湯小英 戴曉云 黃彥

牙髓再生治療旨在通過(guò)細(xì)胞移植和細(xì)胞歸巢兩種方法來(lái)再生牙髓樣組織[1-3]。前者需要外來(lái)移植干細(xì)胞、復(fù)雜的程序和高昂的成本，后者利用宿主的內(nèi)源性細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)組織修復(fù)或再生，更具臨床可行性。目前臨床運(yùn)用較多的牙髓再生方法是牙髓血運(yùn)重建術(shù)，其目的是通過(guò)嚴(yán)格的消毒控制炎癥，刺激根尖引血以及嚴(yán)密的冠方封閉獲得牙髓組織再生。但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牙髓血運(yùn)重建獲得的更多是類似牙周組織的新生物，這樣會(huì)造成牙根內(nèi)鈣化，再次感染后會(huì)造成治療復(fù)雜化[4-5]。全牙髓存活可能規(guī)避牙髓血運(yùn)重建獲得的牙周組織新生物造成的治療復(fù)雜化[6]。本團(tuán)隊(duì)前期研究將乳牙牙髓組織自體移植入年輕恒牙根管，結(jié)果顯示植入根管內(nèi)的乳牙牙髓組織保存活性，但移植牙髓成功的具體原因未知，既往研究發(fā)現(xiàn)血運(yùn)重建可能是影響乳牙牙髓移植成功的重要影響因素[7]?；|(zhì)膠(Matrigel)是一種可溶性的基底膜蛋白多糖基質(zhì)，能夠較好的模擬基底膜的各方面的特性，有助于培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞形成互相連接的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)。為驗(yàn)證血運(yùn)重建在乳牙牙髓移植中的作用，構(gòu)建裸鼠異位模型，加入基質(zhì)膠來(lái)促進(jìn)血管生成。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)方案包括照顧和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，均經(jīng)過(guò)了南昌大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。獲取的牙齒以及牙髓，均獲得了知情同意以及經(jīng)過(guò)了南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1 主要試劑和儀器

超凈工作(SW-CJ-1F，蘇州凈化)；移動(dòng)渦輪機(jī)(FS15，浙江希安)； 石蠟切片機(jī)(沈陽(yáng)百事通醫(yī)療有限公司)；普通光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本 )；主要試劑： 三氧化物聚合體(MTA) (Dentsply公司，美國(guó))；α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))； 多聚甲醛(賽馳生物)；三聯(lián)抗生素(索萊寶科技公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(百奧萊博)；基質(zhì)膠(Corning公司，美國(guó))；抗CD31(Abcam，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)牙和實(shí)驗(yàn)牙處理

實(shí)驗(yàn)牙選擇：收集2019 年4～6 月在南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院因正畸治療而拔除的健康下頜前磨牙，年齡12～15 歲,收集了前磨牙36 顆。其中實(shí)驗(yàn)牙的納入標(biāo)準(zhǔn):單根管冠根完整無(wú)齲、不松動(dòng)、根尖孔未發(fā)育完成、牙周健康、牙根長(zhǎng)度大于12 mm。

半空管牙制備及分組：用手術(shù)刀片刮出牙根根面的牙周軟組織，截去牙冠以及部分牙根，獲得根尖孔大小為2 mm，長(zhǎng)度為8 mm的牙根，牙根用PROTAPER?預(yù)備到35#06，預(yù)備過(guò)程中17%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液和5.25%次氯酸鈉(NaClO)溶液交替沖洗，然后沿牙根中線破開(kāi)牙根，一分為二。在室溫下按順序用 5.25%NaClO溶液超聲振蕩5 min，PBS 溶液超聲振蕩5 min，17%EDTA 溶液超聲振蕩15 min，最后用PBS溶液超聲振蕩5 min，隨之使用去離子水震蕩30 min，最后置入預(yù)備好的營(yíng)養(yǎng)液中浸泡，用MTA封閉冠部，操作結(jié)束后立即轉(zhuǎn)移至4 ℃恒溫冰箱備用。半空管牙分為A、B、C 3 組，每組12 顆。

乳牙牙髓獲得：收集2019 年7～8 月在南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院因乳牙滯留的而拔除的健康的前牙24 顆。乳牙納入實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)：冠部完整無(wú)齲、無(wú)明顯松動(dòng)、X線片顯示牙根吸收未及1/3。用高速手機(jī)在乳牙牙體表面預(yù)備出一直線形的牙槽，從牙槽中間劈開(kāi)乳牙，輕輕取出乳牙牙髓，立即置入預(yù)備好的營(yíng)養(yǎng)液。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

6 周齡雌性裸鼠36 只，體重20～25 g(21.36±1.24)，由南昌樂(lè)悠生物科技有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào): SYXK(贛)2017-0002。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

A組：將獲取的乳牙牙髓轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，對(duì)乳牙牙髓表面用α-MEM 培養(yǎng)基(混合三聯(lián)抗生素液)進(jìn)行沖洗，隨之將解凍成液態(tài)的基質(zhì)膠(Corning公司，美國(guó))浸乳牙牙髓，擱置室溫狀態(tài)下形成膠凍狀，將基質(zhì)膠-牙髓復(fù)合體轉(zhuǎn)移至牙空管中，與半空管牙一起植入裸鼠皮下；B組：乳牙牙髓處理同A組，但是不加入基質(zhì)膠，直接將乳牙牙髓轉(zhuǎn)移至半空管牙中，一起植入裸鼠皮下；C組：將備用的半空管牙根進(jìn)行表面清洗，消毒后直接植入裸鼠皮下。

將所有處理好的裸鼠進(jìn)行耳標(biāo)標(biāo)記。術(shù)后裸鼠仍置于南昌樂(lè)悠生物科技有限公司飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前后未進(jìn)行特殊處理，飼養(yǎng)環(huán)境無(wú)改變。由于傷口縫合以及飼養(yǎng)過(guò)程中裸鼠意外死亡等原因?qū)е聵颖救鄙?，在?shí)驗(yàn)中隨時(shí)補(bǔ)齊樣本，保證每組的樣本量恒定。確保每個(gè)樣本在裸鼠皮下生活4 周。

1.5 術(shù)后操作、組織學(xué)及免疫組化分析

術(shù)后4 周后裸鼠脫頸處死，取出牙根，置入組織固定液中48 h，17%EDTA 進(jìn)行脫鈣，每24 h更換1 次脫礦液，3 月后待脫礦完成，切片，制成玻片。進(jìn)行HE組織化學(xué)檢查。A及B組標(biāo)本進(jìn)行雙抗染色人源性CD31(servicebio、 GB21401)、鼠源性CD31(servicebio、 GB21403),最后DAPI(servicebio、G1012-100ML)復(fù)染細(xì)胞核。所有的結(jié)果都有兩位檢驗(yàn)科醫(yī)師閱片。

牙髓存活判斷標(biāo)準(zhǔn)：根管內(nèi)HE染色可見(jiàn)血管以及細(xì)胞，人源性CD31染色陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果

A組牙根內(nèi)含有裹有基質(zhì)膠的乳牙牙髓，在HE染色中，有10 例牙根內(nèi)可見(jiàn)成纖維細(xì)胞以及血管，成纖維細(xì)胞類似牙髓細(xì)胞，血管內(nèi)可見(jiàn)血細(xì)胞(圖 1A); B組：牙根內(nèi)含有未裹有基質(zhì)膠的乳牙牙髓，在HE染色中，有5例牙根內(nèi)可見(jiàn)成纖維細(xì)胞以及血管，成纖維細(xì)胞類似牙髓細(xì)胞，血管內(nèi)可見(jiàn)血細(xì)胞(圖 1B)；C組：無(wú)牙髓放入，因此HE染色未見(jiàn)成纖維細(xì)胞或牙髓細(xì)胞，但是根管內(nèi)均可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞,紅細(xì)胞以及血管(圖 1C)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

雙抗染色合成圖(圖 2)顯示，A組10 例樣本中人源性CD31和鼠源性CD31抗體染色陽(yáng)性；表明A組有10 例根管內(nèi)牙髓組織為活性，活性組織內(nèi)含有鼠來(lái)源血管供。B組5 例樣本中人源性CD31和鼠源性CD31抗體染色陽(yáng)性；表明B組有5 例根管內(nèi)牙髓組織為活性，活性組織內(nèi)含有鼠來(lái)源血管供。

