王新惠，孫勁松，趙 芮，潘攀，丁 悅，劉力嘉，劉 洋

（成都大學(xué) 肉類(lèi)加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 成都610106）

我國(guó)是世界最大的豬肉生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[1]，主要是以熱鮮肉銷(xiāo)售為主，冷鮮肉和其它肉制品為輔的銷(xiāo)售模式，而在歐美和其他發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，90%以上的豬肉均以冷鮮肉的形式出售。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們對(duì)生活品質(zhì)的提高，冷鮮肉將迎來(lái)巨大的市場(chǎng)潛力[2]。

由于冷鮮肉相較于冷凍肉的貯藏溫度高，細(xì)菌易滋生，因此極易腐敗變質(zhì)。家庭常用保鮮袋保存冷鮮豬肉的保質(zhì)期一般不超過(guò)5 d[3]，而市售豬肉一般未經(jīng)包裝直接置于冷柜中，保質(zhì)期可能更短。研究表明微生物是造成冷鮮肉腐敗的主要原因，并且引起不同動(dòng)物肉腐敗的微生物可能不同，如假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）和腸桿菌科細(xì)菌等在腐敗的冷藏禽類(lèi)中較常見(jiàn)[4]。Mills 等[5]在腐敗的羊羔肉中發(fā)現(xiàn)大量的腐敗希瓦菌（Shewanella putrefaciens）、熱死環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta）和梭菌屬（Clostridiumspp.）等。對(duì)于豬肉，不同部位的腐敗豬肉樣品中的菌落組成大致相同，而不同菌屬之間增長(zhǎng)趨勢(shì)不盡相同，此外，熱死環(huán)絲菌屬在不同的樣本中含量差異較大[6]。此前對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè)，研究微生物的主要方法有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法、變性、溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）等[7]。這些方法存在各種局限性，如傳統(tǒng)方法無(wú)法分離、培養(yǎng)樣品中所有的微生物，而變性、溫度梯度凝膠電泳的分辨率較低等[8]。如今出現(xiàn)的高通量測(cè)序技術(shù)（或稱(chēng)第2 代測(cè)序技術(shù)）是一種高效，結(jié)果可靠的分析方法，并已廣泛應(yīng)用于環(huán)境、醫(yī)學(xué)和食品等各種領(lǐng)域[9-10]。目前對(duì)冷鮮肉腐敗過(guò)程中細(xì)菌的群落演替規(guī)律，以及腐敗微生物與腐敗物質(zhì)之間的相關(guān)性未有深入的研究，其中冷鮮肉的腐敗問(wèn)題是近幾年的研究熱點(diǎn)。

本研究采用16S rDNA 高通量測(cè)序方法，以非密封包裝的冷鮮肉為研究對(duì)象，對(duì)冷鮮肉腐敗過(guò)程中的細(xì)菌進(jìn)行測(cè)序分析，以期錨定特定腐敗菌，分析腐敗菌與表征腐敗的指標(biāo)之間的相關(guān)性，探究冷鮮肉腐敗過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的演替過(guò)程。以期為冷鮮肉的微生物腐敗機(jī)理研究和保鮮技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料的準(zhǔn)備

豬肉購(gòu)自成都市十陵鎮(zhèn)久貿(mào)綜合市場(chǎng)。采購(gòu)當(dāng)天屠宰的豬腹部的五花肉，將其切成大小相近肥瘦相間的肉片，置于4 ℃冰箱貯藏。每日取樣1次，用液氮瞬間冷凍后，置于超低溫冰箱-85 ℃保存，共取樣10 次樣品編號(hào)D1 至D10 待測(cè)，每次取3 個(gè)重復(fù)樣品，結(jié)果取平均。

1.2 主要試劑和儀器

容聲冰箱BCD-221WD16NP；超低溫冰箱AP-60-395LA，艾普儀器設(shè)備有限公司；DNA 提取試劑盒E.Z.N.ATM Mag -bind Soil，美國(guó)OMEGA 公司；Applied BiosystemsRGene AmpRPCR System 9700 型PCR 儀，卓越聯(lián)合生物科技有限公司；乙醇、液氮，新金山化工有限公司；Testo 205 型肉類(lèi)pH 計(jì)，維欣儀奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 TVB-N 和pH 值的測(cè)定

