麻 瑩， 張洪嘉， 庫都斯·阿布都沙拉木， 耿淑娟， 薛傲然， 趙翰韋， 菅柏涵

(1.吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130062； 2.六盤水市第三中學(xué)， 貴州 六盤水 553000)

土壤鹽堿化已成為限制我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)的最大障礙因素[1]。土壤鹽堿化既有中性鹽又有堿性鹽，而植物所面對(duì)的脅迫既有鹽脅迫又有堿脅迫，鹽脅迫和堿脅迫是2種不同性質(zhì)的脅迫；二者的脅迫作用機(jī)理及植物對(duì)其生理響應(yīng)也不同[1]。鹽脅迫主要有滲透脅迫和離子脅迫；而堿脅迫除上述脅迫外，還涉及高pH脅迫[1]。高pH直接干擾Na+、K+選擇性吸收，抑制陰離子吸收，打破植物體內(nèi)已經(jīng)形成的離子穩(wěn)衡態(tài)、電荷平衡、pH穩(wěn)定[2]?？梢姡瑝A脅迫對(duì)植物的破壞力更為嚴(yán)重[2]。

一直以來，植物抗鹽生理多集中在以中性鹽NaCl為主的研究[3-6]。近年來，雖然有一些有關(guān)植物對(duì)鹽堿脅迫的生理響應(yīng)[1-2]、種子萌發(fā)[7]，抗堿性與有機(jī)酸代謝[1]，堿脅迫下的基因表達(dá)[8]等研究報(bào)道，但所涉及植物鹽堿脅迫的研究都集中于對(duì)植株整體或是植物器官的研究，而以堿蓬根或葉細(xì)胞液為切入點(diǎn)，探討其溶質(zhì)響應(yīng)鹽、堿脅迫的特點(diǎn)并對(duì)其溶質(zhì)進(jìn)行功能分析的研究卻鮮見報(bào)道。許多東北堿化草原土壤pH值已高達(dá)10以上，雖然堿化土壤不利于植物生長(zhǎng)，但是有一些抗堿性極強(qiáng)的植物能夠生存[9]，如鹽地堿蓬(Suaedasalsa(L.) Pall.)就是珍貴的天然高抗堿牧草，它是研究植物抗鹽堿機(jī)制的理想材料。

本文分別用中性鹽(NaCl，Na2SO4)和堿性鹽(NaHCO3，Na2CO3)模擬鹽脅迫或堿脅迫條件，并以此對(duì)堿蓬幼苗進(jìn)行脅迫處理。通過比較根系、葉片細(xì)胞液的有機(jī)酸等溶質(zhì)應(yīng)答鹽堿脅迫的變化，進(jìn)一步探討體內(nèi)溶質(zhì)的積累及其功能特點(diǎn)，為探明堿蓬適應(yīng)鹽堿生境特殊的生理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

在中國(guó)吉林省西部天然草原采集堿蓬(S.salsa)種子，采用砂培法培養(yǎng)[1]，具體方法為：種子播種于洗凈細(xì)砂的塑料花盆中(高度14 cm，直徑17 cm)，每盆10 孔穴，每孔播種4粒種子，出苗后間苗2次，最終每孔保留1株幼苗，即每盆10 株幼苗。幼苗每天晚5∶00—6∶00用 500 ml營(yíng)養(yǎng)液(Hoagland)透灌。整個(gè)試驗(yàn)在室外進(jìn)行，處理期間人工遮雨。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將2種中性鹽NaCl和Na2SO4混合(1∶1的摩爾比)作為鹽脅迫(A組)，將2種堿性鹽NaHCO3和Na2CO3混合(同上)為堿脅迫(B組)。A,B組處理液均用Hoagland作為溶劑配制，鹽濃度均為100 mmol·L-1；以Hoagland溶液作為對(duì)照組(CK)。鹽脅迫(A)、堿脅迫(B)和對(duì)照組(CK)溶液的pH值分別是6.55，9.90，6.67；其中堿脅迫的pH值與典型的堿蓬生境的pH值相近[9]。

苗齡6周后，選取12 盆長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，隨機(jī)分成3組，每組4盆為4次生物學(xué)重復(fù)，其中1組為對(duì)照組，其余2組為鹽、堿脅迫組。鹽脅迫或堿脅迫每天分別用100 mmol·L-1鹽或堿處理液澆灌1次(晚5∶00—6∶00)；對(duì)照組只澆Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。脅迫處理7 d。

