薛靜秀 李 濤 馬 哲 任 建 馬思雨 劉 娜

將天然植物提取物作為抑菌類漱口水的有效成分可以減少因使用化學(xué)制劑漱口水引起的一些副作用，如牙齒變色、口腔黏膜刺激癥狀、味覺減退等[1，2]。EGCG 是從茶葉中分離得到的兒茶素類單體，對(duì)變異鏈球菌具有一定的抑制作用[3，4]，但是EGCG單獨(dú)作用時(shí)生物利用度相對(duì)較低，與其他物質(zhì)配伍應(yīng)用可提高其作用效率[5]。綠原酸是植物細(xì)胞通過莽草酸途徑合成的一種苯丙素類物質(zhì)[6]，其溶液口感醇和，刺激性小，對(duì)變異鏈球菌亦有一定的抑制作用，適用于開發(fā)抗齲漱口水產(chǎn)品[7]。本研究將二者配伍應(yīng)用，測(cè)定不同濃度混合液對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸、粘附及生物膜形成的影響，為其應(yīng)用于齲病預(yù)防提供研究基礎(chǔ)。

資料和方法

1.主要試劑及用品：EGCG（純度96%）、綠原酸（純度98%），洗必泰（購自深圳南粵藥業(yè)有限公司），牛腦心浸出液培養(yǎng)基（brain heart infusion，BHI）（購自杭州微生物試劑有限公司），BHI 固體培養(yǎng)基（購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司），全波長酶標(biāo)儀系統(tǒng)（Power Wave XS2，美國），臺(tái)式 pH 計(jì)（Mettler Toledo，瑞士），激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本），國際標(biāo)準(zhǔn)菌株變異鏈球菌ATCC25175（購自廣東省微生物研究所）。

2.菌液制備：將凍存菌株復(fù)蘇，傳代，鑒定，然后挑取2～3 個(gè)菌落接種于BHI 液體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h，離心，涂片，用生理鹽水調(diào)節(jié)菌濃度為1.5×108CFU/ml。

3.實(shí)驗(yàn)藥液的制備：EGCG 與綠原酸母液：將EGCG 與綠原酸溶解于無菌BHI 液體培養(yǎng)基中，配置濃度為1mg/ml EGCG 母液與20mg/ml 綠原酸母液，密封于4℃冰箱避光保存。

噻唑藍(lán)溶液[3-（4，5-dimethyl-2thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]：避光條件下稱取0.15g MTT 溶于30ml PBS 緩沖液中，配制成濃度為5mg/ml 的儲(chǔ)備液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

吖啶橙（acridine orange，AO）、溴化乙錠（ethidium bromide，EB）熒光染液：避光條件下稱取AO、EB 各 1mg，分別溶于 10ml pH 為 7.0 的 PBS 緩沖液中，無菌針頭過濾器濾過除菌，4℃冰箱避光保存?zhèn)溆?。染色前將AO、EB 儲(chǔ)備液等比例混合后1：20 稀釋成工作液。

4.確定EGCG、綠原酸的MIC 值：二倍稀釋法將EGCG 母液稀釋成如下濃度：1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031mg/ml，向96 孔板中每孔加入上述各濃度梯度 EGCG 藥液190μl 和前述制備好的菌液10μl，此時(shí)菌濃度為 7.5×106CFU/ml，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h 后取出，在暗色背景下肉眼觀察，最低濃度的孔中無菌生長者為其MIC 值。并設(shè)置陽性對(duì)照（190μl 洗必泰+BHI 液體培養(yǎng)基+10μl 菌液）、陰性對(duì)照（190μl BHI 液體培養(yǎng)基+10μl 菌液）、空白對(duì)照（200μl BHI 液體培養(yǎng)基），實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

同法確定綠原酸的MIC 值。

5.確定EGCG、綠原酸的MBC 值：選取大于MIC的各濃度溶液，分別吸取10μl 接種于BHI 瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，無細(xì)菌生長的最低濃度即為其MBC 值。

6.確定混合液的MIC 值：在96 孔板上橫排分別加入濃度為 0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008mg/ml EGCG 溶液95μl，縱排分別加入等體積濃度為10、5、2.5、1.25、0.63、0.31mg/ml 綠原酸溶液，兩溶液充分混勻后，每孔分別加入菌液10μl，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，并設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

7.聯(lián)合用藥效果評(píng)價(jià)：通過計(jì)算分級(jí)抑制濃度（FIC）指數(shù)來測(cè)定兩者的抑菌關(guān)系。

FIC＝A 藥聯(lián)用時(shí)MIC/A 藥單測(cè)時(shí)MIC+B 藥聯(lián)用時(shí)MIC/B 藥單測(cè)時(shí)MIC

FIC≤0.5 時(shí)，兩藥為協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1 時(shí)，兩藥為相加作用；1＜FIC＜2 時(shí)，兩藥為無關(guān)作用；FIC≥2 時(shí)，兩藥為拮抗作用。