根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.228-2016中揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測(cè)定方法，測(cè)定豬肉中揮發(fā)性鹽基氮含量，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)3 次作為重復(fù)。豬肉的pH 值由肉類(lèi)pH 計(jì)直接測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)3 個(gè)不同位點(diǎn)作為重復(fù)。

1.4 DNA 的提取和PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

參考Wang 等[11]的方法，使用E.Z.N.ATM Mag-bind Soil 試劑盒提取總DNA 后，然后使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)DNA 的濃度。細(xì)菌16S rDNA V4 區(qū)域擴(kuò)增引物：515F（5’-GT GYCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）[12]。PCR 擴(kuò)增體系：每一個(gè)25 μL 的體系包括1×PCR buffer 2.5 μL、1.5 mmol/L MgCl22.5μL、0.4 μmol/L dNTPs 14.75 μL、正向和反向引物各1.5 μL，0.25 μL KODPlus-Neo 酶（TOYOBO）和2 μL 模板。PCR 程序包括起始94 ℃1 min，然后30 個(gè)循環(huán)（變性94 ℃20 s，退火54 ℃30 s 和延伸72 ℃30 s），最后72℃5 min。每個(gè)樣本進(jìn)行3 個(gè)PCR 技術(shù)重復(fù)。PCR產(chǎn)物與1/6 體積的6×Loading buffer 混合，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化和定量后，使用Hiseq 2500 平臺(tái)PE250 模式測(cè)序及生物信息學(xué)分析。

1.5 數(shù)據(jù)的處理

將序列進(jìn)行處理得到有效數(shù)據(jù)Clean Reads后，以Usearch 軟件為基礎(chǔ)，利用UPARSE 算法在97%的一致性水平上進(jìn)行OTU 聚類(lèi)[13]，利用UCLUST 分類(lèi)法和SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋分析[14]。使用R 語(yǔ)言中Vegan 包計(jì)算Alpha 指數(shù)[15]，進(jìn)行Alpha 多樣性分析。其中，Chao1 和ACE 指數(shù)表征細(xì)菌菌群的豐富度，值越大表示豐度越高。Shannon 和Simpson 指數(shù)用來(lái)表征細(xì)菌的多樣性，Shannon 指數(shù)越高代表多樣性越高。在本研究中Simpson 表示“1-Simpson's index”，其值與細(xì)菌多樣性呈正相關(guān)；Coverage 表示細(xì)菌群落的覆蓋率，其值越接近1 說(shuō)明樣本中測(cè)序深度的覆蓋率越好。群落組成分析使用R 語(yǔ)言進(jìn)行各種數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，使用ggplot2 包作圖[16]。

2 結(jié)果和討論

2.1 貯藏過(guò)程中腐敗指標(biāo)變化

對(duì)貯藏過(guò)程中的冷鮮肉的揮發(fā)性鹽基氮含量和pH 值進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示?？梢詮谋?中看出，冷鮮肉的揮發(fā)性鹽基氮含量隨著貯藏時(shí)間的增加而增加，但是貯藏的第8 天時(shí)，冷鮮肉的揮發(fā)性鹽基氮含量有所下降，可能是因?yàn)橐桩a(chǎn)生揮發(fā)性鹽基氮的細(xì)菌如假單胞菌屬的含量減小所致。揮發(fā)性鹽基氮是評(píng)價(jià)肉類(lèi)新鮮度的重要指標(biāo)[17]，是微生物和內(nèi)源酶作用于肉中，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨和胺類(lèi)等產(chǎn)物[18]，根據(jù)GB 2707-2016 國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定新鮮肉揮發(fā)性鹽基氮含量≤15 mg/100 g，可以從下表中看出，在貯藏的第4 天時(shí)，冷鮮肉中揮發(fā)性鹽基氮的含量已超過(guò)了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

表1 樣品的pH 值和TVB-N 含量Table 1 pH value and TVB-N content of samples

貯藏過(guò)程中，冷鮮肉的pH 值隨著時(shí)間先降低后增加，在貯藏的第4 天時(shí)，冷鮮肉的pH 值降到最低值5.69。冷鮮肉的pH 值下降主要源于被屠宰后的肌肉糖酵解產(chǎn)生乳酸和微生物酸性代謝產(chǎn)物的積累[19]，使豬肉中酸性物質(zhì)含量增加所致。而Greaser 等[20]發(fā)現(xiàn)pH 值下降的速率和糖酵解酶相關(guān)，而在低溫的環(huán)境下，酶活下降。在第5 天后，冷鮮肉中蛋白質(zhì)水解酶分解了細(xì)胞骨架蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，導(dǎo)致產(chǎn)生游離氨基酸，從而使冷鮮肉的pH 值上升。

2.2 Alpha 多樣性分析

冷鮮肉貯藏過(guò)程中細(xì)菌豐度指數(shù)Chao 1 指數(shù)和ACE 指數(shù)如表2所示，可以從表中看出，細(xì)菌豐度指數(shù)隨著時(shí)間呈現(xiàn)“三級(jí)臺(tái)階” 的減小趨勢(shì)。第1 階段是在貯藏的前3 天（D1～D3），在這階段，冷鮮肉中細(xì)菌豐度有所上升，并且在D3 時(shí)，細(xì)菌的豐度達(dá)到最大值，Chao 1 指數(shù)和ACE 指數(shù)分別為1 605.84 和1 644.84；第2 階段在貯藏的D4～D6 天，細(xì)菌的豐度較第一階段有所下降；第3階段是在貯藏的D7～D10 天，最后階段時(shí)，細(xì)菌的豐度最低，在貯藏的第10 天時(shí)，冷鮮肉中的細(xì)菌菌群豐度達(dá)到最低?？梢?jiàn)，冷鮮肉貯藏過(guò)程中，細(xì)菌菌群的豐度隨時(shí)間的增加而減小，主要是因?yàn)橘A藏環(huán)境的溫度過(guò)低，抑制了大部分細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝，使增殖受到抑制。

對(duì)冷鮮肉貯藏過(guò)程中細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行分析，從表2 中可以看出，多樣性指數(shù)Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)的變化和細(xì)菌菌群豐度指數(shù)的變化相似，也分為3 個(gè)階段。在貯藏的第3 天時(shí)，細(xì)菌菌群多樣性指數(shù)達(dá)到最大值，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)分別為5.41 和0.98。

從表2 中可以看出，冷鮮肉中的細(xì)菌菌群的多樣性和豐度整體趨勢(shì)均隨貯藏時(shí)間的增加而降低，主要原因是大量微生物無(wú)法適應(yīng)環(huán)境從而生長(zhǎng)受到抑制。Alpha 指數(shù)的波動(dòng)情況可以反映豬肉在貯藏過(guò)程中細(xì)菌群落的豐度和多樣性并不是簡(jiǎn)單遞增或遞減，而是一個(gè)不斷變化的過(guò)程。

表2 樣品的Alpha 多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of samples

2.3 細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 門(mén)水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 對(duì)所有樣本進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序，共鑒定出門(mén)、綱、目、科、屬、種共6 個(gè)水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，本研究主要從門(mén)、目和屬的水平分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，共檢測(cè)出37 個(gè)門(mén)，181 個(gè)目，575 個(gè)屬。

如圖1所示，在門(mén)水平上對(duì)冷鮮肉貯藏過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析，主要有變形菌門(mén)（Proteobacteria），厚壁菌門(mén)（Firmicutes），擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），酸桿菌門(mén)（Acidobacteria），放線菌門(mén)（Actinobacteria）。其中變形菌門(mén)在冷鮮肉貯藏過(guò)程中屬于優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，它在整個(gè)貯藏期的平均相對(duì)豐度占比為72.17%，在D7 占比達(dá)到最大值為93.12%。其次，厚壁菌門(mén)在冷鮮肉貯藏過(guò)程中也有較大占比，在D5、D6 和D8 中厚壁菌門(mén)的占比分別達(dá)到了25.97%，27.14%和40.28%。此外，擬桿菌門(mén)在貯藏期前3 天的占比較大，占比分別為8.31%，12.67%，15.26%，隨后逐漸減少，在貯藏第10 天時(shí)占比為1.70%。

圖1 門(mén)水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.1 The bacterial community structure at phylum level

就整個(gè)貯藏期而言，冷鮮肉中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化情況較為復(fù)雜。在貯藏前3 天，變形菌門(mén)占比減少，而厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)占比增多。第4天變形菌門(mén)突然增多，其它細(xì)菌含量相對(duì)減少，直到第7 天擬桿菌門(mén)基本被抑制。而厚壁菌門(mén)在樣本中占比在D8 中出現(xiàn)一次較大的“反彈”，隨后在貯藏的最后2 天被變形菌門(mén)抑制。除這3 種菌門(mén)之外，其它菌門(mén)各自的平均占比不足1%。

2.3.2 目水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 樣本中細(xì)菌在目水平上的群落結(jié)構(gòu)如圖2所示，在貯藏過(guò)程中，假單胞菌目（Pseudomonadales）的平均相對(duì)豐度最高，豐度均值達(dá)40.19%，在D7 時(shí)在樣本中占比最高為59.47%，在D8 時(shí)在樣本中占比最低為22.82%。其次是腸桿菌目（Enterobacteriales），豐度均值為28.44%，最低為4.65%（樣品D6），最高為61.06%（樣品D9）。其它平均相對(duì)豐度超過(guò)1%的菌目及其平均豐度分別是芽孢桿菌目（Bacillales）8.58%，梭菌目（Clostridiales）5.85%，擬桿菌目（Bacteroidales）4.92%，鞘氨醇菌目（Chitinophagales）1.97%，乳桿菌目（Lactobacillales）1.84%，β-變形菌目（Betaproteobacteriales）1.04%。

圖2 目水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 The bacterial community structure at order level

假單胞菌目作為優(yōu)勢(shì)菌目，相對(duì)豐度在貯藏期間整體趨勢(shì)為先增加，后減少；其次是腸桿菌目，在貯藏前期和后期的樣本中豐度較高，而在貯藏中期的樣本中（D5、D6）豐度較少；此外芽孢桿菌目大量存在于貯藏中、后期的樣品中，如：D5、D6 和D8。

2.3.3 屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 如圖3所示，在屬水平上對(duì)細(xì)菌菌群進(jìn)行分析，各個(gè)樣品中平均相對(duì)豐度前10 的菌屬和它們的平均相對(duì)豐度分別是：假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）24.77%、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacterspp.）12.09%、泛菌屬（Pantoeaspp.）11.56%、環(huán)絲菌屬（Brochothrixspp.）7.59%、拉烏爾菌屬（Raoultellaspp.）7.53%、沙雷氏菌屬（Serratiaspp.）3.89%、嗜冷桿菌屬（Psychrobacterspp.）3.31%、腸桿菌屬（Enterobacterspp.）2.31%、乳桿菌屬（Lactobacillusspp.）1.66%和檸檬酸桿菌屬（Citrobacterspp.）1.45%，這10 種菌屬豐度之和占所有被檢測(cè)菌屬豐度的62.63%（D3）到92.10%（D7）。假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、泛菌屬是整個(gè)貯藏過(guò)程中樣品中豐度較高的3 種菌屬。在貯藏過(guò)程中，假單胞菌屬是優(yōu)勢(shì)菌屬，其豐度在前期和后期都維持在25%左右，但在第4 天和第7 天出現(xiàn)較大的增加，并且在第7 天達(dá)到最大占比44.43%。不動(dòng)桿菌屬在貯藏中期的樣本中（如D5、D6）含量較多，但在其它時(shí)間段，在細(xì)菌中占比較少。泛菌屬在貯藏中期（樣本D5、D5）含量較少，但是在貯藏初期和貯藏最后2 d 的含量較多。假單胞菌屬被認(rèn)為是食品中最常見(jiàn)的與腐敗相關(guān)的菌屬，它在肉類(lèi)、水果甚至飲料中均大量存在[21]。不動(dòng)桿菌屬中大部分細(xì)菌為致病菌，是食品致病菌中常見(jiàn)的菌屬之一，在動(dòng)物類(lèi)食品中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)[22-23]。有研究表明泛菌屬主要分布在土壤，人類(lèi)的血液甚至糞便中[24]，研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)在被污染和變質(zhì)的豬肉中也被檢測(cè)出有大量泛菌屬細(xì)菌。

就整個(gè)貯藏過(guò)程而言，前3 天主要的細(xì)菌菌屬為假單胞菌屬和泛菌屬，其間假單胞菌屬含量較穩(wěn)定，泛菌屬的含量在逐漸減少。貯藏的第5 至6 天，優(yōu)勢(shì)菌屬變成了不動(dòng)桿菌屬，其次為假單胞菌屬和環(huán)絲菌屬。在貯藏的最后2 d，主要優(yōu)勢(shì)菌衍變成了假單胞菌屬、泛菌屬和拉烏爾菌屬。

2.4 屬水平上的細(xì)菌豐度相關(guān)性分析

冷鮮肉貯藏過(guò)程中細(xì)菌受到各種外部因素和內(nèi)部因素共同影響，以至于出現(xiàn)波動(dòng)變化的情況，但細(xì)菌間的相對(duì)變化存在著相關(guān)性。通過(guò)細(xì)菌間豐度的相關(guān)性分析，可以更好地發(fā)現(xiàn)其變化的規(guī)律。在屬水平上基于細(xì)菌豐度變化的相關(guān)性分析如表3所示：假單胞菌屬與腸桿菌屬存在強(qiáng)相關(guān)性（r=0.92），與沙雷氏菌屬存在較強(qiáng)的相關(guān)性（r=0.79）；不動(dòng)桿菌屬與泛菌屬（r=-0.68）、拉烏爾菌屬（r=-0.68）、沙雷氏菌屬（r=-0.66）和檸檬酸桿菌屬（r=-0.63）存在負(fù)相關(guān)性；泛菌屬的豐度與拉烏爾菌屬（r=0.99）和檸檬酸桿菌屬（r=0.98）存在強(qiáng)相關(guān)性，和乳桿菌屬存在負(fù)相關(guān)性（r=-0.69）；環(huán)絲菌屬與其它菌屬的相關(guān)性較弱；拉烏爾菌屬與檸檬酸桿菌屬具有強(qiáng)相關(guān)性（r=0.99），與乳桿菌屬（r=-0.76）和嗜冷桿菌屬（r=-0.76）呈負(fù)相關(guān)；沙雷氏菌屬與乳桿菌屬（r=-0.63）呈負(fù)相關(guān)；嗜冷桿菌屬與檸檬酸桿菌屬呈負(fù)相關(guān)（r=-0.74）；乳桿菌屬與檸檬酸桿菌屬呈負(fù)相關(guān)（r=-0.72）。

表3 各菌屬間豐度的相關(guān)性Table 3 The correlation of abundance at genus level

由相關(guān)性可以推斷腐敗的優(yōu)勢(shì)菌屬之間的變化情況，腐敗過(guò)程的主要優(yōu)勢(shì)菌屬假單胞菌屬與腸桿菌屬、沙雷氏菌屬的豐度變化情況相似；不動(dòng)桿菌屬與泛菌屬、拉烏爾菌屬、沙雷氏菌屬和檸檬酸桿菌屬豐度變化情況相反；泛菌屬和拉烏爾菌屬、檸檬酸桿菌屬的變化情況相似。各菌屬之間存在著較復(fù)雜的相關(guān)性，在整個(gè)細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中，正相關(guān)的菌屬可能對(duì)環(huán)境的競(jìng)爭(zhēng)力相似，兩種菌之間可能存在互生關(guān)系，如假單胞菌屬與腸桿菌屬；負(fù)相關(guān)的菌屬之間可能存在著競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，如不動(dòng)桿菌屬與泛菌屬。