1.3 取樣、植物細(xì)胞液的收集

處理7 d后，隨機(jī)選取5株植株在子葉節(jié)處分成地上部(Shoot)和根部(Root)2部分，依次用自來水、蒸餾水沖洗干凈，吸干表面水分。分別稱取莖葉和根鮮重(FW)，然后將其真空冷凍干燥，凍干，分別稱取干重(DW)，計(jì)算植株含水量(WC)及其生物量。另外5株植株分別用蒸餾水清洗1次，去離子水清洗2次，用濾紙將其表面多余水分吸干。將植株的全部葉片和根部剪下，采用離心法[10](2 500 g離心15 min，4℃)去除根、葉質(zhì)外體汁液后再去除其老根和葉的主脈，將植物材料分別裝入封口袋，排凈空氣后在-20℃冷凍24 h，在干燥器中解凍，分別用注射器收集根和葉的細(xì)胞汁液[11]，其汁液用于各種溶質(zhì)含量的測(cè)定。

1.4 生長(zhǎng)、生理指標(biāo)測(cè)定

生物量為每株植物干重(g)。含水量(WC)= (鮮重-干重)/鮮重×100%[12]。用離子色譜法測(cè)定無機(jī)陰離子、草酸(DX-300離子色譜系統(tǒng)，CDM-II電導(dǎo)檢測(cè)器，AS4A-SC離子交換色譜柱，流動(dòng)相為Na2CO3/NaHCO3=1.7/1.8 mmol·L-1)和其他有機(jī)酸含量(DX-300離子色譜系統(tǒng)，AMMS-ICE II消聲器，ICE-AS6離子排斥柱，流動(dòng)相為0.4 mmol·L-1全氟丁酸)[13]。以上色譜試驗(yàn)均在室溫25℃進(jìn)行。

K+和Na+含量用火焰光度計(jì)測(cè)定[12]。可溶性糖和脯氨酸含量分別采用蒽酮顯色法和茚三酮比色法測(cè)定[1]。之前壓榨擠出的根、葉的汁液(細(xì)胞液)用數(shù)字酸度計(jì)測(cè)定pH值(圖5)，根據(jù)其pH值用Geochem軟件計(jì)算各離子的游離電荷數(shù)量(meq·L-1組織水)，分別計(jì)算各種游離態(tài)離子所貢獻(xiàn)的正電荷或負(fù)電荷數(shù)量占總正或負(fù)電荷的百分比，即表示各種離子對(duì)離子平衡的貢獻(xiàn)率。

陽(陰)離子的電荷貢獻(xiàn)率計(jì)算公式：

陽(陰)離子的電荷貢獻(xiàn)率(%)=游離態(tài)陽(陰)離子所貢獻(xiàn)的正(負(fù))電荷/各種游離陽(陰)離子的正(負(fù))電荷的總和×100%。

溶質(zhì)滲透勢(shì)計(jì)算公式：

ΨS=-nRT/V，其中n表示溶質(zhì)摩爾濃度，R和T為常數(shù)。因此，本試驗(yàn)用某一溶質(zhì)的摩爾濃度(mmol·L-1組織水)占各種溶質(zhì)摩爾濃度的總和的百分比，表示此溶質(zhì)對(duì)滲透調(diào)節(jié)貢獻(xiàn)率[13]。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)整理和作圖采用Excel 2010；SPSS20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)水平為0.05；多重比較采用LSD法，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿脅迫對(duì)堿蓬幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖1A可知，鹽脅迫下堿蓬生物量有所降低，但未達(dá)到顯著水平，而堿脅迫下其生物量顯著下降(P<0.05)。由圖1B所示，對(duì)照(CK)堿蓬植株含水量達(dá)到90%以上，鹽脅迫對(duì)堿蓬含水量影響不顯著，在堿脅迫下其含水量有所降低，但仍保持較高的含水量(88.26%)。

圖1 鹽、堿脅迫對(duì)堿蓬生物量和含水量的影響

2.2 堿蓬根、葉的陽離子對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)

鹽、堿脅迫均會(huì)引起葉片、根部細(xì)胞液Na+含量的顯著增加(P<0.05)，其中鹽脅迫下葉片Na+含量極顯著增加(P<0.01)(圖2A)。

根部細(xì)胞液的K+含量在堿脅迫下略有下降；在鹽脅迫下，葉片細(xì)胞液K+含量顯著低于對(duì)照和堿脅迫組(P<0.01)(圖2B)。

由圖2C可見，與對(duì)照相比，根部細(xì)胞液的Na+/K+在鹽、堿脅迫下比值顯著升高(P<0.05)，而鹽、堿脅迫對(duì)其作用差別不大。葉片細(xì)胞液Na+/K+在鹽、堿脅迫下也顯著升高(P<0.05)，而堿脅迫下其比值低于鹽脅迫。

