羅銘欣, 劉鳳民, 陳紀言,3, 崔均濤, 張偉麗,3*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院農(nóng)業(yè)與生物學院， 廣東 廣州 510225; 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院教學科研基地管理中心， 廣東 廣州 510225;3.德慶仲愷農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新研究有限公司， 廣東 肇慶 526642; 4仲愷農(nóng)業(yè)工程學院園藝園林學院， 廣東 廣州 510225)

柱花草(Stylosanthesspp.)是一種熱帶豆科牧草，其莖葉產(chǎn)量大、營養(yǎng)價值高、適應性強、耐酸性土壤，具有固氮、改良土壤和涵養(yǎng)水土的作用，可用作綠肥作物、青飼料等[1-2]。柱花草起源于哥倫比亞和巴西，主要分布在南美洲，現(xiàn)已被推廣于我國的干熱河谷地區(qū)，成為我國熱帶草業(yè)的優(yōu)勢豆科牧草，并有“北有苜蓿，南有柱花草”之說[3-4]。

輻射誘變育種是利用理化因素(如X射線、γ射線等)在短時間內(nèi)撞擊生物體輻射其敏感部位發(fā)生電離而引起DNA結構的變化，進而使其產(chǎn)生新的突變體，用于輔助新品種的改良和培育[5-6]。分子標記技術可直接反映DNA分子水平的遺傳變異，能闡述植物間的遺傳關系，可為雜交育種中的親本選配提供理論依據(jù)。CDDP是基于DNA保守序列的分子標記技術，其PCR擴增產(chǎn)物可直接用瓊脂糖凝膠電泳進行分離，具有成本低、目標性強、穩(wěn)定性高等優(yōu)點[7]。SRAP是一種利用獨特的雙引物對開放閱讀框進行擴增的標記技術，具有測序簡便、有適度的吞吐比、高共顯性、適用于基因的定位等優(yōu)點[2,8]。傳統(tǒng)表型選擇可能會丟失一些表型較差個體所攜帶的優(yōu)良低頻基因，而分子標記則能有效地尋找和定位這些基因[9]。每種分子標記都有自身的長處和不足，采用不同分子標記技術得出的多態(tài)性結果也存在差異，所以本研究同時運用CDDP和SRAP標記對經(jīng)60Coγ射線輻射的17份柱花草M3代種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，以期更加準確地尋找和定位這些優(yōu)良基因。

目前，關于柱花草遺傳多樣性的研究多利用SRAP[2,10]，SSR[11]，SSR和SRAP[3,12]，RAPD[13-16]，AFLP[17]，RFLP[18]，RFLP和STS[19]，ISSR[4]等分子標記方法進行遺傳差異分析，但尚未見CDDP標記應用于柱花草的報道，且目前應用SRAP標記確定輻射變異后柱花草的遺傳多樣性分析較少，僅有劉鳳民等[20]和張偉麗等[21]利用SRAP分析輻照后柱花草M1代和M2代確定輻射后柱花草在分子水平的變異，經(jīng)輻照處理的種子會產(chǎn)生生物學效應，在M1代通常會出現(xiàn)形態(tài)畸變、生理損傷和DNA損傷等，而在M2代將確定優(yōu)秀變異植株作為目標株系，在M3代繼續(xù)觀察篩選出目標突變株。

本研究對60Coγ射線輻照后的M3代柱花草進行農(nóng)藝性狀統(tǒng)計，并采用CDDP和SRAP標記對17份M3代柱花草種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，這將有利于優(yōu)良柱花草種質(zhì)的發(fā)掘，并對分子標記輔助柱花草的輻射誘變育種工作具有一定的指導意義，為柱花草種質(zhì)資源的利用、親本選擇以及品種改良提供材料基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用柱花草品種為‘Nchp1’、‘熱研2號’(‘Reyan No.2’)、‘熱研13號’(‘Reyan No.13’)的種子，經(jīng)劑量為974Gy的60Coγ射線輻射誘變處理后種植[20]，連續(xù)2代對自然生長的植株通過株高、干重、花期、炭疽病的病害級數(shù)等主要指標的測定與分析進行篩選，選取出13份上述性狀優(yōu)良的單株，以及‘Nchp1’在自然生境下株型發(fā)生變異的Nchp401，加上3個未進行輻照的親本材料，共計17份柱花草種質(zhì)作為試驗材料(表1)，其中以‘Nchp1’，‘ReyanNo.2’為對照1，2。