2.3 乳牙牙髓存活數(shù)比較

見(jiàn)表 1。用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P<0.05。

表 1 3 組移植中牙髓存活數(shù)(n)

圖 1 半空根管內(nèi)植入移植物后4 周后組織學(xué)觀察 (HE， ×100)

圖 2 半空根管內(nèi)植入移植物后4 周后免疫熒光檢測(cè) (免疫熒光, ×100)

3 討 論

本研究前期將比格犬的乳牙牙髓組織自體移植入牙髓壞死的年輕恒牙的根管中，發(fā)現(xiàn)植入乳牙牙髓后的根管壁持續(xù)增厚、牙根增長(zhǎng)、根尖孔直徑減小，這證明了乳牙牙髓組織自體移植的可實(shí)施性[6-7]。來(lái)源于乳牙牙髓的干細(xì)胞以及來(lái)自根尖周的干細(xì)胞甚至歸巢的骨髓干細(xì)胞都可提供種子細(xì)胞，而牙髓組織本身可作為支架，牙髓組織內(nèi)以及來(lái)自根尖血液均可提供生長(zhǎng)因子[8-11]。但是牙髓移植成功的具體原因仍未知。血運(yùn)重建是組織工程成功的關(guān)鍵，牙髓位于不可讓的髓腔內(nèi)，血管來(lái)源單一，通過(guò)根尖孔來(lái)源供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)牙髓，因此血液供應(yīng)影響牙髓移植的成功[12]。

基質(zhì)膠是一種可溶性的基底膜蛋白多糖基質(zhì)，基底膜蛋白多糖廣泛存在于細(xì)胞膜表面和細(xì)胞基質(zhì)中。其主要成分類似于哺乳動(dòng)物的基底膜的生物活性基質(zhì)，能夠較好的模擬基底膜的各方面的特性[13-16]。與多種因子交互作用，從而參與機(jī)體的許多生理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的各種內(nèi)皮細(xì)胞，在基質(zhì)膠上6～12 h內(nèi)均能形成互相連接的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)[17]。本研究將乳牙牙髓與基質(zhì)膠相結(jié)合，一方面能夠很好的將乳牙牙髓固定在SEC中，另一方面由于基質(zhì)膠內(nèi)含生長(zhǎng)因子以及各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，可保證乳牙牙髓營(yíng)養(yǎng)供給，維持乳牙牙髓的活性。

牙本質(zhì)組織經(jīng)過(guò)消毒和處理后，可以暴露出新鮮的前期牙本質(zhì)，而其中包含多種牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白和細(xì)胞因子，被稱為天然的誘導(dǎo)因子儲(chǔ)備庫(kù)[18-20]。既往研究證實(shí)牙本質(zhì)片不僅具有與成牙本質(zhì)細(xì)胞相匹配的孔徑大小及孔隙率，而且可提供多種牙齒發(fā)育和再生所必需的重要因子，可以誘導(dǎo)種子細(xì)胞的黏附、增殖、分化，形成牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體，因此根管腔具有獨(dú)特的誘導(dǎo)微環(huán)境條件[21-22]。本研究采用根管腔為載體，HE染色可見(jiàn)有牙髓細(xì)胞，可能為來(lái)自本身乳牙牙髓細(xì)胞，也可能來(lái)自乳牙牙髓干細(xì)胞分化形成。實(shí)驗(yàn)未見(jiàn)形成牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體，可能為觀察時(shí)間不夠，或者乳牙牙髓細(xì)胞的直徑不能適應(yīng)年輕恒牙牙本質(zhì)小管直徑。

本研究對(duì)牙進(jìn)行半空管處理，當(dāng)半空管牙放置于裸鼠皮下時(shí)，根管內(nèi)有來(lái)自裸鼠組織的血細(xì)胞以及血管，這說(shuō)明不僅基質(zhì)膠促進(jìn)血管生成，來(lái)自裸鼠的血液也一同保障乳牙牙髓的血液供應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證乳牙牙髓移植的可行性，乳牙牙髓組織內(nèi)的干細(xì)胞發(fā)揮主要作用；通過(guò)SEC加大血運(yùn)通路，基質(zhì)膠促進(jìn)血管新生增加血運(yùn)，從而增加乳牙牙髓移植后活性。