圖2 鹽、堿脅迫對(duì)堿蓬根和葉片中陽離子的影響

2.3 堿蓬根、葉的陰離子對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)

圖3 鹽、堿脅迫對(duì)堿蓬根和葉片中陰離子的影響

2.4 堿蓬根、葉的有機(jī)溶質(zhì)對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)

由圖4所示，葉片脯氨酸、可溶性糖、有機(jī)酸等有機(jī)溶質(zhì)明顯高于根部其含量，而且根部的有機(jī)溶質(zhì)含量在鹽、堿脅迫作用下，其含量幾乎不積累。在葉片中脯氨酸、可溶性糖、有機(jī)酸等有機(jī)溶質(zhì)含量在鹽、堿脅迫下均顯著增加(P<0.01)。但從葉片的最大積累量上看，脯氨酸積累量最少，有機(jī)酸最多(其最大積累量是脯氨酸的157.06倍)。

圖4 鹽、堿脅迫對(duì)堿蓬根和葉片中有機(jī)溶質(zhì)的影響

2.5 鹽、堿脅迫對(duì)根和葉片組織液pH的影響

由圖5可知，鹽堿脅迫下堿蓬根、葉片的細(xì)胞汁液pH都在正常生理pH范圍內(nèi)(pH<7)，鹽堿脅迫下堿蓬根部的細(xì)胞汁液pH的變化顯著(P<0.05)，而其葉片細(xì)胞汁液pH差異并不顯著。

圖5 鹽、堿脅迫下堿蓬根和葉片的細(xì)胞汁液pH值

2.6 各種溶質(zhì)對(duì)滲透調(diào)節(jié)的貢獻(xiàn)

由表1可知，對(duì)照K+在根和葉片的滲透調(diào)節(jié)占據(jù)主導(dǎo)地位。鹽、堿脅迫后Na+對(duì)滲透調(diào)節(jié)的貢獻(xiàn)率有所升高，但是K+的貢獻(xiàn)依然較高(僅次于Na+)；與鹽脅迫相比，堿脅迫下葉片的K+的貢獻(xiàn)率提高，而Na+的比例下降。根和葉片的有機(jī)酸對(duì)總有機(jī)溶質(zhì)的貢獻(xiàn)占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(84.76%～97.25%)，鹽、堿脅迫，特別是堿脅迫下有機(jī)酸的貢獻(xiàn)率達(dá)到最大(表1)，而脯氨酸對(duì)滲透調(diào)節(jié)的貢獻(xiàn)甚微(不足0.20%)。

表1 鹽堿脅迫下堿蓬根、葉細(xì)胞液中各溶質(zhì)對(duì)滲透調(diào)節(jié)貢獻(xiàn)率

2.7 陽(陰)離子對(duì)總正(負(fù))電荷的貢獻(xiàn)

對(duì)照植株根和葉片中K+對(duì)正電荷的貢獻(xiàn)率最大；鹽堿脅迫后，K+對(duì)正電荷的貢獻(xiàn)率降低，Na+達(dá)到最大(表2)，堿蓬根和葉片在堿脅迫下K+貢獻(xiàn)率均高于鹽脅迫，特別是葉片在堿脅迫下K+貢獻(xiàn)率(47.83%)高于鹽脅迫下(29.22%)。

表2 鹽、堿脅迫下堿蓬根、葉中各種游離態(tài)離子對(duì)總正(負(fù))電荷的貢獻(xiàn)率

3 討論與結(jié)論

3.1 鹽堿脅迫對(duì)堿蓬生長(zhǎng)的影響

生物量降低是植物生長(zhǎng)受到抑制的直接表現(xiàn)。本研究中，堿蓬只在堿脅迫下其生物量才顯著下降?？梢姡}脅迫對(duì)堿蓬生長(zhǎng)影響不大，而只有高pH的堿脅迫才抑制其生長(zhǎng)。說明堿蓬具有較強(qiáng)的抗鹽能力，同時(shí)也證實(shí)堿脅迫對(duì)植物具有更大的破壞性[14-15]。

