茍 英，吳東葉，黃啟林，王明義*

（1.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，成都 610083；2.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普外科，成都 610083）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種以胰腺局部炎性損傷和全身炎癥反應(yīng)為特征的疾病，其病情重、并發(fā)癥多、病死率高[1]。SAP發(fā)病早期常伴有腸屏障功能障礙，導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌和有毒物質(zhì)進(jìn)入血循環(huán)引起腸源性感染，加重患者病情。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因具有顯著的抗炎與免疫調(diào)節(jié)能力，已被廣泛應(yīng)用于炎癥性疾病的治療與研究。本研究主要探討外源性P-MSCs移植能否改善SAP大鼠腸屏障功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

健康成年雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基購(gòu)自友康恒業(yè)生物科技（北京）有限公司。?；悄懰徕c購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。CMDil細(xì)胞染料購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司。KGF、D-乳酸、內(nèi)毒素、IL-1β、TNF-α與CRP檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司。兔抗大鼠ZO-1與Occludin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)

胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞來自我院普外科湯禮軍教授課題組饋贈(zèng)，采用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體培養(yǎng)方法詳見HUANG等[2]研究。

1.3 模型制備及分組

24只SD大鼠，術(shù)前禁食12 h，自由飲水，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為SHAM組、SAP組與SAP+P-MSCs組，各8只。SHAM組：大鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉后，開腹翻動(dòng)胰腺數(shù)次然后關(guān)閉腹腔，術(shù)后6 h經(jīng)尾靜脈注射1 mL PBS緩沖液。SAP組：大鼠麻醉后開腹，經(jīng)胰膽管采用微量輸液泵輸注4%?；悄懰徕c（0.1 mL·100 g-1），術(shù)后6 h經(jīng)尾靜脈注射1mL PBS緩沖液。SAP+P-MSCs組：SAP建模術(shù)后6 h，經(jīng)尾靜脈注射P-MSCs（1×106個(gè)·100 g-1）。所有大鼠術(shù)后禁食不禁水，于P-MSCs輸注24 h后麻醉開腹，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，然后離心（3 500 rpm，5 min），收集血清保存于-80℃?zhèn)溆谩o菌條件下采集大鼠胰腺與腸系膜淋巴結(jié)組織，置于4℃ 1×PBS緩沖液中用于后續(xù)細(xì)菌培養(yǎng)。剪取末端回腸組織，2份置于凍存管中保存于-80℃?zhèn)溆茫?份置于4%多聚甲醛中固定，1份置于電鏡固定液用于后續(xù)電鏡檢測(cè)。

1.4 P-MSCs體內(nèi)示蹤

采用CM-Dil細(xì)胞染料標(biāo)記P-MSCs，并觀察CM-Dil對(duì)P-MSCs增殖的影響。10只雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為SHAM+P-MSCs組與SAP+P-MSCs組（每組5只），于術(shù)后6 h經(jīng)尾靜脈輸注CM-Dil標(biāo)記的P-MSCs（1×106個(gè)·100 g-1）。P-MSCs移植24 h后進(jìn)行取材，大鼠麻醉后處死，采集末端回腸組織，置于4%多聚甲醛中固定。對(duì)腸道組織進(jìn)行冰凍切片，DAPI復(fù)染核后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖活性

采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CM-Dil對(duì)P-MSCs增殖的影響，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書，最后測(cè)定其在450 nm處的OD值。

1.6 腸道組織病理學(xué)檢測(cè)

首先，采用HE染色觀察腸道病理改變。固定后的腸道組織，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色后，置于顯微鏡下觀察其病理改變。透射電鏡檢測(cè)，首先將腸道組織修剪成0.5～1.0 mm2大小，然后置于3%戊二醛預(yù)固定，經(jīng)丙酮脫水后，再依次進(jìn)行滲透、包埋與超薄切片，最后用醋酸鈾染色，再用檸檬酸鉛染色，采用H-600IV型透射電鏡進(jìn)行觀察。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

采用ELISA法測(cè)定大鼠血清中D-乳酸、內(nèi)毒素、IL-1β、TNF-α與CRP濃度，操作按試劑盒說明書步驟進(jìn)行。腸道組織中TNF-α、IL-1β與KGF的測(cè)定，首先取-80℃凍存的腸道組織，稱取相同質(zhì)量，然后超聲波勻漿后離心收集上清，并采用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，采用ELISA法進(jìn)行測(cè)定。

1.8 細(xì)菌移位的檢測(cè)

無菌條件下采集大鼠腸系膜淋巴結(jié)與胰腺組織各50 mg，加入1 mL無菌生理鹽水，在無菌玻璃勻漿管中勻漿，再將勻漿液稀釋100倍。分別取10 μL稀釋液均勻涂布接種于血瓊脂培養(yǎng)皿與麥康凱培養(yǎng)皿上，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落數(shù)，計(jì)算每克組織培養(yǎng)出的細(xì)菌菌落形成單位數(shù)（clonal formation unit，CFU），即CFU·g-1=平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/組織質(zhì)量（g）。

