程 喆 文 靜 韓 瑩 金建秋 李斌斌 宋江園 徐 偲 劉曉丹 崔紅梅 趙忠芳 王 倩 郭 驤 魯明星 劉宏偉

天皰瘡是一種自身免疫性大皰類疾病，中老年人好發(fā)，亞洲地區(qū)的黃色人種也是好發(fā)人群[1，2]。尋常型天皰瘡（pemphigus vulgaris，PV）是口腔黏膜最常見的一型。

PV 被認為是一種自身免疫病，患者循環(huán)血中出現(xiàn)針對自身棘層細胞表面橋粒的特異性抗體，這些特異性抗體靶抗原是橋粒芯蛋白3（desmoglein-3，Dsg3）和橋粒芯蛋白 1（desmoglein-1，Dsg1）。這兩種橋粒芯蛋白一旦遭到攻擊，上皮細胞間緊密連接被破壞，就會導(dǎo)致“棘層松解”，形成“上皮內(nèi)皰”[2～4]。

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測抗 Dsg3、Dsg1 抗體是近年來在我國逐漸采用的診斷方法之一，它可以定性和定量地判斷病情的輕重、指導(dǎo)臨床治療的激素用量[5，6]。本研究將采用多種實驗診斷學(xué)指標分析ELISA 法在診斷口腔天皰瘡中的價值。

資料和方法

1.研究對象

選擇2010.1.1～2019.12.31 期間就診于北京大學(xué)口腔醫(yī)院口腔黏膜科的患者，符合以下納入排除標準。

（1）納入標準：①實驗組：經(jīng)臨床和病理診斷為天皰瘡的患者；②對照組：經(jīng)臨床和病理診斷為類天皰瘡的患者；③年齡為18～85 歲；④未經(jīng)任何治療；⑤無合并的其他口腔黏膜病；⑥進行了ELISA 檢查Dsg3 和Dsg1；⑦無其他免疫系統(tǒng)疾病和嚴重全身疾患；⑧無精神障礙；⑨同意進入本研究。

（2）排除標準：①年齡小于18 歲或大于85 歲；②處于妊娠期或哺乳期的女性；③過敏體質(zhì)者；④病損區(qū)域曾經(jīng)激光、放射或化學(xué)藥物治療；⑤有其他惡性腫瘤等嚴重全身疾患；⑥有精神障礙；⑦其他原因致不能配合檢查。

2.診斷金標準

天皰瘡和類天皰瘡的診斷參照《口腔黏膜病學(xué)》和《口腔組織學(xué)與病理學(xué)》的診斷標準[2，19]。以組織病理學(xué)診斷作為金標準。

3.ELISA 檢測方法及結(jié)果的判讀

患者于醫(yī)院檢驗科行血清抗Dsg1 和Dsg3 抗體的檢測。

結(jié)果判讀：抗Dsg1 抗體水平：≥20U/ml 為陽性，14～20U/ml 為不確定，＜14U/ml 為陰性?？?Dsg3抗體水平：≥20U/ml 為陽性，7～20U/ml 為不確定，＜7U/ml 為陰性。抗Dsg1 或Dsg3 抗體任一結(jié)果為陽性時，則記ELISA 結(jié)果為“陽性”；其余情況則記為陰性。

4.統(tǒng)計學(xué)分析

患者的信息進行雙人平行錄入，再加第三人核對，無誤后使用 IBM SPSS 17.0 軟件（SPSS，Chicago，IL，USA）進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料的檢驗采用卡方檢驗，計量資料采用獨立樣本t檢驗。計算ELISA 法檢出抗Dsg1 或Dsg3 抗體的靈敏度、特異度、準確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和約登指數(shù)，并繪制ROC 曲線。

Logistics 回歸分析的方法選擇向后：條件，協(xié)變量的進入概率為0.05，刪除概率為0.10。本研究所有P值均為雙側(cè)檢驗，統(tǒng)計學(xué)差異顯著性水平設(shè)置為P＜0.05。

結(jié) 果

研究對象包括140 例實驗組的PV 患者以及157 例對照組的類天皰瘡患者（表1）。實驗組患者中男性44 例，女性96 例，就診時年齡分布為20～82歲，平均 50.42±12.76 歲；對照組中男性 53 例，女性125 例，就診年齡分布為26～85 歲，平均59.71±11.81歲。兩組患者間性別差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而年齡差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

納入的2 組患者均具有口腔黏膜損害。實驗組140 例PV 患者中139 例出現(xiàn)鮮紅糜爛面，占99.3%；111 例出現(xiàn)周緣擴展或尼氏征，占79.3%；109 例出現(xiàn)口腔黏膜云霧狀水腫，占77.9%；20 例出現(xiàn)水皰病損，占14.3%；33 例患者具有皮膚病損，占23.4%。對照組157 類天皰瘡患者中，127 例出現(xiàn)糜爛面，占80.9%，顯著低于實驗組，P＜0.05，且糜爛面上覆黃色偽膜，而非鮮紅糜爛面；57 例出現(xiàn)水皰病損，占36.3%，顯著高于實驗組，P＜0.05；出現(xiàn)周緣擴展或尼氏征52 例，占33.1%，顯著低于實驗組，P＜0.05；類天皰瘡的口腔黏膜云霧狀水腫（1.9%）及皮損（3.8%）很少見，顯著低于實驗組，P＜0.05；（表 1）。

表1 兩組患者的臨床表現(xiàn)及比率

141 例 PV 患者中，69 例抗 Dsg1 抗體陽性，129例抗 Dsg3 抗體陽性，131；對照組中，7 例抗 Dsg1 抗體陽性，5 例抗Dsg3 抗體陽性?？ǚ綑z驗兩組有顯著差異，P＜0.05（表 2）。

表2 ELISA 法檢出抗Dsg1 和抗Dsg3 抗體陽性

ELISA 法診斷口腔天皰瘡價值的診斷指標：敏感度為 93.6%（131/140），特異度為 93.3%（147/157），準確度為93.6%（279/297），陽性預(yù)測值為92.9%（131/141），陰性預(yù)測值為 94.2%（147/156），約登指數(shù)為87.2%（93.6%+93.6%-1）。見表3。

表3 評估ELISA 法診斷價值的指標

ROC 曲線見圖1，結(jié)果顯示抗Dsg3 抗體的ROC 曲線在坐標系中最靠近左上角，具有最大的曲線下面積（0.942），診斷能力最強，ELISA 結(jié)果和云霧狀水腫緊隨其后。

圖1 8 種方法診斷天皰瘡的ROC 曲線

抗Dsg3 抗體、ELISA 結(jié)果和云霧狀水腫的ROC 曲線在坐標系中靠近左上角，診斷能力很強。

8 種臨床或?qū)嶒炇抑笜说腜 值均小于0.05，說明本研究選取的8 個診斷試驗指標均對于診斷天皰瘡有統(tǒng)計學(xué)意義。按照ROC 曲線下面積從大到小排列的指標順序是：抗Dsg3 抗體陽性、ELISA（抗Dsg1或Dsg3 抗體陽性、云霧狀水腫、周緣擴展或尼氏征、抗Dsg1 抗體陽性、皮損、鮮紅糜爛面和水皰。抗Dsg3 抗體陽性、ELISA 結(jié)果和云霧狀水腫的ROC曲線同樣很靠近左上角，是正向預(yù)測里面積＞0.85的、效果很好的診斷實驗指標；周緣擴展或尼氏征、抗Dsg1 抗體陽性、皮損和鮮紅糜爛面的ROC 曲線下面積是大于0.5 的正向預(yù)測值，但在0.5～0.7 之間的診斷效果欠佳。水皰的ROC 曲線下面積是小于0.5 的是反向預(yù)測值，診斷不準確，見表4。

表4 ROC 曲線下的面積

以是否診斷為天皰瘡為因變量，以性別、年齡、有無皮損、有無鮮紅糜爛面、有無云霧狀水腫、有無水皰、有無周緣擴展或尼氏征、Dsg1 結(jié)果、Dsg3 結(jié)果和Dsg1 結(jié)果、Dsg1 或Dsg3 結(jié)果作為協(xié)變量，進行Logistics 回歸分析。揭示：抗Dsg3 抗體陽性（OR＝23.332，P＝0.000）、云霧狀水腫（OR＝19.725，P＝0.000）、周緣擴展或尼氏征（OR＝4.822，P＝0.027）、年齡（OR＝6.106，P＝0.013）是診斷為天皰瘡的風(fēng)險因素。而性別、皮損、鮮紅糜爛面、有無水皰、抗Dsg1抗體陽性和ELISA 結(jié)果患天皰瘡無顯著性相關(guān)（表5）。