表1 供試柱花草種質(zhì)資源信息

SRAP的正反引物是根據(jù)Li等[22]提出的原則構建引物，SRAP的正反引物一一相互配對組成80對SRAP引物，而CDDP引物則參照Collard和Mackill[23]公布的引物序列，CDDP引物和SRAP引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。

表2 CDDP和SRAP引物序列

1.2 試驗方法

1.2.1農(nóng)藝性狀的測定及統(tǒng)計分析 將篩選得到的17份M2代柱花草品系的種子浸泡于80℃的熱水中處理3～5 min，冷卻后再次浸泡于稀釋800倍的復方多菌靈(多硫) 溶液中消毒30 min，然后流水沖洗，在育種盤中播種，置于溫室大棚中，3個月后移栽到仲愷鐘村的農(nóng)場試驗基地，每份材料分別種植在農(nóng)場2個不同的區(qū)域，分為一區(qū)與二區(qū)，每個區(qū)域?qū)γ糠莶牧显O置3個重復，移栽5個月后測定柱花草材料的株高、冠徑、分支數(shù)、第一分支長、病害級數(shù)5個指標，而病害級數(shù)是對柱花草炭疽病的觀測，采用Chakraborty Sukumar提供的0～9級的標準對柱花草炭疽病進行統(tǒng)計[24]。分別記錄柱花草的開花期后，并于移栽后的7個月對其進行刈割，經(jīng)烘干后稱量單株的干重。試驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 22軟件進行分析。

1.2.2基因組DNA的提取與檢測 稱取健康新鮮的柱花草嫩葉0.2 g，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取17份柱花草的DNA，所得DNA濃度與純度用超微量分光光度計進行檢測與分析。

1.2.3CDDP-PCR和SRAP-PCR擴增反應體系的確定 通過單因子試驗對柱花草CDDP-PCR反應體系的模板DNA量、Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶量設置不同的梯度水平，在反應過程中上述5個因素逐一變動時保證其余反應條件不變，通過觀察擴增條帶的清晰度、特異性的豐富度來確定最佳的反應體系。用引物WRKY-R3B對樣品‘RY13fszh001’的DNA擴增，通過單因子試驗確定柱花草CDDP-PCR的反應體系為：反應總體積為20 μL，其中DNA模板75 ng、Taq DNA聚合酶1.5 U、10×Buffer(含Mg2+2.0 mmol·L-1)2.5 μL，0.6 mmol·L-1dNTPs 1.2 μL，0.3 μmol·L-1引物濃度1 μL，用ddH2O補足剩余體積。CDDP-PCR擴增程序：94℃預變性3 min；94℃變性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸2 min、循環(huán)35次；最后72℃延伸5 min；4℃保存。

SRAP-PCR的反應體系和擴增程序參考劉鳳民等[20]的方法。反應總體積為25 μL，其中DNA模板1 μL、5 U·μL-1Taq DNA聚合酶0.625 μL、10×Buffer(含Mg2+2.0 mmol·L-1)2.5 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL、10 μmol·L-1上下游引物濃度1 μL，用ddH2O補足剩余體積。SRAP-PCR擴增程序：94℃預變性4 min；94℃變性1 min、33℃退火1 min、72℃延伸10 s、循環(huán)5次；94℃變性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸10 s、循環(huán)30次；最后72℃延伸5 min；4℃保存。

1.2.4PCR產(chǎn)物分離 CDDP與SRAP標記PCR擴增產(chǎn)物分別采用濃度為1.5%與2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離檢測，使用Tanon 4100凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。用80對SRAP引物對17份柱花草種質(zhì)進行PCR擴增，電泳篩選出26對能擴增出清晰條帶、多態(tài)性高的引物。

1.2.5數(shù)據(jù)處理 人工分析電泳圖譜，在相同遷移位置上，有清晰可辨認的條帶記為“1”，無帶記為“0”，以此構建二元數(shù)據(jù)矩陣。

運用NTSYS-pc 2.1統(tǒng)計分析軟件計算樣品間的遺傳相似系數(shù)(GS)、遺傳距離(GD)，按照非加權配對算術平均法(UPGMA)對所有樣本作聚類分析。

2 結果與分析

2.1 17份柱花草農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計分析

17份柱花草的株高、冠徑、分枝數(shù)、第一分支長、病害級數(shù)、開花期、單株干重7個農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計結果見表3，其中‘RY13fszh001’株高最矮，顯著矮于‘Nchpfszh0020’，‘Nchpfszh0021’，‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfs1’，‘RY2fszh001’，‘Nchpfszh003’，‘Nchpfszh006’，‘Nchpfszh008’，‘Nchp401’(P<0.05)。冠徑最寬的種質(zhì)為‘Nchpfszh0020’，其次為‘Nchpfszh01102’。分支數(shù)最多的種質(zhì)是‘RY2fszh001’，其次是‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfszh004’和‘Nchpfszh0021’，再者是‘Nchpfszh003’和‘Nchpfszh0020’，只有‘RY2fszh001’顯著多于其余的11份種質(zhì)(P<0.05)。‘Nchpzh021’的第一分支長最短，和其余16份柱花草種質(zhì)差異顯著(P<0.05)。單株干重位列前六的種質(zhì)分別為‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfszh0020’，‘Nchpfs1’，‘RY2fszh001’，‘Nchpfszh017’，‘Nchp1’，均顯著重于余下的11份種質(zhì)?！甆chpfszh0020’，‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfs1’，‘Nchpfszh017’，‘RY2fszh001’這5個種質(zhì)的單株干重都高于對照1,2，而‘Nchpfszh0020’，‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfs1’，‘Nchpfszh017’的單株干重分別比其輻射親本Nchp1(對照1)高出93.0%，93.9%，76.9%，12.4%，‘RY2fszh001’的單株干重亦比其輻射親本‘Reyan No.2’(對照2)高出83.4%，每種農(nóng)藝性狀都出現(xiàn)好于親本或?qū)φ盏那闆r，呈現(xiàn)了經(jīng)輻射篩選后的多樣性和定向性。

炭疽病是柱花草最大的病害，對柱花草的產(chǎn)量危害極大，會導致柱花草頂芽病變和壞死。選育出病害級數(shù)小的柱花草種質(zhì)可以防治炭疽病，由表3可知，病害級數(shù)最小的種質(zhì)為‘Nchpfszh01102’和‘ReyanNo.13’，病害級數(shù)為0，說明‘Nchpfszh01102’和‘ReyanNo.13’有較強的炭疽病抗病性。17份柱花草種質(zhì)的開花期均集中在10—11月，其中花期最早的種質(zhì)為‘Nchpfs1’在10月10日即開花，‘Nchpfszh0020’緊跟其后在10月12日開花，‘Nchpfszh01102’，‘RY2fszh001’，‘Nchpfszh003’緊接著也在10月13日開花了，以上5份種質(zhì)的花期均早于其輻射親本，輻射后代的花期提前可以讓種植在廣東的柱花草有效地避開寒潮的到來，避免被凍傷甚至影響正常的結籽。

表3 柱花草M3代各種質(zhì)的農(nóng)藝性狀

2.2 17份柱花草基因組DNA純度及濃度檢測

超微量分光光度計的測量結果顯示17份柱花草基因組DNA的A260/A280穩(wěn)定在1.74～1.81之間，而A260/A280在1.80左右則顯示DNA較純，沒有被降解或被RNA、多糖、蛋白質(zhì)、酚等污染，也沒有其他小分子雜質(zhì)的殘留，DNA的濃度在64.86～142.76 ng·μL-1之間，測量數(shù)據(jù)表明提出來的柱花草基因組DNA純度高、質(zhì)量穩(wěn)定能滿足分子標記分析的要求。

2.3 柱花草種質(zhì)多態(tài)性分析

2.3.1CDDP標記多態(tài)性分析 如表4所示，通過CDDP的17條引物對17份柱花草種質(zhì)進行擴增檢測到的條帶有92條，平均每條引物擴增出5.4條帶，多態(tài)性條帶數(shù)為66條，多態(tài)性比率高達71.7%，其中特異性條帶數(shù)為13條，特異性比率為14.1%。其中WRKY-R3與WRKY-R3B擴增條帶數(shù)最多，均為8條，KNOX-2的擴增條帶數(shù)目最少，只有3條，其多態(tài)性條帶數(shù)也是最少，僅擴增出1條，而WRKY-R1的特異性條帶最多，達到了3條。另外，多態(tài)性比率達100%的引物有WRKY-R3,MADS-2,ABP1-3。引物WRKY-R1對17份柱花草的擴增結果見圖1。

圖1 引物WRKY-R1對17份柱花草種質(zhì)的PCR擴增結果

2.3.2SRAP標記多態(tài)性分析 從80對SRAP引物中篩選出26對擴增效果較好的引物組合對17份柱花草種質(zhì)進行擴增，如表4所示，共擴增出177條帶，平均每對引物擴增出6.8條帶；多態(tài)性條帶有111條，多態(tài)性比率為62.7%；特異性條帶共計29條，特異性比率為16.4%。其中引物組合ME7EM4擴增出的條帶數(shù)目最多，達12條，而引物組合ME7EM1僅擴增出3條帶。ME7EM4，ME8EM2與ME8EM5擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)最多，均為7條，而ME3EM3，ME7EM1和ME7EM6擴增出的多態(tài)性條帶最少，只有2條。ME2EM2，ME6EM4和ME8EM2擴增出多態(tài)性條帶比率最高，均達到100%，而ME2EM8，ME4EM4擴增出多態(tài)性條帶比率最低，均為45.5%。引物組合ME7EM4對17份柱花草的擴增結果如圖2所示。

圖2 引物組合ME7EM4對17份柱花草種質(zhì)的PCR擴增結果

2.3.3CDDP和SRAP標記系統(tǒng)的多態(tài)性比較 如表4所示，從引物覆蓋的條帶來看，SRAP的平均覆蓋條帶數(shù)(6.8條)高于CDDP(5.4條)，且SRAP的特異性比率(16.4%)也高于CDDP(14.1%)，而CDDP的多態(tài)性比率(71.7%)高于SRAP(62.7%)(表4)，兩種分子標記均能擴增出較為豐富的多態(tài)性條帶，說明篩選出的CDDP引物和SRAP引物適用于柱花草的種質(zhì)鑒定。

表4 17份柱花草種質(zhì)遺傳多樣性分析

2.4 基于CDDP和SRAP標記分析結果下柱花草的遺傳相似性

CDDP擴增結果如表5所示，樣本間遺傳相似系數(shù)在0.54～0.90之間，平均遺傳相似系數(shù)(GS)為0.76，平均遺傳距離(GD)為0.24。最大遺傳相似數(shù)0.90出現(xiàn)在‘Nchpfszh006’和‘RY2fszh001’之間，說明二者的親緣關系較近，最小遺傳相似系數(shù)0.54出現(xiàn)在‘Nchpfs1’和‘Nchpzh021’之間，表明兩者的親緣關系最遠。

表5 基于CDDP分子標記柱花草的遺傳相似系數(shù)

SRAP擴增結果如表6所示，樣本間遺傳相似系數(shù)范圍是0.60～0.94，說明17份柱花草種內(nèi)有較大的遺傳分化，平均遺傳相似系數(shù)(GS)為0.79，平均遺傳距離(GD)為0.21。‘Nchp401’與‘Nchpfszh017’，‘Nchp401’與‘Nchpfszh004’的遺傳相似系數(shù)均為0.60最小，說明‘Nchp401’和兩者的遺傳距離相近；‘ReyanNo.13’和‘ReyanNo.2’的遺傳相似系數(shù)最大，為0.94，說明兩者的親緣關系最近，兩者之間可能擁有更多相同的基因組類型。

表6 基于SRAP分子標記柱花草的遺傳相似系數(shù)

2.5 基于CDDP標記和SRAP標記聯(lián)合的柱花草聚類分析

由圖3所示，聚類分析顯示輻射后的M3代柱花草與親本產(chǎn)生了一定的變異。系數(shù)在0.71時，將17份柱花草種質(zhì)分為2類，其中株型特殊、自然逆境突變的‘Nchp401’單獨聚為類群I，剩余16份柱花草種質(zhì)聚為類群II。在系數(shù)為0.82時又被分為7小類，‘Nchpfszh0020’和‘Nchpfszh0021’聚為一類，其株高、冠徑、分支數(shù)、第一分支長、病害級數(shù)均沒有顯著差異；而未經(jīng)過輻射的‘Reyan No.2’與‘Reyan No.13’緊密聚為一類，兩者的花期較晚，在試驗的17份柱花草中僅此2份品種是11月初才開花的；病害級數(shù)沒有顯著差異的‘Nchpzh021’和‘Nchpfszh01102’聚為一類，其與農(nóng)藝性狀中沒有顯著差異的另一聚類‘Nchpfszh017’和‘Nchpfszh004’聚為一大類；輻射親本‘Nchp1’與其輻射后代‘Nchpfszh003’，‘Nchpfszh006’聚為一類，很好的反映了輻照親本與輻照后代的親緣關系，而農(nóng)藝性狀沒有顯著差異的‘Nchp1’和‘Nchpfszh006’又緊密聚類；‘RY2fszh001’，‘RY2fszh002’，‘Nchpfszh008’，‘RY13fszh001’聚為一類，其中‘RY2fszh001’和‘RY2fszh002’的輻射親本相同聚在一起，而除了開花期與株高有差別以外，其他農(nóng)藝性狀均沒有顯著差異的‘Nchpfszh008’和‘RY13fszh001’也聚在一起；‘Nchp401’和‘Nchpfs1’的單獨聚類說明自然逆境和60Coγ射線輻射均能引起種質(zhì)一定程度的遺傳變異。

圖3 基于CDDP標記和SRAP標記聯(lián)合的柱花草聚類分析

3 討論

種質(zhì)資源的遺傳多樣性是作物育種能夠取得突破性結果的關鍵[25]。遺傳多樣性是遺傳育種的基因源泉，是一個物種是否能適應環(huán)境變化的決定因素。柱花草是自花授粉植物，雜交育種較難，育種主要依靠人工手段，而利用60Coγ射線輻射柱花草的種子育種，能夠誘導柱花草產(chǎn)生變異，可減輕育種的工作量與年限。分子標記是輔助育種的重要工具，CDDP標記是一種目的基因標記技術，其操作簡單，其引物來自轉(zhuǎn)錄因子基因家族，能涉及到抗病、發(fā)育、代謝等性狀。SRAP技術操作簡單、高效、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高，不需閾預知物種的序列信息，在許多植物中都可以利用，這使得SRAP技術在遺傳多樣性分析品種鑒定，指紋圖譜構建等多個領域得以應用。丁澤婷等[12]利用SSR和SRAP對20份柱花草品種進行重要性狀的關聯(lián)分析。任羽等[26]利用SRAP分子標記對60Coy射線處理后的石解蘭組培苗進行分析，認為SRAP分子標記能有效地揭示誘變材料的遺傳多樣性。本研究首次利用CDDP分子標記分析柱花草輻射M3代的遺傳多樣性，能將其很好的區(qū)分開。CDDP和SRAP引物對17份柱花草種質(zhì)擴增的多態(tài)性比率分別為71.7%和62.7%，表明經(jīng)過60Coγ射線輻射后17份柱花草種質(zhì)間存在豐富的遺傳變異，兩種分子標記的遺傳相似系數(shù)各為0.76和0.79，說明輻射處理對柱花草材料存在誘變作用，蔣昌順等[12]的多樣性水平低于本研究的多態(tài)性水平，考慮是種質(zhì)、引物的不同所引起的，也說明了CDDP和SRAP分子標記技術在柱花草屬植物遺傳多樣性研究中有較高的檢出效率，是鑒定柱花草種質(zhì)和研究遺傳多樣性的理想方法。白昌軍等[15]采用太空誘變的方式對‘熱研2號’柱花草進行誘變后利用RAPD分子標記技術進行遺傳性分析，其多態(tài)性比率68.8%低于本研究CDDP的多態(tài)性比率為71.7%，說明經(jīng)過60Coγ射線輻射處理后的柱花草增大了變異率，提供了更寬的遺傳篩選范圍，經(jīng)過3年的單株選擇篩選出的柱花草M3代已發(fā)生了不同程度的變異，產(chǎn)生了許多比親本優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，如炭疽病病害級數(shù)小和花期提前的柱花草種質(zhì)，這些變異材料的選擇豐富了柱花草種質(zhì)的基因類型，極有可能從中開發(fā)出比親本更優(yōu)良的柱花草種質(zhì)，有望為高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的柱花草品種選育提供新種質(zhì)。

CDDP-PCR反應體系中成分濃度變化會影響擴增結果[27]，因此本試驗優(yōu)化了柱花草CDDP-PCR反應體系，為今后運用CDDP標記開展柱花草遺傳多樣性、雜交育種等方面的相關研究提供了依據(jù)。SRAP引物一般采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，但本試驗中用瓊脂糖凝膠即可取得較好的分離效果，說明對于柱花草材料，SRAP分子標記可以采用瓊脂糖凝膠電泳的方法進行分離。聚類分析是種質(zhì)資源表型多樣性研究中較為普遍有效的分析方法[28]，在進行分析的時候為了得到更準確的聚類結果，用不同分子標記聯(lián)合對親緣關系進行評價能有效減少單一標記造成的誤差。應用CDDP和SRAP標記聚類分析結果可知，柱花草的親緣關系與農(nóng)藝性狀有一定的相關性，農(nóng)藝性狀相似的更容易緊密的聚類，分類結果與農(nóng)藝性狀統(tǒng)計結果較一致，聯(lián)合兩種標記方法能準確地分析輻射后柱花草的親緣關系，對后續(xù)的育種和利用提供一定的參考價值。

4 結論

本研究利用60Coγ射線對柱花草種子進行輻射誘變，并運用CDDP和SRAP分子標記快速有效地對17份柱花草進行遺傳多樣性分析，經(jīng)60Coγ射線輻射誘變后的M3代柱花草與其輻射親本以及在自然逆境下突變的‘Nchp401’之間存在豐富的遺傳差異，本研究從分子水平上對其進行遺傳變異分析，明確其遺傳距離，從分子水平上反映了輻射后代的變異性和差異性。結合其農(nóng)藝性狀進行選育，系數(shù)在0.71時，將17份柱花草種質(zhì)分為2類，其中自然逆境突變的‘Nchp401’單獨聚為類群I，剩余16個柱花草品種聚為類群II，其中類群II在系數(shù)為0.82時又被分為6小類，各小類群間農(nóng)藝性狀關系密切，因此在實際應用中可根據(jù)育種目標選擇相應的親本材料。本研究為柱花草輻射效應評價提供了分子依據(jù)，為柱花草的分子標記輔助輻照選育積累經(jīng)驗。