梁小玉, 季 楊, 胡遠(yuǎn)彬, 易 軍, 白史且, 張 靚, 張新全

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院， 四川 成都 610066； 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 四川 成都 611130；3. 四川省林業(yè)和草原局， 四川 成都 610082)

菊苣(Cichoriumintybus)為菊科多年生宿根草本植物，在畜牧業(yè)、食品業(yè)、醫(yī)藥業(yè)以及工業(yè)上廣泛應(yīng)用，是當(dāng)今世界上極具潛力的經(jīng)濟(jì)作物之一。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)菊苣的研究熱點(diǎn)集中在繁育、品種培育、食品營(yíng)養(yǎng)、化學(xué)成分、藥理以及牧草等方面[1]，種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與新品種選育對(duì)開(kāi)發(fā)利用菊苣資源越來(lái)越重要。但是，缺乏相關(guān)菊苣基因組信息，使我們對(duì)其遺傳信息了解較少，目前所使用的相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence related amplified polymorphism，SRAP)，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)等分子標(biāo)記也難以滿足種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、后代精準(zhǔn)鑒定輔助育種等工作的需要，在一定程度上限制了菊苣種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用。因此，大量開(kāi)發(fā)新的分子標(biāo)記對(duì)于菊苣種質(zhì)資源輔助育種具有重要的意義。

SSR標(biāo)記具有共顯性遺傳、多態(tài)性高、易檢測(cè)、特異性好、通用性高及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前動(dòng)、植物遺傳育種中應(yīng)用最多的一種分子標(biāo)記[2-5]，SSR按來(lái)源可分為基因組SSR和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR (EST-SSR)。EST-SSR具有基因組SSR的特征，能夠直接獲得基因表達(dá)的信息，為功能基因提供“絕對(duì)”的標(biāo)記，其多態(tài)性可能與基因功能直接相關(guān)[6-9]，在近緣物種甚至遠(yuǎn)緣物種間通用性更好，且開(kāi)發(fā)成本較低[10-13]。本研究基于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National center for biotechnology information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)公布的菊苣EST序列分析其所含微衛(wèi)星重復(fù)序列的組成和特征，開(kāi)發(fā)菊苣EST-SSR引物，并驗(yàn)證菊苣EST-SSR引物有效性及其在萵苣屬(LactucaL.)和苦荬菜屬(IxerisCass.)中的通用性，以期為菊苣及其近緣屬種的親緣關(guān)系鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化、遺傳變異、遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因鑒定與克隆等研究提供重要的工具和有價(jià)值的信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料與DNA提取

引物有效性驗(yàn)證采用的是來(lái)源于美國(guó)國(guó)家基因庫(kù)的5份菊苣材料，來(lái)源及形態(tài)差異均較大，通用性評(píng)價(jià)采用的是31 份萵苣亞族(LactucinaeLess.)材料，其中，7份苦荬菜屬和1份萵苣屬材料(序號(hào)20)來(lái)源于中國(guó)國(guó)家牧草種質(zhì)基因庫(kù)，其余23份萵苣屬材料來(lái)源于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)系(見(jiàn)表1)。5～6葉期時(shí)，每份種質(zhì)選擇表型一致的20 個(gè)單株的幼嫩葉片等量混合成100 mg，采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根，北京)提取DNA(每份材料3個(gè)重復(fù))。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度，合格的DNA稀釋成10 ng·μL-1置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試材料來(lái)源

1.2 菊苣EST-SSR引物設(shè)計(jì)

1.2.1菊苣EST-SSR序列下載與SSR位點(diǎn)搜索 利用DNAstar軟件對(duì)來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的53 975條菊苣EST序列(截止2020年12月)進(jìn)行拼接和聚類。應(yīng)用簡(jiǎn)單序列重復(fù)識(shí)別工具(Simple sequence repeat identification tool,SSRIT)在線查找菊苣無(wú)冗余EST序列中的SSR位點(diǎn)。搜索標(biāo)準(zhǔn)為SSR長(zhǎng)度≥18 bp，二、三、四、五、六核苷酸的序列數(shù)目分別至少重復(fù)9，6，5，4，4次。

1.2.2SSR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)SSR側(cè)翼的保守區(qū)域，應(yīng)用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)參數(shù)為：熔解溫度 50℃～60℃，最適復(fù)性溫度55℃，上下游引物間溫度差異≤3℃；預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小90～500 bp；引物長(zhǎng)度18～22 bp，預(yù)期擴(kuò)增率≥80%；引物GC含量40%～60%，最適GC含量50%，上下游引物間GC含量差異≤5%；盡量避免錯(cuò)配、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物二聚體出現(xiàn)。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增

聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR) 擴(kuò)增體系為15 μL，包括1 μL DNA，0.3 μL酶，引物各1 μL，混合液7.5 μL，水4.2 μL。反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃30 s，熔解溫度40 s(每循環(huán)降低1℃)，72℃1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃30 s，Tm -5℃30 s，72℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min后4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6.0%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(電泳緩沖液1×TBE，電壓200 V，時(shí)間4 h)。電泳完成后銀染，最后用數(shù)碼相機(jī)拍照保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

SSR發(fā)生頻率為含SSR的Uni-EST數(shù)量與無(wú)冗余總EST數(shù)量之比，SSR出現(xiàn)頻率為SSR數(shù)量與無(wú)冗余總EST數(shù)量的比值，SSR平均分布距離為無(wú)冗余EST數(shù)量的總堿基數(shù)與SSR數(shù)量的比值。根據(jù)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增情況，選取清晰易辨的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，有帶記為1，無(wú)帶記為0，構(gòu)建0/1二元數(shù)據(jù)矩陣，計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分率、引物多態(tài)性信息含量(Polymorphism information content,PIC)[14]。利用NTsys-pc 2.10e軟件中的similarity程序計(jì)算材料間遺傳相似性系數(shù)(Genetic similarity,GS)，基于clustering程序中的SHAN進(jìn)行聚類分析，再根據(jù)Graphics程序中的tree plot繪制親緣關(guān)系樹(shù)形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊苣EST-SSR的信息分析

2.1.1菊苣EST中SSR的數(shù)量與分布特點(diǎn) 由表2可知，53 975 條菊苣EST拼接和聚類后獲得40 188 條Unigenes，序列總長(zhǎng)30 723.73 kb，從中共搜索到648 個(gè)SSR位點(diǎn)。SSR發(fā)生頻率為1.54%，出現(xiàn)頻率為1.61%，平均每47.41 kb出現(xiàn)1個(gè)SSR。菊苣轉(zhuǎn)錄組中SSR類型豐富，且各類型出現(xiàn)數(shù)量和分布距離的差異較大，其中，三核苷酸、二核苷酸和六核苷酸重復(fù)類型占主導(dǎo)地位，分別占SSR位點(diǎn)總量的46.45%，30.56%和19.13%。SSR平均長(zhǎng)度24.15 bp，為中等偏長(zhǎng)的序列，其中，長(zhǎng)度18～20 bp和21～25 bp的SSR在總SSR中占比較高，分別達(dá)到43.84%和36.64%。

表2 基于重復(fù)基元大小的 EST-SSR 分布

2.1.2菊苣EST-SSR基序重復(fù)類型和特征 菊苣EST-SSR核苷酸基序類型較豐富，648 個(gè)SSR中共搜索到146 種重復(fù)基序，六核苷酸類型中的重復(fù)基序種類最多，達(dá)到93 種，占基序類型總數(shù)的63.70%(表2)。出現(xiàn)頻率最高的6種基序類型主要存在于二核苷酸和三核苷酸(表3)，分別為：TC/GA，AG/CT，TTC/GAA，ATC/GAT，ATG/CAT和TGA/TCA，六核苷酸每種基序類型出現(xiàn)頻率均很低。不同重復(fù)類型SSR基序的重復(fù)次數(shù)差異很大，范圍在4～29 次間，其中，二核苷酸基序重復(fù)次數(shù)跨度最大，在9～29 次均有分布，三核苷酸基序有10 種重復(fù)次數(shù)，主要分布在6～20 次。重復(fù)次數(shù)基本上隨重復(fù)基序的核苷酸數(shù)目的增多而減少，且不同核苷酸重復(fù)基序的主導(dǎo)重復(fù)次數(shù)不同，三核苷酸重復(fù)6次的占主導(dǎo)，達(dá)26.397%，六核苷酸重復(fù)4次的占主導(dǎo)，為16.36%，二核苷酸重復(fù)7次的占主導(dǎo)，為11.42%(圖1)。

表3 菊苣EST中二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基序特點(diǎn)

圖1 菊苣EST中不同SSR重復(fù)基序的重復(fù)次數(shù)分布

2.2 菊苣EST-SSR引物篩選與檢測(cè)

為了初步驗(yàn)證設(shè)計(jì)的菊苣EST-SSR引物的有效性，從345 對(duì)引物中選擇152 對(duì)評(píng)分95 分以上的引物，以5份菊苣材料(表1)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。152 對(duì)引物中有119 對(duì)引物能夠有效擴(kuò)增，實(shí)際擴(kuò)增率78.29%，與預(yù)期值接近。其中，87 對(duì)引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與預(yù)期接近，90 對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰條帶，87 對(duì)引物在5個(gè)材料間檢測(cè)出多態(tài)性，多態(tài)率為57.24%，多態(tài)性引物信息見(jiàn)表4。已合成的119 對(duì)引物中，含有二、三、五和六核苷酸重復(fù)的引物分別有20，37，4和58 對(duì)，含六核苷酸重復(fù)類型的引物最多，沒(méi)有四核苷酸重復(fù)類型。

表4 引物序列及信息

續(xù)表4

續(xù)表4

2.3 菊苣EST-SSR引物通用性評(píng)價(jià)

2.3.1菊苣EST-SSR對(duì)近緣屬材料擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析 在87 對(duì)具有多態(tài)性的菊苣EST-SSR引物中隨機(jī)挑選出43 對(duì)引物，以31 份萵苣亞族材料(表1)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，37 對(duì)引物可以有效擴(kuò)增，轉(zhuǎn)移擴(kuò)增效率達(dá)到86.05%。挑選擴(kuò)增出清晰條帶的33 對(duì)引物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由表5可知，共擴(kuò)增出599 條清晰條帶，每對(duì)引物擴(kuò)增條帶數(shù)范圍在8～26 條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增18.2 條條帶，引物JJ4和JJ134(見(jiàn)圖2)擴(kuò)增條帶數(shù)最多，均為26 條。其中，多態(tài)性條帶584 條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出17.7 條多態(tài)性條帶，多態(tài)位點(diǎn)在85.7%～100%間，平均97.1%。引物擴(kuò)增PIC值在0.12～0.34間，平均0.21，PIC值最高的為J19。整體看，33 對(duì)引物對(duì)供試材料有較高擴(kuò)增效率，參試材料種質(zhì)間變異較大，存在較豐富的遺傳多樣性。

圖2 菊苣EST-SSR引物JJ-134的擴(kuò)增圖譜

表5 菊苣EST-SSR引物組合對(duì)苦荬菜和萵苣擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性

2.3.2基于菊苣EST-SSR聚類分析 遺傳相似系數(shù)(GS)結(jié)果顯示，供試材料之間差異明顯，具有較為豐富的遺傳多樣性。31 份近緣種質(zhì)間的成對(duì)GS值在0.472～0.938間，平均GS值為0.76，變幅為0.466，其中，來(lái)自四川雅安的2份材料SAU2012-2-5和SAU2012-5-5間GS值最大為0.94，其遺傳距離最小為0.472，表明其親緣關(guān)系最近，來(lái)源于四川雅安的SAU2012-2-5和內(nèi)蒙的CF023567間GS值最小，其遺傳距離最大，表明其親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。7份苦荬菜屬種質(zhì)間的成對(duì)GS值在0.49～0.874，平均GS值為0.618，23 份萵苣屬種質(zhì)間的成對(duì)GS值在0.760～0.938，平均GS值為0.861，表明參試苦荬菜屬的遺傳多樣性高于萵苣屬的。在遺傳相似系數(shù)分析的基礎(chǔ)上，應(yīng)用非加權(quán)類平均聚類方法對(duì)31 份材料進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建親緣關(guān)系樹(shù)狀圖(圖3)。31 份供試材料在遺傳相似系數(shù)0.822處可以劃分為6個(gè)組群。其中，24 份萵苣屬材料全部聚在第Ⅰ組，第Ⅰ組群又包含2個(gè)亞組，第1亞組包括17 份四川的、2份黑龍江的以及1份河南的，而序號(hào)為28～31的4份萵苣屬材料聚在第2亞組。7份苦荬菜屬材料分別聚在5個(gè)組群內(nèi)，第II組包含2份苦荬菜屬材料，即CF023568和CF023569，第III組、第IV組和第VI組均只有1份苦荬菜屬材料，分別為：CF023571，CF023566和CF023572。第V組也包含2份苦荬菜屬材料，分別為內(nèi)蒙的CF023567和吉林的CF023570。

圖3 苦荬菜和萵苣的UPGMA聚類圖

3 討論

隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，大量快速增長(zhǎng)的EST數(shù)據(jù)已成為EST-SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源，Cordeir等[15]推測(cè)，EST文庫(kù)中大約2%～11%的EST序列中含有SSR，而不同植物物種的EST中有1%～5%能發(fā)展成SSR標(biāo)記[16]。截止2020年12月，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的菊苣EST序列為53 975條，與水稻(Oryzasativa)(1 369 506條)、小麥(Triticumaestivum)(1 358 140條)、大麥(HordeumvulgareL.)(537 546條)等禾本科(Poaceae)作物相比，菊苣EST序列數(shù)據(jù)明顯不足[17]。本研究中菊苣SSR出現(xiàn)頻率為1.61%，略高于玉米(ZeamaysL.)的1.5%[16]，但遠(yuǎn)低于沙打旺(Astragalusadsurgens)的25.85%[18]、蘇丹草(Sorghumsudanense)的 21.75%[19]、不結(jié)球白菜(Brassicarapassp.chinensis)的34.84%[20]和水稻的27%[21]等。這種差異與物種、SSR開(kāi)發(fā)工具、搜索標(biāo)準(zhǔn)及EST數(shù)量、質(zhì)量、來(lái)源等因素密切相關(guān)[22]。如開(kāi)發(fā)水稻EST-SSR時(shí)，搜索SSR的長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)由12 bp增加到30 bp時(shí)，SSR的出現(xiàn)頻率從50%減少到1%[23]，而在本研究中，SSR長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)≥18 bp，搜索標(biāo)準(zhǔn)較為嚴(yán)格。

大量研究結(jié)果表明，大多數(shù)植物的EST-SSR以二、三核苷酸重復(fù)類型為主[24-25]，如沙打旺[18]、藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)[25]、獼猴桃(Actinidia)[26]等以二核苷酸重復(fù)類型為主，本研究中，菊苣與燕麥(AvenasativaL.)、蘇丹草、甘蔗(Saccharumofficinarum)等一樣，以三核苷酸重復(fù)類型為主[17,19]。Gao等[27]發(fā)現(xiàn)，許多三核苷酸與具有重要功能的基因相關(guān)。四、五核苷酸重復(fù)類型很少，與大多數(shù)研究一致。值得關(guān)注的是，本研究中六核苷酸重復(fù)類型所占比率較高，達(dá)到19.13%，表現(xiàn)出明顯的偏倚性，這在所報(bào)道的植物種類中極少見(jiàn)，如棗(Ziziphusjujuba)[24]、蘇丹草[19]、不結(jié)球白菜[20]等多在2%以下，但與李新鳳等[28]的研究結(jié)果相似，他們認(rèn)為這種現(xiàn)象可能與編碼區(qū)域由框移突變引起的非三核苷酸SSR受抑制有關(guān)。

此外，主導(dǎo)重復(fù)在不同物種間也存在差異[7]，Rota等[23]對(duì)水稻、小麥、大麥基因組和EST序列中SSR的分布和頻率研究發(fā)現(xiàn)，二、三、四、五核苷酸重復(fù)基序類型分別有4，10，33和102 種。本研究中，菊苣二核苷酸至五核苷酸重復(fù)基序類型分別有6，27，9和11 種，優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序類型為T(mén)C/GA (14.35%)，與孫清明等[29]研究結(jié)果類似。二核苷酸重復(fù)基序出現(xiàn)的重復(fù)次數(shù)類型多、跨度大，如AG/CT和TC/GA分別有27種、23種，重復(fù)次數(shù)類型跨度從重復(fù)9次到27 次、29 次，Cho等[30]認(rèn)為，SSR的重復(fù)次數(shù)與其變異呈正相關(guān)。菊苣重復(fù)基序出現(xiàn)情況及其頻率高低均表現(xiàn)出明顯的偏倚性，可能與不同物種進(jìn)化水平、基序的基因表達(dá)程度或突變頻率等因素的差異有關(guān)[31]，也可能與菊苣現(xiàn)有的EST數(shù)較少、覆蓋度不足有關(guān)。