表5 天皰瘡的Logistics 回歸分析

討 論

PV 是一種嚴重的慢性自身免疫性大皰性疾病，可以導(dǎo)致全身皮膚或者黏膜反復(fù)起皰、破潰、糜爛、滲出，其中口腔黏膜是起最常見的初發(fā)區(qū)域，甚至有的患者僅有口腔黏膜病損。本研究中PV 患者全部具有口腔病損，只有約四分之一的患者具有皮膚病損。

PV 預(yù)后較差，給患者的生活帶來極大地不適，如病情不加控制，甚至能引起電解質(zhì)紊亂、嚴重感染、惡病質(zhì)，最終危及生命[2]。因此疑似PV 的患者應(yīng)該引起臨床大夫的重視，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，以減輕患者的痛苦，避免病情加重，同時也可以從某種程度上控制糖皮質(zhì)激素的用量，預(yù)防其副作用的發(fā)生。

對本研究選取一些天皰瘡臨床特征性指標，如鮮紅糜爛面、水皰、周緣擴展或尼氏征，其判斷是具有主觀性的，是需經(jīng)過訓(xùn)練的口腔黏膜病?？漆t(yī)生才能識別的。因為天皰瘡發(fā)生的是上皮內(nèi)皰，皰壁很薄，水皰難以長期存留在口腔而不易多見，這是水皰比率低的原因；皰破后露出的鮮紅糜爛面就較水皰更多見，因此鮮紅糜爛面的發(fā)生比率高于水皰；周緣擴展或尼氏征需檢查者掌握技巧和具有檢查意識，檢出率也因此不高；云霧狀水腫雖檢出比率高，但是常不易與口腔黏膜白色病損鑒別，特異性差；就診于口腔黏膜科的天皰瘡患者皮損比率本身就很低；相比之下，用ELISA 法檢出抗 Dsg3、抗 Dsg1 抗體就很客觀，且陽性率遠高于上述天皰瘡臨床指標，是口腔黏膜病?？漆t(yī)師和口腔全科醫(yī)師都可依據(jù)的診斷指標。

天皰瘡的診斷往往需要多種方法共同驗證，其檢查方法隨時代發(fā)展日益成熟進步，時至今日，天皰瘡的常用檢查方法包括：臨床檢查、組織病理學(xué)檢查、脫落細胞學(xué)檢查、直接免疫熒光、間接免疫熒光和ELSIA[6～10]。其中ELISA 是最新提出的檢測手段，一經(jīng)應(yīng)用便因其少創(chuàng)廣受歡迎，早在上世紀90 年代就有學(xué)者認為ELISA 的敏感度和特異性均很高[11]，是診斷天皰瘡的可靠檢查手段。但在最近10 年，ELISA 才在我國得到廣泛的認同和開展。

抗Dsg3、抗Dsg1 抗體這兩種橋粒芯蛋白均隸屬于橋粒鈣黏素家族，可以起到黏附、連接、支持的作用，具有連接相鄰上皮細胞，維持正常細胞和組織形態(tài)的功能。一旦Dsg1、Dsg3 遭到攻擊，鈣黏素復(fù)合體的構(gòu)象和穩(wěn)定性均受影響，橋粒的形成受抑，上皮細胞間的緊密連接被破壞，就會導(dǎo)致“棘層松解”，形成“上皮內(nèi)皰”[2～4]。因此，抗 Dsg3、抗 Dsg1 抗體既反映天皰瘡的發(fā)病機制，也與臨床皰損緊密關(guān)聯(lián)。

根據(jù)長期文獻報道，ELISA 診斷天皰瘡的敏感度為 80%～100%[12～17]，特異性可達 90%以上[12，16，17]。在我們的研究中，ELISA 的敏感度和特異性分別為93.6%和93.3%，與既往的研究一致。其準確度也具有較高的水平，是可靠的診斷工具。

ELISA 在具有高度敏感度和特異性的同時，還可以區(qū)分PV 的不同表型，這是由于Dsg1 和Dsg3在人體不同部位具有相異的表達和分布：在口腔黏膜和食管，Dsg3 在上皮全層均有表達，Dsg1 在基底部表達較多而在全層較少；而在表皮內(nèi)，Dsg3 在基底部的角質(zhì)形成細胞高表達，Dsg1 在表皮全層表達，特別是表皮的上部表達更高。血清中存在的抗Dsg1 和抗Dsg3 的自身抗體的量不同也就導(dǎo)致了PV 患者在表皮中形成水皰的位置的多樣性，最終可以將其區(qū)分為黏膜主導(dǎo)型和皮膚黏膜型[6]。黏膜主導(dǎo)型PV 患者血清中僅有抗Dsg3，由于Dsg1 可補償抗Dsg3 抗體在皮膚造成的損傷，故皮膚損害較輕，或沒有損害；但無法彌補抗Dsg3 抗體在黏膜處造成的對Dsg3 的破壞，故黏膜損害較重。皮膚黏膜型PV患者的血清中同時存在抗Dsg1 和抗Dsg3 抗體，因此出現(xiàn)皮膚和黏膜損傷[18]。