植物通過降低含水量來降低細(xì)胞滲透勢(shì)是既迅速又經(jīng)濟(jì)的方式[14]。鹽脅迫對(duì)堿蓬含水量影響不大，堿脅迫下其含水量下降，但仍保持較高水平(88.26%)。堿蓬作為稀鹽植物，其植株高度的肉質(zhì)化可以最大限度地稀釋液泡中有害離子(Na+，Cl-)的濃度[16]。這也許是決定堿蓬抗鹽堿的關(guān)鍵生理特性之一。

3.2 鹽堿脅迫對(duì)堿蓬體內(nèi)離子積累的影響

鹽堿脅迫下，Na+毒害是影響植物生長(zhǎng)的主要原因之一。Na+區(qū)域化到液泡是減少細(xì)胞質(zhì)中過多Na+的有效方法之一[17]。Na+區(qū)域化主要依靠液泡膜Na+/H+逆向蛋白(Na+/H+antiporter protein,NHX)實(shí)現(xiàn)[18]。本試驗(yàn)鹽、堿脅迫引起堿蓬葉片和根部細(xì)胞液Na+激增，特別是鹽脅迫的葉片Na+含量達(dá)到最大值(其含量是對(duì)照的4.55倍)，而此時(shí)葉片的高濃度Na+并沒有影響堿蓬植株的生長(zhǎng)?？梢酝茰y(cè)堿蓬細(xì)胞內(nèi)可能存在著高效的NHX將Na+區(qū)域化到液泡，而其具體的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制還需進(jìn)一步探究。此外，堿蓬作為真鹽生植物，其肉質(zhì)化的葉片具有稀鹽作用。根從鹽堿土壤吸收的Na+等離子輸送至葉片，并將離子區(qū)域化于肉質(zhì)葉片的大液泡中，其較高含水量具有稀釋離子濃度的作用，以此保護(hù)胞質(zhì)內(nèi)酶類等活性物質(zhì)免受毒害，保證了植株的正常生理代謝。

植物體內(nèi)維持較低Na+/K+對(duì)其抵抗脅迫至關(guān)重要[19]。堿脅迫下葉片依然保持低Na+高K+，其Na+/K+比值低于鹽脅迫，而且低于根部比值。這可能是在堿脅迫下，堿蓬葉片具有更好的Na+/K+穩(wěn)態(tài)調(diào)控能力。

3.3 有機(jī)酸等溶質(zhì)的滲透調(diào)節(jié)、離子平衡作用

植物保持低Na+高K+是維持滲透調(diào)節(jié)的主要機(jī)制[20]。雖然鹽、堿脅迫Na+對(duì)滲透調(diào)節(jié)的貢獻(xiàn)變化大，但是K+的貢獻(xiàn)依然保持較高水平(僅次于Na+)，堿脅迫下葉片K+對(duì)滲透調(diào)節(jié)的貢獻(xiàn)提高，Na+的貢獻(xiàn)下降?？梢姡瑝A蓬對(duì)Na+和K+的吸收機(jī)制是獨(dú)特的[21]，這可能與其具有較強(qiáng)的抗鹽堿能力有關(guān)。

脯氨酸對(duì)滲透調(diào)節(jié)的貢獻(xiàn)很小，這與堿地膚(Kochiasieversiana)的情況一致[13]。而與鹽柳(Salixpsammophila)[22]、酸棗(Ziziphusjujubavar.spionsa)[23]等植物的報(bào)道不同，堿蓬體內(nèi)脯氨酸不是對(duì)滲透脅迫的簡(jiǎn)單反應(yīng)，它可能是由于鹽堿脅迫對(duì)其代謝的干擾或是其起到保護(hù)響應(yīng)的作用[20]。

鹽、堿脅迫下根和葉片的有機(jī)酸貢獻(xiàn)提高(僅次于Na+,K+)，特別是高pH的堿脅迫下葉片其貢獻(xiàn)率增加幅度更大?？梢?，有機(jī)酸的代謝與pH密切相關(guān)?？紤]到有機(jī)酸在細(xì)胞中的定位(存在液泡中)，可以認(rèn)為，鹽、堿脅迫下有機(jī)酸為根、葉片液泡中主要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物。而多數(shù)雙子葉鹽生植物主要吸收Na+，Cl-等無機(jī)離子進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)[13,24]，這可能是因?yàn)閴A脅迫(高pH)對(duì)無機(jī)陰離子的吸收有抑制作用[3]，堿蓬不得已選擇更為耗能的合成有機(jī)酸的方式進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，同時(shí)以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH。