王譚國(guó)艷， 馬志遠(yuǎn)， 李沛洋， 郭俊宏， 張嘉懿， 蔣勝競(jìng)*

(1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)與科技學(xué)院， 甘肅 蘭州 730020； 2. 北京大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院， 北京 100871)

自工業(yè)革命以來(lái)，由于化石燃料的過(guò)多使用和人類活動(dòng)的增加，全球氣溫正不斷升高[1]。以全球氣溫升高為主要特征的氣候變化問(wèn)題正改變著陸地生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，影響人類的生存和健康[2-3]。青藏高原作為地球上海拔最高和面積最大的高原對(duì)氣候變化尤為敏感[4]。近些年，許多研究證實(shí)了氣候變暖不僅會(huì)改變植物物候[5]及群落組成[6]，對(duì)土壤微生物的多樣性及功能同樣也具有重要影響[7-8]。然而，關(guān)于土壤微生物的重要類群之一的叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizae，AM)真菌如何響應(yīng)氣候變暖的研究相對(duì)較少。

叢枝菌根真菌隸屬于球囊菌門(Glomeromycota)，在自然界中廣泛分布，可以與陸地生態(tài)系統(tǒng)中80%以上的高等植物建立共生體系，形成菌根結(jié)構(gòu)[9]。在菌根共生體中，AM真菌不僅能夠促進(jìn)植物對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)(磷素和氮素等)的吸收、增強(qiáng)植物抗逆抗病等生理作用[10]，還會(huì)影響植物的群落組成[11-13]。此外，菌根真菌還能夠影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[14],穩(wěn)定土壤結(jié)構(gòu)[15]，促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)[16]。AM真菌有重要的生理生態(tài)功能，但目前對(duì)AM真菌如何響應(yīng)氣候變暖還沒(méi)有一致的結(jié)論。

AM真菌的生長(zhǎng)只能在一定的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行并且具有最適的生長(zhǎng)溫度，因此溫度上的任何變化都會(huì)直接影響AM真菌。例如，Heinemeyer等在2004年曾發(fā)現(xiàn)溫度升高可以促進(jìn)AM真菌根外菌絲的生長(zhǎng)[17]。此外，因AM真菌對(duì)宿主植物或土壤環(huán)境具有一定的選擇性[18-20]，所以氣候變暖也可以通過(guò)改變植物群落結(jié)構(gòu)或土壤性質(zhì)從而影響AM真菌[21-22]。近些年，學(xué)者在青藏高原針對(duì)AM真菌對(duì)氣候變暖的響應(yīng)做了大量研究[23-26]。如Jiang等[24]和Wei等[26]發(fā)現(xiàn)，AM真菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)并不受溫度升高的顯著影響，而Shi等卻發(fā)現(xiàn)模擬增溫降低了AM真菌的多樣性，但對(duì)AM真菌的群落組成沒(méi)有顯著影響[25]，這一結(jié)果與Yang等在2013年的研究結(jié)果相反，他們發(fā)現(xiàn)模擬增溫雖然對(duì)AM真菌的多樣性沒(méi)有顯著影響，卻顯著影響了AM真菌的群落組成[23]。作為專性共生菌，AM真菌的群落組成與植物群落特征密切相關(guān)，不同的植物群落組成可能影響了AM真菌對(duì)模擬增溫的響應(yīng)。因此，在植物物種水平上探究AM真菌對(duì)模擬增溫的響應(yīng)，繼而得出普遍性規(guī)律對(duì)AM真菌的研究至關(guān)重要。

近些年由于高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)AM真菌的研究大多集中于土壤或根系的分子學(xué)研究，對(duì)以AM真菌孢子形態(tài)鑒定為主的報(bào)道相應(yīng)減少。然而，AM真菌孢子作為重要的繁殖體，無(wú)論在AM真菌種群生長(zhǎng)或是群落構(gòu)建中都具有重要作用。此外，形態(tài)鑒定的方法較分子鑒定方法具有更好的直觀性，這一方法避免了因核酸提取及PCR反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的誤差，因此對(duì)探究氣候變暖對(duì)AM真菌孢子的影響仍具有重要意義。本試驗(yàn)借助野外模擬增溫平臺(tái)，以盆栽的單物種植物為研究對(duì)象，通過(guò)探究模擬增溫對(duì)不同植物根際土壤AM孢子組成的影響，旨在探討不同植物根系A(chǔ)M真菌孢子的分布模式及差異以及在植物物種水平上AM真菌如何響應(yīng)模擬增溫。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)概況

本項(xiàng)目在中國(guó)科學(xué)院海北高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)定位研究站(北緯37°37′，東經(jīng)101°19′，海拔3 200 m)進(jìn)行。該研究站地處青藏高原東北隅祁連山區(qū)門源縣境內(nèi)。該地氣候類型屬于高原大陸性氣候，具有典型的高原寒溫濕潤(rùn)性氣候特征。海北站所在地區(qū)主要的土壤類型包括高山草甸土、高山灌叢草甸土和沼澤土主要為草氈寒凍雛形土(高山草甸土)[27]，土壤中有機(jī)質(zhì)貯量豐富，氮、磷絕大部分以有機(jī)態(tài)形式存在，礦化作用較弱[28]。該地區(qū)為典型的以嵩草屬植物為建群種的高寒嵩草草甸[29]，主要物種有矮嵩草(Kobresiahumilis)，羊茅(Festucaovina)，垂穗披堿草(Elymusnutans)等[30]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究于2016年7月份原位選取高寒草甸常見的15種植物(表1)幼苗進(jìn)行室外移栽試驗(yàn)，每盆4株幼苗，所選植株幼苗長(zhǎng)勢(shì)相近且無(wú)明顯的病蟲害?；ㄅ柚睆綖?0 cm，埋入地下深度為60 cm，培養(yǎng)基質(zhì)采用原位土與沙子按2∶1比例混合。本試驗(yàn)采取的增溫方式為紅外燈管(220 V，長(zhǎng)1 m，寬2.2 cm)加熱，燈管距地面距離1.2 m，增溫幅度約為2℃；對(duì)照組僅設(shè)置同等規(guī)格的燈罩。每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)，共計(jì)180個(gè)樣品。

表1 本研究所選取的植物物種

1.3 樣品采集

經(jīng)過(guò)連續(xù)兩年的增溫試驗(yàn)后，于2018年8月底進(jìn)行破壞性采樣，采集花盆內(nèi)的根際土壤樣品，自然風(fēng)干后進(jìn)行AM真菌孢子的分離、計(jì)數(shù)與鑒定。AM真菌孢子的分離采用濕篩傾析-蔗糖離心法[31]并稍作修改，具體操作如下：稱取25 g風(fēng)干土壤于1 L的鋼制燒杯中，加入1 000 mL的自來(lái)水，用玻璃棒快速攪拌，使得底部的土壤全部懸浮。靜置3分鐘后再次攪拌，如此反復(fù)3～4次，使得土壤的團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)破碎，孢子全部釋放到水中。最后攪拌使土壤顆粒懸浮后靜置約7秒后將渾濁液迅速傾倒至兩層篩網(wǎng)(上層孔徑為200 μm，下層孔徑為38 μm)過(guò)濾，將下層網(wǎng)篩上的過(guò)濾物轉(zhuǎn)移到100 mL離心管中，3 000 r·min-1離心3 min后棄上清，加入50%(m/v)蔗糖溶液充分震蕩后3 000 r·min-1離心7 s，此時(shí)AM孢子懸浮于蔗糖溶液層，而絕大部分泥沙沉在底部。將上層蔗糖溶液倒入孔徑38 μm篩網(wǎng)的一側(cè)，用自來(lái)水小心沖洗后將篩子上的孢子泥沙混合物快速的抽到濾紙上(直徑7 cm)，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，體視鏡下用鑷子小心將孢子挑取到一張新的做好標(biāo)記的濾紙上。分離出的孢子樣品放在4℃冰箱中(保持濕潤(rùn))保存用于后續(xù)的試驗(yàn)。

1.4 AM真菌孢子的形態(tài)鑒定

將分離好的孢子取出，在體視鏡下通過(guò)觀察其顏色、大小、形狀、有無(wú)連孢菌絲等特征將所有孢子做初步的聚類、拍照、計(jì)數(shù)。取載玻片，滴一滴Melzer-PVLG染液，用鑷子將初步聚類的各組的孢子全部夾到染液中，用蓋玻片蓋上，大拇指輕輕按壓，使盡可能多的孢子破壁以保證染液充分的進(jìn)入孢內(nèi)，使染色充分。在染液未干之前，在體視鏡下拍照記錄。觀察孢子壁的層數(shù)、顏色、連孢菌絲的特征，通過(guò)與最新的分類信息(http://www.zor.zut.edu.pl/)比較，進(jìn)一步將初步聚類的孢子進(jìn)行物種鑒定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行匯總整理，并用R語(yǔ)言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)在分析前都進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)不符合整體分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)g轉(zhuǎn)化。AM真菌孢子組成根據(jù)每個(gè)孢子類型的數(shù)量進(jìn)行相應(yīng)計(jì)算。采用雙因素方差分析檢驗(yàn)?zāi)M增溫與不同植物對(duì)AM真菌孢子多樣性的影響，不同處理間的顯著性差異分析使用Post Hoc Test(Tukey法)在95%置信水平上進(jìn)行檢驗(yàn)?；贐ray-Curtis距離，對(duì)AM真菌的孢子群落進(jìn)行主成分分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)，使用“vegan”程序包中的“adonis”函數(shù)(PERMANOVA)檢驗(yàn)?zāi)M增溫與植物物種對(duì)AM真菌孢子組成的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌孢子的形態(tài)鑒定

本研究共分離獲得1 489個(gè)AM真菌孢子，按形態(tài)特征的不同可分成17種AM真菌形態(tài)種(圖1)。這17個(gè)種分別屬于8個(gè)屬，其中球囊霉屬(Glomus)6種，無(wú)梗囊霉屬(Acaulospora)2種，巨囊霉屬(Gigaspora)1種，盾巨囊霉屬(Scutellospora)3種，平囊霉屬(Pacispora)2種，內(nèi)生囊霉屬(Intraspora)1種，內(nèi)養(yǎng)囊霉屬(Entrophospira)1種和雙孢囊霉屬(Ambispora)1種。在數(shù)量方面，金黃球囊霉(Glomusaureum)的孢子數(shù)量最多(288個(gè))，其次為Glomuscaesaris和淺窩無(wú)梗囊霉(Acaulosporalacunosa)，孢子數(shù)量分別為249個(gè)和170個(gè)。

圖1 不同植物根際AM真菌種類

2.2 模擬增溫及植物物種對(duì)AM真菌孢子的影響

模擬增溫處理后，AM真菌孢子的豐富度并沒(méi)有顯著變化(圖2)，但模擬增溫顯著降低了AM真菌孢子的密度(P<0.05)。AM真菌孢子豐富度及孢子密度在不同宿主植物物種間差異顯著(P<0.05)。如圖3所示，珠芽蓼根系A(chǔ)M真菌孢子的豐富度顯著高于甘肅棘豆、線葉龍膽、麻花艽和金露梅根系A(chǔ)M真菌的孢子豐富度(圖3)。此外，植物物種及增溫處理的交互作用對(duì)AM真菌的孢子豐富度和密度均沒(méi)有顯著影響。在所調(diào)查的15種植物中，矮嵩草(F=13.71，P=0.004)和線葉龍膽(F=12.46，P=0.005)兩個(gè)植物物種根際的AM真菌孢子密度在模擬增溫后均顯著降低(P<0.05)；但AM真菌的孢子豐富度在不同物種中都沒(méi)有顯著變化。

圖2 AM真菌孢子豐富度(a)及密度(b)在不同處理間的差異

AM真菌孢子組成的PCoA分析和PERMANOVA結(jié)果表明：增溫處理(F=1.26，R2=0.007，P=0.26)、植物物種(F=0.99，R2=0.08，P=0.52)及二者的交互作用(F=0.82，R2=0.07，P=0.90)均對(duì)AM真菌孢子組成無(wú)顯著性影響(圖4)。此外，在不同植物物種水平上，模擬增溫同樣也沒(méi)有引起AM真菌孢子組成的顯著變化。另一方面，本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AM真菌的孢子組成在不同植物物種間并沒(méi)有顯著性的差異(圖5a)，但在不同植物科之間差異顯著(F=2.02，R2=0.14，P=0.001，圖5b)。

圖4 不同處理下植物根際AM真菌孢子的PCoA分析

圖5 不同宿主植物在物種(a)和科(b)水平上根際AM真菌孢子的群落組成

3 討論

本研究在植物物種水平上探究了短期增溫對(duì)根際AM真菌孢子組成的影響，研究結(jié)果將豐富我們對(duì)青藏高原AM真菌孢子多樣性及其響應(yīng)全球變暖的認(rèn)識(shí)。研究結(jié)果共鑒定出17種AM真菌，分屬8個(gè)屬，孢子群落與青藏高原其他的研究結(jié)果類似。Gai等分別在莎草科植物的根際土壤和3種不同類型草地的根際土壤中檢測(cè)出26[32]和23[33]種AM真菌。這些研究結(jié)果暗示了青藏高原這一環(huán)境獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)中具有較為豐富的AM真菌多樣性。此外，我們發(fā)現(xiàn)美麗盾巨孢囊霉(Scutellosporacalospora)在這3個(gè)研究中均普遍存在，說(shuō)明其可能是青藏高原的廣布種。

溫度升高往往可以增加植物根系的生物量[34]，促進(jìn)植物分配給AM真菌更多的光合產(chǎn)物[35]，所以增溫一般認(rèn)為會(huì)對(duì)AM真菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生促進(jìn)作用。然而本研究結(jié)果表明，在青藏高原高海拔地區(qū)，短期增溫并不會(huì)增加AM真菌的孢子多樣性，甚至還會(huì)降低AM真菌的孢子密度。依托分子鑒定技術(shù)的許多報(bào)道也證明模擬增溫對(duì)植物根系內(nèi)[24]或土壤中[26]的AM真菌多樣性沒(méi)有顯著性影響。Hiiesalu等在2014年指出，AM真菌的多樣性與植物的多樣性呈正相關(guān)關(guān)系[36]，而本研究采用的是單植物物種的盆栽試驗(yàn)，植物物種的單一可能是AM真菌多樣性較為穩(wěn)定的原因。此外，有研究表明模擬增溫并不會(huì)顯著改變青藏高原植物的根系生物量或根冠比[37-38]，因此，穩(wěn)定的AM真菌多樣性也可能與植物對(duì)短期增溫的不敏感相關(guān)。另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)模擬增溫會(huì)降低植物根際AM真菌的孢子數(shù)量，這與Yang等在2013年的試驗(yàn)結(jié)果并不一致，其研究表明4年的模擬增溫并不會(huì)影響AM真菌的孢子密度[23]，這可能是由于植物物種組成的差異造成的，Yang等的試驗(yàn)是以自然草地為研究對(duì)象，而本研究則是以單物種的盆栽為研究對(duì)象。在植物物種水平上，本研究發(fā)現(xiàn)只有在矮嵩草和線葉龍膽兩個(gè)物種水平上，模擬增溫才顯著降低AM真菌的孢子密度。這種植物物種間的差異或許與不同植物的生理特性相關(guān)，未來(lái)的研究需進(jìn)一步探討其具體的內(nèi)在機(jī)理。在AM真菌物種水平上，本研究中AM真菌孢子密度的降低主要是由盾巨孢囊霉真菌孢子的豐度降低引起。王淼焱等在之前的研究中表明，盾巨孢囊霉真菌多分布于沿海等較為濕潤(rùn)的生態(tài)系統(tǒng)[39]，由增溫所引起的土壤含水量降低可能不利于盾巨孢囊霉真菌的生長(zhǎng)。

AM真菌群落組成受氣候變化的影響在青藏高原生態(tài)系統(tǒng)中已被多次報(bào)道[23-26]。在本研究中，AM真菌群落結(jié)構(gòu)并不受模擬增溫的影響。一般認(rèn)為，AM真菌的群落結(jié)構(gòu)受宿主植物和土壤性質(zhì)共同影響，在本研究中，穩(wěn)定的植物生物量一定程度上解釋了AM真菌群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)宿主植物在科水平上對(duì)AM真菌孢子組成具有顯著影響，但在植物物種水平上沒(méi)有顯著影響。AM真菌的宿主特異性已有較多報(bào)道[18-19]，而本研究表明，植物科的信息可以更精確地預(yù)測(cè)根際AM真菌的孢子組成。這一研究結(jié)果與石國(guó)璽等人的發(fā)現(xiàn)相吻合，其研究發(fā)現(xiàn)AM真菌侵染率在親緣關(guān)系近的植物物種內(nèi)并無(wú)差異，而在不同植物科之間存在顯著差異[40]。這些研究結(jié)果支持Reinhart等的已有研究成果，表明目前已知的親緣關(guān)系并不能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)植物與AM真菌間的共生關(guān)系[41]，這可能與植物在科水平上的生態(tài)位分化與AM真菌的共生具有更強(qiáng)的相關(guān)性有關(guān)。

現(xiàn)有研究表明：土壤中AM真菌的孢子一直處于產(chǎn)生和萌發(fā)的動(dòng)態(tài)過(guò)程中[42]，本研究對(duì)AM真菌的孢子采集處于植物生長(zhǎng)季末期，雖然具有一定的代表性，但還需進(jìn)一步在更多采樣時(shí)間段進(jìn)行相關(guān)研究，以期能夠獲取對(duì)AM真菌響應(yīng)氣候變暖的全面認(rèn)識(shí)。此外，AM真菌雖然廣泛分布于土壤中，但卻具有不同的產(chǎn)孢能力，如無(wú)梗囊霉科和球囊霉科的AM真菌一般認(rèn)為具有較強(qiáng)的產(chǎn)孢能力[43-44]。因此，以孢子形態(tài)鑒定為手段的方法未必能全面反映AM真菌對(duì)氣候變暖的響應(yīng)，未來(lái)研究需結(jié)合高通量測(cè)序等分子技術(shù)展開深入研究。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究結(jié)果表明，青藏高原不同宿主植物根際的AM真菌孢子組成在植物科水平上存在顯著差異，模擬增溫雖然對(duì)AM真菌孢子的多樣性無(wú)顯著影響，卻顯著降低了AM真菌的孢子密度，不利于特定AM真菌物種的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果系統(tǒng)分析了不同植物物種水平上AM真菌對(duì)模擬增溫的響應(yīng)，暗示了植物群落組成在影響AM真菌響應(yīng)氣候變暖中的重要性，為探究氣候變暖下AM真菌的空間分布格局提供了生態(tài)依據(jù)。