這種Dsg1 和Dsg3 的表達和分布差異，也可以解釋多因素回歸分析的結(jié)果：選取的研究對象以黏膜損害為主，少有出現(xiàn)皮損，理論上外周血中抗Dsg1 抗體的水平較低，因而研究中實驗組和對照組只在抗Dsg3 抗體陽性上的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而在抗Dsg1 抗體陽性上的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義；受抗Dsg1 抗體陽性的影響，ELISA 整體結(jié)果的差異也不具有統(tǒng)計學(xué)意義。這也提示，對于臨床疑似口腔天皰瘡的患者，其ELISA 結(jié)果中抗Dsg3 抗體的結(jié)果對于確診更有意義。

ROC 曲線或稱為受試者工作特征曲線，可用來表達靈敏度與特異度的關(guān)系。通常選用ROC 曲線下的面積大小作為評價診斷試驗績效的指標，最完美和理想的診斷試驗的ROC 曲線下的面積大小應(yīng)該等于或接近1。ROC 曲線越向左上偏，曲線下的面積越大，其診斷試驗識別患者和非患者的能力越高。我們的研究中選取了臨床表現(xiàn)及ELISA 檢測中的8個指標作為診斷試驗指標，分別繪制了ROC 曲線進行比較，最終發(fā)現(xiàn)“抗Dsg3 抗體陽性”的ROC 曲線在坐標系中最靠近左上角，具有最大的曲線下面積（0.942），說明在上述8 種指標中，抗Dsg3 抗體陽性在診斷口腔天皰瘡時具有最高的應(yīng)用價值。ELISA 結(jié)果（Dsg3+Dsg1）和云霧狀水腫2 個指標同樣具有較高的曲線下面積（均＞0.85），分別為0.936和0.881，對于診斷口腔天皰瘡亦具有較高的價值。

天皰瘡的Logistics 回歸分析中，最后留在方程中的變量有5 個：抗Dsg3 抗體陽性、云霧狀水腫、周緣擴展或尼氏征、年齡和水皰，前4 個因素與天皰瘡的診斷顯著相關(guān)?？笵sg3 抗體陽性的概率是對照組患者的23.332 倍；天皰瘡患者出現(xiàn)云霧狀水腫的比率是對照組患者的19.725 倍；天皰瘡患者出現(xiàn)周緣擴展或尼氏征的可能性是對照組患者的4.822倍；天皰瘡患者比對照組患者早發(fā)病10 年的可能性是對照組患者的6.106 倍。

本研究中發(fā)現(xiàn)ELSIA 的敏感度為93.6%，特異性為93.6%，準確度為93.6%，陽性預(yù)測值為92.9%，陰性預(yù)測值為94.2%，約登指數(shù)為87.2%。實驗組和對照組在“抗Dsg3 抗體結(jié)果抗體陽性”、“云霧狀水腫”和“年齡”因素上具有顯著差異。結(jié)合Logistics 回歸分析和ROC 曲線下面積分析，綜合評估結(jié)果顯示ELSIA 法有很強的診斷能力，對天皰瘡的診斷具有很好應(yīng)用價值。

除此以外，相比于組織病理學(xué)、直接免疫熒光和間接免疫熒光，ELISA 還具有操作簡便、微創(chuàng)、對設(shè)備要求較低的優(yōu)勢，同時，由于ELISA 的結(jié)果為定量結(jié)果，治療中可多次檢測進行對比，分析患者身體中自身抗體滴度以實現(xiàn)指導(dǎo)用藥，起到精準治療的目的。

綜合上述多因素分析和ROC 曲線的結(jié)果，我們不難發(fā)現(xiàn)，通過ELISA 法檢測外周血中自身抗體，特別是抗Dsg3 抗體來診斷口腔天皰瘡，方法簡便，微痛無創(chuàng)，具有較高的敏感度和特異性，對于口腔天皰瘡的診斷具有重要意義。