羧基端死亡域，每個結(jié)構(gòu)域的不同位點(diǎn)都對炎癥與細(xì)胞死亡起重要作用。例如，RIP1中間域Lys377處被特異性泛素化時，對TNF-α激活NF-κB通路起關(guān)鍵作用[20]；RIP1中間域中的受體相互作用同型相互作用基序(receptor-interacting protein homotypic interaction motif，RHIM)與RIP3中的RHIM形成是壞死性凋亡的必需復(fù)合物[21]；RIP1的死亡結(jié)構(gòu)域與FADD相互作用觸發(fā)凋亡[22]。因此，未來或許可以條件性敲除RIP1中的某些位點(diǎn)，以進(jìn)一步探究RIP1對牙周炎的具體作用及機(jī)制。

綜上，本實(shí)驗(yàn)說明牙周炎患者牙齦組織中相比于牙周健康者RIP1的表達(dá)明顯下調(diào)，同時，在小鼠體內(nèi)條件性敲除RIP1基因會造成其實(shí)驗(yàn)性牙周炎中牙槽骨喪失量增多，并引起炎癥因子的表達(dá)改變，表明RIP1可能通過調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)從而影響牙周炎的發(fā)生發(fā)展，這都為進(jìn)一步探究RIP1在牙周炎中的作用提供了基礎(chǔ)。