汪嘉佳，李哲，江繼發(fā)，程瑋，金鳳祥

銅陵市人民醫(yī)院血液內(nèi)科，安徽銅陵 244000

原發(fā)性免疫血小板減少癥（ITP）是臨床中常見(jiàn)的獲得性自身免疫系統(tǒng)綜合征，患者主要表現(xiàn)為皮膚黏膜出血癥狀，部分可表現(xiàn)為消化道的出血和損傷，嚴(yán)重者可發(fā)生顱內(nèi)出血，對(duì)患者的身心健康造成嚴(yán)重的危害［1-2］。目前認(rèn)為ITP的發(fā)病機(jī)制是機(jī)體抗血小板抗體產(chǎn)生后，血小板在單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)破壞中形成介導(dǎo)作用，從而導(dǎo)致患者體液免疫出現(xiàn)異常，最終導(dǎo)致血小板逐漸減少［3-4］。Treg 細(xì)胞與Th17細(xì)胞同屬于T 細(xì)胞亞群，具有低反應(yīng)性與免疫抑制性的特殊免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)自身反應(yīng)性T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)和T 細(xì)胞的活化可產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)還可促進(jìn)某些抑制性細(xì)胞因子的分泌，在外周免疫耐受的維持中發(fā)揮重要作用［5-7］。研究發(fā)現(xiàn)，Treg/Th17失衡與多種免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［8-9］。為此，本研究以成人原發(fā)性ITP 患者為研究對(duì)象，探討外周血Treg 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞百分比及Treg/Th17變化的臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2021年1月我院收治的80例成人原發(fā)性ITP 患者為研究對(duì)象（病例組），其中男37例，女43例；年齡18～65（44. 27 ±11. 35）歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)血栓與止血學(xué)組制定的《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2016年版）》［10］中成人原發(fā)性ITP 診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡18～65 歲，性別不限；首次發(fā)病，入組前未接受相關(guān)治療；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他免疫疾??；合并惡性腫瘤；重要臟器功能不全；合并糖尿病、結(jié)核病、急性細(xì)菌性或病毒性感染；存在糖皮質(zhì)激素治療方案禁忌證；哺乳期、妊娠期婦女。另選取同期入院體檢的80例健康者作為對(duì)照組，其中男35例，女45例；年齡18～63（45. 08 ± 12. 39）歲，血小板計(jì)數(shù)（120～280）×109/L，排除標(biāo)準(zhǔn)同病例組。兩組性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者自愿參加試驗(yàn)并簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療及療效評(píng)估 病例組接受一線的糖皮質(zhì)激素治療方案，口服醋酸潑尼松片（國(guó)藥準(zhǔn)字H33021217，浙江仙琚制藥股份有有限公司）治療，服用劑量1 mg/（kg·d），連續(xù)服用4周后評(píng)估治療效果。按照《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2016年版）》［8］標(biāo)準(zhǔn)：完全反應(yīng)，患者經(jīng)過(guò)4周治療，血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L，且出血癥狀完全消失；有效，患者經(jīng)過(guò)4周治療，血小板計(jì)數(shù)≥30×109/L，且與治療前相比增加2倍及以上，出血癥狀消失；無(wú)效，患者經(jīng)過(guò)4 周治療，血小板計(jì)數(shù)<30×109/L，或與治療前相比增加不足2倍，或仍存在出血情況。血小板計(jì)數(shù)采用五分類(lèi)全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（型號(hào)URIT-5200，廈門(mén)海菲生物技術(shù)股份有限公司）測(cè)定。

1.3 外周血Treg、Th17 細(xì)胞檢測(cè) 于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，分別取對(duì)照組外周血、病例組治療前及治療4周后外周血2 mL。Treg 細(xì)胞檢測(cè)方法：取1mL 外周血置于流式試管內(nèi)，加入肝素鈉抗凝處理，避光條件下孵育20 min；加入溶血素1 mL 溶血，避光靜置5 min，采用2 mL PBS 洗滌細(xì)胞2次，置于流式細(xì)胞儀（型號(hào)ZE5，美國(guó)伯樂(lè)）上測(cè)定Treg 細(xì)胞百分比。Th17 細(xì)胞檢測(cè)方法：取上述培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液600 μL，采用離心機(jī)于2 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心2 min（離心半徑為10 cm），棄上清，向沉淀細(xì)胞內(nèi)加入10 μL CD4-FITC 單抗（美國(guó)Abcam），避光條件下常溫孵育15 min；采用PBS洗滌進(jìn)行洗滌，加入100 μL固定液，避光條件下常溫孵育15 min后，采用PBS二次洗滌、離心，棄上清，向沉淀細(xì)胞內(nèi)加入100 μL 破膜劑，輕柔混勻后避光條件下孵育5 min，加入10 μL Alexa Fluor647IL-17 抗體（美國(guó)Abcam），充分混勻后于避光條件下孵育15 min；采用PBS 第三次洗滌細(xì)胞，離心，棄上清，將沉淀細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀（型號(hào)ZE5，美國(guó)伯樂(lè)）上測(cè)定Th17 細(xì)胞百分比，計(jì)算Treg/Th17。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23. 0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，同組治療前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析外周血Treg、Th17 細(xì)胞百分比及Treg/Th17 對(duì)成人ITP 的診斷效能。P<0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對(duì)照組外周血Treg、Th17 細(xì)胞百分比及Treg/Th17 比較 與對(duì)照組相比，病例組外周血Treg 細(xì)胞百分比降低，Th17 細(xì)胞百分比升高，Treg/Th17降低（P均<0. 05），見(jiàn)表1。