2.5 細(xì)菌豐度與理化性質(zhì)之間的相關(guān)性

高通量測(cè)序技術(shù)不能直接實(shí)現(xiàn)微生物絕對(duì)定量（Absolute abundance）的分析，但是我們可以利用相對(duì)豐度反映某種細(xì)菌在樣品環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)程度[25]。如表4所示，通過(guò)分析平均相對(duì)豐度前10的菌屬和pH 值與揮發(fā)性鹽基氮含量的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)泛菌屬，拉烏爾菌屬和檸檬酸桿菌屬的豐度與pH 值呈較強(qiáng)的相關(guān)性，乳桿菌屬與pH 值具有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性；拉烏爾菌屬和檸檬酸桿菌屬與TVB-N 含量具有較強(qiáng)相關(guān)性，乳桿菌屬與TVB-N含量具有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明拉烏爾菌屬和檸檬酸桿菌屬可能與TVB-N 的產(chǎn)生有較大的關(guān)系。泛菌屬、拉烏爾菌屬和檸檬酸桿菌屬與pH 值相關(guān)性高，說(shuō)明這些菌屬對(duì)蛋白質(zhì)的分解和堿性物質(zhì)的生成可能存在較大的關(guān)聯(lián)。含量較高的菌屬尤其是假單胞菌屬的相對(duì)豐度與pH 值、TVB-N含量的相關(guān)性不強(qiáng)。但在一些研究中存在不同的結(jié)論，王真真等[26]利用分離培養(yǎng)的方式測(cè)定豬肉腐敗過(guò)程中微生物數(shù)量的變化，分析微生物指標(biāo)與腐敗指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)腐敗微生物數(shù)量和TVB-N、pH 值以及幾種生物胺含量之間存在強(qiáng)相關(guān)性。這樣的差異是由于本研究是討論豬肉樣品中細(xì)菌的相對(duì)豐度與腐敗指標(biāo)變化情況的相關(guān)性，以樣品中全部細(xì)菌為研究對(duì)象，探究在腐敗過(guò)程中細(xì)菌群落的演替規(guī)律。假單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬的相對(duì)豐度與腐敗指標(biāo)不存在相關(guān)性，說(shuō)明腐敗物質(zhì)的含量不是單獨(dú)由某種或某幾種豐度較高的細(xì)菌決定的，如肖香[27]的研究中指出中間耶爾森菌（Yersinia intermedia）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）等細(xì)菌都具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能力。

表4 菌屬豐度與pH 值和TVB-N 含量的相關(guān)性Table 4 Correlation between abundances of genus，pH and TVB-N

3 結(jié)論

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)冷鮮肉貯藏過(guò)程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，共鑒定出37 個(gè)門(mén)，181個(gè)目，575 個(gè)屬。通過(guò)對(duì)細(xì)菌群落Alpha 多樣性的分析，發(fā)現(xiàn)冷鮮肉在貯藏前期的菌群豐度和多樣性都高于貯藏中期和后期，并且在10 d 的貯藏過(guò)程中，多樣性指數(shù)和豐度指數(shù)基本上都呈“三級(jí)臺(tái)階”式的下降趨勢(shì)。

對(duì)冷鮮肉貯藏過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在門(mén)水平上，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，其中變形菌門(mén)相對(duì)豐度最高，平均值達(dá)到72.17%，其含量在整個(gè)貯藏過(guò)程中都處于較高的水平，厚壁菌門(mén)主要出現(xiàn)在貯藏的中期，擬桿菌門(mén)主要出現(xiàn)在貯藏的前期；在目水平上，假單胞菌目的豐度最高，平均值達(dá)40.19%。假單胞菌目的相對(duì)豐度在貯藏期間呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。其次是腸桿菌目，平均豐度為28.44%，它主要在貯藏前期和后期的樣本中占比較大；在屬水平上，平均豐度前3 的菌屬分別為假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬和泛菌屬，貯藏前期的優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬和泛菌屬，中期優(yōu)勢(shì)菌屬為不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬和環(huán)絲菌屬，后期優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬、泛菌屬和拉烏爾菌屬。就整個(gè)貯藏過(guò)程而言，假單胞菌屬為腐敗的最優(yōu)勢(shì)菌屬，通過(guò)菌屬豐度之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬與腸桿菌屬、沙雷氏菌屬的豐度變化情況相似。通過(guò)對(duì)菌屬的豐度和樣品TVB-N 含量和pH 值的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)拉烏爾菌屬和檸檬酸桿菌屬與TVB-N 的含量存在較強(qiáng)的相關(guān)性，泛菌屬、拉烏爾菌屬和檸檬酸桿菌屬的豐度與pH 值呈較強(qiáng)的相關(guān)性，但腐敗過(guò)程中主要優(yōu)勢(shì)菌屬假單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬的相對(duì)豐度與腐敗指標(biāo)的相關(guān)性不強(qiáng)，說(shuō)明腐敗指標(biāo)不是由某一種或某幾種優(yōu)勢(shì)菌屬單獨(dú)決定，而受到多種細(xì)菌的共同影響。