利用EST設(shè)計(jì)引物的有效擴(kuò)增率一般在60%～90%[32]。本研究中菊苣EST-SSR引物有效擴(kuò)增率為78.29%，表明通過(guò)菊苣EST開(kāi)發(fā)SSR的效率較高，開(kāi)發(fā)的引物具有良好的特異性。部分引物未能擴(kuò)增可能是所設(shè)計(jì)引物跨越mRNA剪切位點(diǎn)以及擴(kuò)增產(chǎn)物包含的內(nèi)含子太長(zhǎng)所致。用于苦荬菜屬和萵苣屬材料通用性檢測(cè)分析的菊苣EST-SSR引物擴(kuò)增結(jié)果顯示，PIC值均低于0.5，按照Botstein[33]對(duì)多態(tài)性的定義，均為低度多態(tài)性標(biāo)記。但是，班騫等[34]采用本研究開(kāi)發(fā)的菊苣EST-SSR引物構(gòu)建苦荬菜指紋圖譜時(shí)，PIC值均高于0.5，平均達(dá)到0.834。這種差異與不同參試材料及來(lái)源差異、引物擴(kuò)增情況等有關(guān)，也與引物序列的選擇密切相關(guān)，如引物核苷酸重復(fù)類型與次數(shù)、基序類型以及SSR的長(zhǎng)度，當(dāng)SSR長(zhǎng)度≥20 bp時(shí)多態(tài)性較高[35]，而且低級(jí)基序SSR多態(tài)性普遍比高級(jí)基序的高[36]。本研究中篩選合成引物標(biāo)準(zhǔn)為評(píng)分95 分以上的，基序?yàn)榱塑账岬囊飫t接近總數(shù)的50%，隨機(jī)挑選用于分析的33 對(duì)引物中，基序?yàn)榱塑账岬恼急冗_(dá)55%，而班騫挑選引物時(shí)并未考慮綜合評(píng)分，所用引物以二、三核苷酸為主，且基序重復(fù)次數(shù)較高，增加重復(fù)次數(shù)，也相應(yīng)的增加了多態(tài)性的概率[31,34-35]。

大量研究表明，EST-SSR側(cè)翼序列在物種之間高度保守，具有較好的科、屬、種間通用性，親緣關(guān)系越近，擴(kuò)增的譜帶越清晰，而且轉(zhuǎn)移性比基因組SSR更高[34,36-37]。本研究獲得類似結(jié)果，菊苣EST-SSR穩(wěn)定性和重復(fù)性好，擴(kuò)增的譜帶清晰，轉(zhuǎn)移率較高，達(dá)到86.05%，表明菊苣EST-SSR在萵苣亞族中的通用性較強(qiáng)。31 份近緣種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.472～0.938間，表明參試種質(zhì)資源蘊(yùn)含著較豐富的遺傳多樣性。聚類分析顯示，開(kāi)發(fā)的菊苣EST-SSR能夠有效鑒別萵苣屬和苦荬菜屬，參試材料地理來(lái)源與聚類的一致性較為明顯，表現(xiàn)出較明顯的地域分布規(guī)律。部分地域差異較大的材料聚在同一組，可能發(fā)生了人為或者天然基因交流。CF023571，CF023566及CF023572等3份材料分別聚在第III組、第IV組和第VI組，與3份材料來(lái)源地域差異較大，且為不同種的野生型苦荬菜密切相關(guān)，表明它們不僅與萵苣屬材料間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而且種間親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)，有明顯的種間遺傳差異。通用性驗(yàn)證結(jié)果顯示，新開(kāi)發(fā)的菊苣EST-SSR標(biāo)記通用性較強(qiáng)，可以對(duì)菊苣及其近緣屬遺傳多樣性以及屬、種間親緣關(guān)系進(jìn)行有效的鑒定。

4 結(jié)論

本研究基于53 975 條菊苣EST序列搜索到648 個(gè)SSR位點(diǎn)，成功設(shè)計(jì)了345 對(duì)引物，并篩選出119 對(duì)評(píng)分95 分以上的有效引物，其中37 對(duì)引物通用性較強(qiáng)，種間轉(zhuǎn)移擴(kuò)增率達(dá)86.05%。此外，苦荬菜屬和萵苣屬種質(zhì)的遺傳多樣性初步分析顯示，供試材料具有較豐富的遺傳多樣性，聚類劃分與材料地理來(lái)源有相關(guān)性，不同種間存在明顯的遺傳分化。這為菊苣族分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、系統(tǒng)進(jìn)化研究及分子標(biāo)記輔助育種奠定了重要基礎(chǔ)。