表1 病例組與對(duì)照組外周血Treg、Th17細(xì)胞百分比及Treg/Th17比較（± s）

表1 病例組與對(duì)照組外周血Treg、Th17細(xì)胞百分比及Treg/Th17比較（± s）

組別病例組對(duì)照組t P n 80 80 Treg（%）4. 39 ± 0. 34 6. 14 ± 1. 30 11. 649<0. 05 Th17（%）2. 01 ± 0. 15 1. 34 ± 0. 36 15. 366<0. 05 Treg/Th17 2. 20 ± 0. 25 4. 96 ± 1. 88 13. 016<0. 05

2.2 病例組患者治療前后外周血Treg、Th17 細(xì)胞百分比及Treg/Th17 比較 與治療前相比，病例組治療后外周血Treg 細(xì)胞百分比高，Th17 細(xì)胞百分比低，Treg/Th17高（P均<0. 05），見(jiàn)表2。

表2 病例組治療前后外周血Treg、Th17細(xì)胞百分比及Treg/Th17比較（± s）

表2 病例組治療前后外周血Treg、Th17細(xì)胞百分比及Treg/Th17比較（± s）

觀察時(shí)間治療前治療后t P n 80 80 Treg（%）4. 39 ± 0. 34 5. 48 ± 0. 54 15. 278<0. 05 Th17（%）2. 01 ± 0. 15 1. 62 ± 0. 14 17. 001<0. 05 Treg/Th17 2. 20 ± 0. 25 3. 40 ± 0. 48 19. 832<0. 05

2.3 病例組治療后不同療效患者外周血Treg、Th17細(xì)胞百分比及Treg/Th17比較 見(jiàn)表3。

表3 病例組治療后不同療效患者外周血Treg、Th17細(xì)胞百分比及Treg/Th17比較（± s）

表3 病例組治療后不同療效患者外周血Treg、Th17細(xì)胞百分比及Treg/Th17比較（± s）

注：與有效相比，*P<0. 05；與無(wú)效相比，#P<0. 05。

療效完全反應(yīng)有效無(wú)效FP n 35 34 11 Treg（%）5. 76 ± 0. 45*#5. 35 ± 0. 50#4. 95 ± 0. 30 20. 332<0. 05 Th17（%）1. 54 ± 0. 12*#1. 68 ± 0. 12 1. 75 ± 0. 10 22. 583<0. 05 Treg/Th17 3. 77 ± 0. 41*#3. 20 ± 0. 28#2. 84 ± 0. 25 47. 129<0. 05

2.4 外周血Treg、Th17 細(xì)胞百分比及Treg/Th17 對(duì)ITP 的診斷效能 當(dāng)外周血Treg 細(xì)胞百分比取4. 740% 時(shí)，診斷ITP 的ROC 曲線下面積（AUC）為0. 804，靈敏度為76. 3%，特異度為77. 5%；當(dāng)Th17細(xì)胞百分比取1. 775%時(shí)，診斷ITP的AUC為0. 872，靈敏度為87. 5%，特異度為78. 7%；當(dāng)Treg/Th17 取2. 585 時(shí)，診 斷ITP 的AUC為0. 901，靈 敏 度 為91. 3%，特異度為80. 0%；三者對(duì)ITP 均具有較高的診斷效能，其中Treg/Th17更優(yōu)，見(jiàn)表4。