8.EGCG-綠原酸對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸能力的影響：選取聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)中MIC 以內(nèi)5 個(gè)濃度梯度（即 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32MIC）混合藥液做檢測(cè)，用含1%蔗糖的BHI 培養(yǎng)基二倍稀釋法配置以上5 個(gè)濃度混合藥液，pH 計(jì)調(diào)定初始pH＝7.4，按菌液與藥液1:20（體積分?jǐn)?shù)）比例接種變異鏈球菌，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h 后，離心，pH 計(jì)測(cè)量上清液pH值，計(jì)算培養(yǎng)前后的△pH，并設(shè)置陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 4 次。

9.EGCG-綠原酸對(duì)變異鏈球菌24h 生物膜黏附作用的影響：將變異鏈球菌菌懸液接種于96 孔板中，37℃恒溫培養(yǎng)24h，吸去孔板內(nèi)BHI 培養(yǎng)基，分別加入上述5 個(gè)濃度的混合藥液，恒溫培養(yǎng)24h 后吸去孔板內(nèi)溶液，PBS 漂洗兩次，粘附于孔板底部的細(xì)菌用MTT 法定量測(cè)定，全自動(dòng)酶標(biāo)儀波長490nm檢測(cè)吸光度（opticai density，OD）值，計(jì)算細(xì)菌抑制率，并設(shè)置陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4 次。抑制率＝（陰性對(duì)照組OD 值-實(shí)驗(yàn)組OD 值）/陰性對(duì)照組OD值×100%

10.激光共聚焦顯微鏡觀察混合液對(duì)變異鏈球菌24h 生物膜作用的影響：在激光共聚焦小皿中加入變異鏈球菌菌液，37℃恒溫培養(yǎng)24h，吸去液體培養(yǎng)基，分別加入前述5 個(gè)濃度混合藥液，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h 后，吸去混合藥液，PBS 漂洗兩次，于避光暗室中滴加AO、EB 混合熒光染液200μl，孵育15min 后，PBS 漂洗去除多余染料。用放大倍數(shù)40×10（物鏡×目鏡）激光共聚焦顯微鏡（波長488/543nm）觀察細(xì)菌生物膜。設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組間的數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.EGCG 和綠原酸的MIC 值: 二倍稀釋法抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，EGCG、綠原酸MIC 值分別為0.125mg/ml和5mg/ml。

2.EGCG 和綠原酸的 MBC 值：EGCG、綠原酸的的MBC 值分別為0.5mg/ml（圖1 的b）和 10mg/ml（圖 1 的 A）。

圖1 EGCG（b）和綠原酸（A）的最低殺菌濃度

3.EGCG-綠原酸混合液對(duì)變異鏈球菌生長的影響：EGCG 和綠原酸聯(lián)用時(shí) MIC 值為0.063mg/ml EGCG+1.25mg/ml 綠原酸。根據(jù)公式計(jì)算得到二者聯(lián)用時(shí)的FIC＝0.75，存在相加作用（表1）。

表1 不同濃度EGCG 和綠原酸聯(lián)用對(duì)變異鏈球菌生長的影響

4.EGCG-綠原酸混合液對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸能力的影響：在 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32MIC 各組的△pH值分別 2.465±0.0785、2.598±0.0263、2.683±0.0359、2.760±0.0294、2.835±0.0520（圖 2）；各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 不同濃度EGCG-綠原酸混合液對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸的影響

5.EGCG-綠原酸混合液對(duì)變異鏈球菌24h生物膜黏附作用的影響：選取 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32MIC 5 個(gè)濃度的各組混合液，檢測(cè)其對(duì)變異鏈球菌黏附于96 孔聚苯乙烯培養(yǎng)板上生物膜菌量的影響（厭氧孵育24h）。如表2 所示，隨著藥物濃度的增加生物膜的量（OD 值）逐漸減少，抑制率增加。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 EGCG-綠原酸混合液對(duì)變異鏈球菌24h生物膜的粘附作用效果（）和抑制率

表2 EGCG-綠原酸混合液對(duì)變異鏈球菌24h生物膜的粘附作用效果（）和抑制率

注：*:P＜0.05，vs control group; #：P＜0.05，vs 1/2MIC group.

濃度1/2MIC 1/4MIC 1/8MIC 1/16MIC 1/32MIC對(duì)照組images/BZ_12_2107_2709_2179_2766.png 0.494±0.017*0.604±0.015*#0.661±0.006*#0.787±0.034*#0.865±0.045*#1.331±0.030抑制率（%）62.87 54.66 50.34 40.85 34.99－

6. 激光共聚焦顯微鏡觀察蘆薈苷-綠原酸混合液對(duì)變異鏈球菌24h 生物膜作用的影響：CLSM 觀察顯示，1/32MIC 混合液的圖像由于活菌數(shù)量大于死菌，綠色熒光強(qiáng)度高于紅色熒光強(qiáng)度，同一視野疊加后呈綠色，細(xì)菌多呈塊狀或網(wǎng)狀聚集（圖3 的G），但是密集程度不及陰性對(duì)照組（圖3 的A）。隨著藥液濃度的增加綠色熒光面積逐漸減少，紅色熒光面積逐漸增加，同一視野疊加開始呈現(xiàn)黃綠色/黃色（圖3 的E），細(xì)菌分布稀疏；濃度為1/2MIC 時(shí)，活菌量顯著減少（圖3 的C），而陽性對(duì)照組則顯示極為分散的少量細(xì)菌（圖3 的B）。