1.9 腸道組織ZO-1與Occludin蛋白表達(dá)水平測(cè)定

采用Western-blot法檢測(cè)腸道組織中ZO-1與Occludin蛋白表達(dá)水平。剪取適量等質(zhì)量的腸道組織，磨碎后提取總蛋白。進(jìn)行常規(guī)的電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別與抗ZO-1與Occludin抗體（1:500）4℃孵育過夜。用TBST洗滌后，加入二抗（1:2 000）孵育30 min，采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若方差齊則采用單因素的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若方差不齊，則多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-WallisH法，進(jìn)一步兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 P-MSCs減輕SAP大鼠腸道損傷

腸道HE染色結(jié)果顯示，SHAM組結(jié)構(gòu)完整，未見明顯異常；SAP組可見固有層崩解，絨毛缺損，間質(zhì)內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及明顯組織水腫；而SAP+P-MSCs組相較SAP組腸道損傷得到明顯改善（圖1）。腸道透射電鏡結(jié)果顯示：SHAM組腸道上皮細(xì)胞微絨毛排列整齊，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞間緊密連接清晰；SAP組腸上皮細(xì)胞微絨毛排列稀疏，線粒體腫脹明顯，緊密連接顯著破壞；SAP+P-MSCs組腸上皮細(xì)胞微絨毛排列相對(duì)整齊，線粒體輕微腫脹，緊密連接相對(duì)完整（圖2）。腸道HE染色與透射電鏡結(jié)果，表明外源性P-MSCs移植可減輕SAP大鼠腸道損傷。

圖1 腸道組織HE染色（×200）

圖2 腸道組織透射電鏡下病理改變（箭頭指示為緊密連接，×25 000）

2.2 P-MSCs向損傷部位定植

將CM-Dil細(xì)胞染料標(biāo)記的P-MSCs置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CM-Dil對(duì)P-MSCs的增殖及形態(tài)無明顯影響（圖3A，B）。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)CM-Dil對(duì)P-MSCs的增殖無明顯影響（圖3C）。將CM-Dil標(biāo)記的P-MSCs通過尾靜脈輸注到SAP大鼠體內(nèi)，最后在熒光顯微鏡下觀察P-MSCs在腸道的定植情況。如圖4所示，相比SHAM+PMSCs組，SAP+P-MSCs組腸道組織中有更多的P-MSCs定植。以上結(jié)果表明，采用CM-Dil標(biāo)記P-MSCs安全有效，并且P-MSCs傾向于在損傷腸道組織中募集。

圖3 P-MSCs傾向于在損傷腸道組織中定植

圖4 CM-Dil標(biāo)記的P-MSCs在腸道中的定植情況（×200）

2.3 P-MSCs減輕SAP大鼠全身炎癥反應(yīng)

ELISA檢測(cè)結(jié)果表明：相比SHAM組，SAP組大鼠血清中IL-1β、TNF-α與CRP濃度顯著增加（P＜0.001）；相比SAP組，SAP+P-MSCs組大鼠血清中IL-1β、TNF-α與CRP濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖5）。說明外源性P-MSCs移植可減輕SAP大鼠全身炎癥反應(yīng)。

圖5 P-MSCs減輕SAP大鼠全身炎癥反應(yīng)程度

2.4 P-MSCs減輕SAP大鼠腸道炎癥反應(yīng)

如圖6A，B所示，相比SHAM組，SAP組腸道組織中促炎因子TNF-α與IL-1β水平顯著升高（P＜0.001）；給予P-MSCs治療后，SAP大鼠腸道組織中TNF-α與IL-1β水平顯著降低（P＜0.001）。說明P-MSCs移植可減輕SAP大鼠腸道炎癥反應(yīng)。此外還發(fā)現(xiàn)，SAP組腸道組織中KGF含量較SHAM組顯著升高（P＜0.01）；相比SAP組，SAP+PMSCs組腸道組織中KGF含量進(jìn)一步升高（P＜0.01，圖6C）。

圖6 P-MSCs減輕SAP大鼠腸道炎癥反應(yīng)

2.5 P-MSCs改善SAP大鼠腸屏障功能

本研究發(fā)現(xiàn)，SAP組血清D-乳酸與內(nèi)毒素濃度顯著高于SHAM組（P＜0.001）；給予P-MSCs治療后，血清D-乳酸與內(nèi)毒素濃度均明顯降低（P＜0.001，圖7A，B）。通過對(duì)不同組進(jìn)行細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化分析后發(fā)現(xiàn)，相比SHAM組，SAP組胰腺與腸系膜淋巴結(jié)組織培養(yǎng)獲得的細(xì)菌菌落數(shù)顯著增加（P＜0.001）；給予P-MSCs治療后，胰腺與腸系膜淋巴結(jié)組組織培養(yǎng)獲得的細(xì)菌菌落數(shù)顯著減少（P＜0.05，圖7C）。腸道組織中ZO-1和Occludin的Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明：相比SHAM組，SAP組ZO-1與Occludin的表達(dá)量顯著下降（P＜0.001）；而給予P-MSCs治療后可增加ZO-1與Occludin的表達(dá)，與SAP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖7D，E）。綜上所述，P-MSCs可改善SAP大鼠腸屏障功能。

圖7 P-MSCs可改善SAP大鼠腸黏膜屏障功能

3 討論

MSCs因其具有顯著的抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用，被廣泛用于炎癥性疾病的治療與研究。已有研究表明，外源性MSCs移植可減輕SAP相關(guān)性腸損傷。2012年，TU等[3]發(fā)現(xiàn)同種異體BM-MSCs移植可減輕SAP大鼠小腸上皮炎癥與損傷，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖與黏膜修復(fù)，改善腸屏障功能。

P-MSCs是從胎兒胎盤組織中分離培養(yǎng)獲得，胎兒分娩后胎盤組織常被當(dāng)作醫(yī)療廢棄物拋棄，因此從胎盤組織中分離培養(yǎng)P-MSCs具有無創(chuàng)性。此外，相比BM-MSCs，P-MSCs不但具有組織來源豐富、組織中MSCs含量豐富、倫理限制少等優(yōu)點(diǎn)，而且還具有更強(qiáng)的增殖與免疫調(diào)節(jié)能力[4-5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，相比UC-MSCs，P-MSCs具有更強(qiáng)的增殖與免疫調(diào)節(jié)能力。

SAP早期是一種無菌性炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)相對(duì)較輕，而后期出現(xiàn)的嚴(yán)重全身炎癥反應(yīng)及高死亡率被認(rèn)為與腸道通透性改變導(dǎo)致腸道細(xì)菌移位以及腸道有毒物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)有關(guān)[7]。因此，改善SAP患者腸屏障功能對(duì)于緩解病情、減少并發(fā)癥、降低病死率等均具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)外源性P-MSCs移植可減輕SAP大鼠全身炎癥反應(yīng)與腸道損傷，改善腸屏障功能。

大量研究證實(shí)，MSCs具有向組織損傷部位遷移與定植的特性。MSCs在組織損傷部位定植對(duì)充分發(fā)揮其治療作用至關(guān)重要。JIANG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在缺血-再灌注腸道損傷大鼠模型中，外源性BMMSCs也傾向于在損傷腸道組織中定植。本研究發(fā)現(xiàn)相比SHAM+P-MSCs組，SAP+P-MSCs組腸道組織中有更多P-MSCs定植，說明在SAP大鼠體內(nèi)，外源性移植的P-MSCs有向損傷腸道募集的趨勢(shì)。

D-乳酸與內(nèi)毒素由腸道細(xì)菌產(chǎn)生，腸屏障功能正常時(shí)，其幾乎不能進(jìn)入血循環(huán)。當(dāng)腸屏障功能受損時(shí)，大量D-乳酸與內(nèi)毒素可進(jìn)入血循環(huán)，因此其常作為腸屏障損傷的早期指標(biāo)。此外，當(dāng)腸屏障出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，腸道中細(xì)菌也可進(jìn)入血循環(huán)，導(dǎo)致腸源性感染。腸上皮細(xì)胞間緊密連接對(duì)維持腸屏障功能完整性至關(guān)重要。研究[9]證實(shí)，ZO-1與Occludin蛋白在腸上皮細(xì)胞間緊密連接中扮演著重要角色。本研究給予外源性P-MSCs治療后，SAP大鼠血清D-乳酸與內(nèi)毒素濃度顯著降低，并且胰腺與腸系膜淋巴結(jié)組織培養(yǎng)獲得細(xì)菌菌落數(shù)也顯著減少，此外腸道組織中ZO-1與Occludin蛋白表達(dá)也顯著升高，說明P-MSCs可改善SAP大鼠腸屏障功能。

本研究觀察到給予外源性P-MSCs治療后，SAP大鼠血清與腸道組織中TNF-α與IL-1β濃度均顯著降低。角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocyte growth factor，KGF）可促進(jìn)腸道黏膜上皮細(xì)胞增殖與分化，加速腸道損傷上皮細(xì)胞修復(fù)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)P-MSCs治療后，SAP大鼠腸道組織中KGF含量顯著升高，說明P-MSCs可促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞再生。

綜上所述，本研究初步表明外源性P-MSCs移植可減輕SAP大鼠腸道損傷，改善腸屏障功能，但P-MSCs改善腸屏障功能的具體機(jī)制尚不清楚，仍有待進(jìn)一步深入探討。