表4 外周血Treg、Th17細(xì)胞百分比及Treg/Th17對(duì)ITP的診斷效能

3 討論

ITP 可發(fā)生于各年齡段群體，其中男女發(fā)病率無(wú)明顯差異，但育齡期女性略高于同年齡組男性，不同個(gè)體該病的臨床表現(xiàn)存在較大差異［11］。已有研究指出，T淋巴細(xì)胞亞群在ITP免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，產(chǎn)生誘導(dǎo)后引起的T淋巴細(xì)胞活化可導(dǎo)致正常免疫細(xì)胞發(fā)生損傷［12］。Treg細(xì)胞來(lái)源于胸腺的天然性細(xì)胞，對(duì)病原Th1 和Th17 的細(xì)胞增殖有著顯著的抑制作用，可通過(guò)對(duì)外周免疫耐受的維持來(lái)避免其自身免疫及組織的損傷［13］。Th17細(xì)胞作為新的CD4+T 細(xì)胞亞型，其分泌的IL-17 可作為前炎性細(xì)胞因子作用于中性粒細(xì)胞，促使多種細(xì)胞釋放炎性因子，在自身免疫性疾病以及集體防御反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用［14］。研究表明，Treg 細(xì)胞在分化及功能上與Th17細(xì)胞相互拮抗，Th17/Treg細(xì)胞平衡對(duì)維持正常免疫應(yīng)答及防止自身免疫病具有重要意義［15］。

在本研究中，相較于對(duì)照組，病例組外周血Treg細(xì)胞百分比降低、Th17 細(xì)胞百分比升高、Treg/Th17降低，提示由于成人原發(fā)性ITP 患者存在Treg/Th17失衡現(xiàn)象，可用于成人原發(fā)性ITP 的輔助診斷。分析其作用機(jī)制可能如下：Treg 細(xì)胞能夠控制機(jī)體自身免疫反應(yīng)，并且可抑制抗原特異性T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)，當(dāng)Treg 細(xì)胞百分比下降后，機(jī)體免疫抑制功能受到抑制，導(dǎo)致T 細(xì)胞的異常激活、耐受水平降低；而Th17 細(xì)胞百分比上升后，其分泌的促炎因子IL-17 水平隨之上升，炎癥效應(yīng)因子水平增加，促炎作用增加，并可能通過(guò)與其他細(xì)胞因子相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞浸潤(rùn)及組織損傷，參與自身免疫過(guò)程，二者比值失衡后，機(jī)體免疫防御功能及穩(wěn)定維護(hù)作用受損，可能通過(guò)破壞單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)引起血小板減少，最終參與成人原發(fā)性ITP 的發(fā)病過(guò)程［16-17］。徐丹等［18］以86例妊娠期ITP 患者為研究對(duì)象，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其存在Th17/Treg 失衡狀態(tài)；HUA等［19］發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性ITP 患者存在Th17/Treg 失衡，并推測(cè)其可能與CD4+細(xì)胞內(nèi)microRNA 的異常表達(dá)相關(guān)。療效方面，與治療前相比，患者治療后外周血Treg 細(xì)胞百分比升高、Th17 細(xì)胞百分比降低、Treg/Th17 升高，隨著療效的增加此種改善趨勢(shì)更佳明顯，且完全反應(yīng)、有效、無(wú)效間外周血Treg、Th17、Treg/Th17 存在差異，提示此方案可能通過(guò)改善Treg/Th17失衡狀態(tài)，發(fā)揮治療效果。分析其作用機(jī)制如下：ITP 發(fā)病與免疫功能受損、炎癥反應(yīng)相關(guān)，而醋酸潑尼松作為糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物，一方面可有效抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，降低T 淋巴細(xì)胞水平并抑制其向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，改善免疫失衡狀態(tài)；另一方面，醋酸潑尼松可抑制包括Th17 分泌的IL-17在內(nèi)的炎性因子水平、減輕炎癥反應(yīng)，最終發(fā)揮對(duì)ITP 的治療作用，而療效越好的患者此種改善越明顯［20-21］。王穎超等［22］以ITP患兒為研究對(duì)象，得出了與本研究一致的結(jié)論，并推測(cè)Treg/Th17 測(cè)定可用于ITP患者療效的預(yù)測(cè)。

本研究中外周血Treg、Th17細(xì)胞百分比及Treg/Th17 對(duì)ITP 均具有較高的診斷效能，三者的特異度基本相同，Treg/Th17的敏感度最高，診斷效能更優(yōu)，這說(shuō)明聯(lián)合檢測(cè)Treg/Th17 對(duì)提高實(shí)驗(yàn)室診斷ITP具有一定的幫助，在鑒別診斷中具有一定價(jià)值。

綜上所述，成人原發(fā)性ITP 患者外周血Treg 細(xì)胞百分比降低、Th17 細(xì)胞百分比升高、Treg/Th17 降低，且其水平變化與患者治療效果有關(guān)，可用于疾病的輔助診斷及療效輔助評(píng)估。