圖3 EGCG-綠原酸混合液對(duì)變異鏈球菌24h 生物膜作用的結(jié)果（激光共聚焦掃描顯微鏡，綠色為活菌，紅色為死菌 ×400）

討 論

近年來越來越多的學(xué)者對(duì)茶葉提取物的開發(fā)與應(yīng)用進(jìn)行了大量研究，尤其是其中單體成分的作用，并且取得了一些理想結(jié)果。EGCG 是茶葉提取物中最有生物學(xué)活性的成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎等作用，在很多領(lǐng)域中進(jìn)行了研究與應(yīng)用。有學(xué)者將EGCG 應(yīng)用于齲病預(yù)防與治療的研究中，并報(bào)道一定濃度的EGCG 可以抑制變異鏈球菌生長、黏附及產(chǎn)酸[7]。在一項(xiàng)臨床研究中發(fā)現(xiàn)，使用高濃度綠茶提取物溶液漱口可以明顯降低學(xué)齡前兒童唾液中變異鏈球菌的數(shù)量[8]。本實(shí)驗(yàn)亦對(duì)EGCG 進(jìn)行了變異鏈球菌體外抑菌研究，結(jié)果證明EGCG 對(duì)變異鏈球菌具有明確的抑制作用，0.125mg/ml 濃度EGCG 即可有效抑制變異鏈球菌的體外生長。

綠原酸又稱3-咖啡酰寧酸，是植物金銀花的主要功能性成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等多種效用。有研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸可抑制變異鏈球菌的GTF 活性，使其合成不溶性胞外多糖的能力降低，減少變異鏈球菌對(duì)蔗糖的分解與利用，從而減少牙菌斑生物膜的形成[9]。陳昱敏等對(duì)比了綠原酸溶液與氯己定漱口液對(duì)口腔內(nèi)變異鏈球菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用一定濃度綠原酸溶液漱口可以起到與氯己定漱口液相似的抑菌效果，并且可以改善因長期使用氯己定化學(xué)制劑漱口液導(dǎo)致的味覺改變等癥狀[7]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，兩種或多種藥物配伍應(yīng)用，不但可以達(dá)到單組分藥物應(yīng)用的抑菌作用，而且還可降低每種藥物的使用劑量和副作用，本實(shí)驗(yàn)將EGCG 與綠原酸聯(lián)合應(yīng)用，檢驗(yàn)其抑菌效果，并期望能夠通過降低單種藥物成分的使用濃度來減輕其應(yīng)用時(shí)的副作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.063mg/ml EGCG 與1.25mg/ml 綠原酸聯(lián)合應(yīng)用即可達(dá)到理想的MIC，二者之間可顯示出相加作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)抑菌試驗(yàn)中EGCG 與綠原酸均會(huì)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜造成破壞作用[10，11]，以此來推測(cè)該混合物抑制變異鏈球菌的相加作用亦是因?yàn)槎邔?duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞作用產(chǎn)生了相加作用。

EGCG-綠原酸混合液抑制變異鏈球菌產(chǎn)酸的機(jī)制可能與其抑制細(xì)菌GTF 活性，造成水不溶性胞外多糖的形成減少有關(guān)。本研究在蔗糖環(huán)境下觀察了 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32MIC 共 5 個(gè)濃度梯度混合液對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸的影響[12]，此外也研究了它們對(duì)變異鏈球菌粘附及生物膜形成的影響。我們發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)隨著配伍濃度的降低，變異鏈球菌的△pH 值及OD 值變化增加，表明二者配伍應(yīng)用對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸能力及粘附能力的抑制具有濃度相關(guān)性。有研究表明變異鏈球菌在生物膜狀態(tài)下比在浮游狀態(tài)下有更強(qiáng)的生存能力[13]，因此對(duì)防齲抗菌劑要求不僅要抑制變異鏈球菌浮游菌的生長還要有效減少其生物膜的形成。本實(shí)驗(yàn)中通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)EGCG 和綠原酸聯(lián)合應(yīng)用可影響變異鏈球菌生物膜的形成，不同濃度混合液可以不同程度地抑制生物膜中變異鏈球菌活性，混合液配伍濃度越高其抑菌能力越強(qiáng)。

本研究證明EGCG 和綠原酸聯(lián)合應(yīng)用可對(duì)變異鏈球菌的生長、產(chǎn)酸與粘附具有顯著的抑制作用，而且二者配伍應(yīng)用可降低單組分應(yīng)用時(shí)的抑菌濃度，增強(qiáng)抑菌效果。但是本實(shí)驗(yàn)僅提供了體外抑菌的研究結(jié)果，并未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)機(jī)制方面的研究，EGCG 和綠原酸混合液的抑菌機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究探討。