張潔 祝頌松 姜楠

口腔疾病研究國家重點實驗室國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院正頜及關節(jié)外科，成都610041

鈦及鈦合金因為其優(yōu)良的性能和生物相容性而被普遍應用于牙科領域[1]。然而，其表面特性常導致早期骨結合效果較差，并導致植入失敗[2]。因此研究人員探索了各種改變鈦表面結構/化學的方法，以期改善其早期骨結合效果。目前植入體的表面改性策略主要集中在2個方面：化學改性和微幾何結構的改性。其中最為常見的改性方法有：植入體表面涂層、酸蝕或者噴砂粗化處理、陽極氧化或微弧氧化處理以及生物蛋白修飾等。在各種表面改性方法中，磷酸酸蝕因能將對骨再生十分有利的磷元素引入植入體表面受到了學者們的廣泛關注。研究[3-4]證實，磷酸酸蝕對加速植入體的骨結合有著十分確切的生物學作用。微幾何結構的改性也對植入體的生物活性有著十分重要的影響。從仿生學的角度出發(fā)，因為天然骨便是微納米共存的結構，因此這種結構應該對植入體表面的骨再生更為有利。因此，近年來越來越多的研究[5-6]致力于構建植入體表面的仿生形貌，并且大都取得了令人滿意的效果。但遺憾的是，利用磷酸酸蝕的方法在植入體表面構建梯度仿生形貌至今少有文獻報道，其相關的生物學作用、生物學機制更是值得探究。

本研究利用特殊壓強下堿熱磷酸反應法在純鈦植入體表面制備微納米共存的具備晶體相“磷”的仿生結構，成功地將對成骨有利的磷元素引入植入體表面，提高了植入體的表面能，最為重要的是該表面改性具有微納米共存的仿生結構，初步探究了該表面改性涂層對骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖、黏附以及骨向分化潛能的影響，進而探究其對植入體骨結合的作用。

1 材料和方法

1.1 鈦植入體表面處理及分析

1.1.1 表面涂層制備 將一塊鈦板（純度99.99%，中國寶雞鈦工業(yè)有限公司）加工成直徑5 mm、厚1 mm的圓片狀（用于細胞實驗）和直徑1.5 mm、長10 mm的柱狀（用于動物實驗）。所有鈦樣品分別使用800、1 200和2 000粒度的SiC砂紙拋光成鏡面，隨后分別在丙酮、乙醇和蒸餾水中超聲蕩洗30 min，在真空冷凍干燥機中干燥。

將材料分成2組。第1組材料表面不做任何處理（未處理鈦，cp-Ti），直接備用。第2組材料進行仿生磷酸化表面改性處理，利用特殊壓強下堿熱磷酸反應法在純鈦表面制備出微納米共存的磷酸化涂層，即鈦磷鈦（TiP-Ti）。方法為：將樣品置于2%HPO4和14%H2O2配制的磷酸水溶液中（共200 mL），然后放入襯有特氟龍膜（teflon）的高壓釜，在0.15 MPa、120℃下進行水熱反應24 h，獲得磷酸化改性形貌。室溫下，2組鈦片經(jīng)標準化清洗、鈍化，等離子滅菌備用。

1.1.2 鈦片的檢測 1）表面形貌觀察：使用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察所有樣品的微觀結構。2）表面元素分析：X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）分析涂層晶相結構。3）涂層厚度及粗糙度：使用原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）觀察涂層表面厚度及結構。4）表面能檢測：通過靜態(tài)水接觸角實驗檢測植入材料表面的表面能，使用接觸角測角儀（TL101，Biolin Scientific AB）分析涂層表面自由能和濕潤性。5）涂層與鈦基底的結合強度：通過自動劃痕儀檢測不同植入材料表面涂層的結合強度。

1.2 體外實驗

1.2.1 細胞培養(yǎng) 按照四川大學口腔疾病國家重點實驗室動物研究委員會建立的標準進行細胞分離和培養(yǎng)。取1周齡雄性Sprague-Dawley大鼠的股骨收集BMSCs，將2～4代的細胞用于實驗。

1.2.2 細胞形態(tài)與黏附 細胞孵育2 h后，PBS洗3次，隨后用2.5%戊二醛固定。部分樣本用乙醇溶液梯度脫水（20%，40%，60%，80%，90%和100%），噴金，SEM觀察細胞早期黏附形態(tài)。其余樣本的細胞用0.2%Triton X-100透膜15 min后，利用羅丹明-鬼筆環(huán)肽標記F-肌動蛋白（F-actin）以顯示細胞骨架形態(tài)，室溫孵育30 min，含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）抗熒光萃滅劑封片。采用SEM和共聚焦掃描電子顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察細胞結構和形態(tài)。

1.2.3 細胞增殖能力 在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)滅菌的鈦片，培養(yǎng)1、3、5、7、9 d后，使用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測細胞活力。

1.2.4 細胞分化 堿性磷酸酶（alkaline phospha‐tase，ALP）活性測定用于檢測不同樣品上的細胞分化情況。每孔接種5×104個細胞，隨后在Ti樣品上孵育1、3、7 d。4%多聚甲醛固定，ALP試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）染色并測量其在405 nm處的吸光度值，以確定ALP活性。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應分析（quantita‐tive real-time polymerase chain reaction analysis，qRT-PCR）分別收集與Ti片孵育24、48 h的細胞用于qRT-PCR以評估BMSCs細胞黏附及成骨相關基因表達。檢測整合素β1（integrinβ1）、黏著斑蛋白（Vinculin）、Runt相關轉錄因子-2（Runt-re‐lated transcription factor-2，Runx-2）、Ⅰ型 膠 原（collagen typeⅠ，Col-1）、骨橋蛋白（osteopntin，OPN）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）相關mRNA的表達。GAPDH作為對照。

1.3 體內實驗

1.3.1 植入手術 將12只雌性SD大鼠（3個月大，體重210～230 g）隨機分為A、B組。在其雙側脛骨的近干骺端分別植入cp-Ti與TiP-Ti，縫合，術后3 d給予動物肌肉注射抗生素和鎮(zhèn)痛藥。

1.3.2 micro-CT檢測 術后12周，處死A組大鼠（n=6），取雙側股骨、脛骨。將樣本置于micro-CT系統(tǒng)檢測管內，通過高分辨率μ-CT掃描儀系統(tǒng)（μ-CT 50，Scanco Medical公司，瑞士）進行分析。VOI被定義為植入物周圍的骨部分，選取種植體周圍250μm范圍的環(huán)形區(qū)域為感興趣區(qū)域。檢驗參數(shù)包括：1）骨體積分數(shù)（BV/TV）；2）骨與植入物的接觸百分比（骨結合百分比，%OI）；3）骨小梁數(shù)量（Tb.N）；4）平均骨小梁間隙（Tb.Sp）。

1.3.3 組織學分析 術后12周，處死B組大鼠（n=6），取雙側股骨、脛骨進行未脫鈣處理。使用Lei‐ca DM-RBE顯微鏡（Leica公司，德國）在生長板下方約1 mm的切片上進行組織學評價。分析內容如下。1）骨面積比：整個組織區(qū)域（從植入物表面延伸250μm的環(huán)形區(qū)域）內成熟骨的百分比。2）骨骼與植入物之間的接觸：與植入物界面直接接觸的礦化骨骼的線性百分比。

1.3.4 生物力學測試 對μ-CT掃描的樣品（n=6）進行生物力學測試，以確定極限剪切強度和最大推出力。使用生物力學測試設備（BSC30，銀博科學設備有限公司）以1 mm·min-1的速度檢測極限剪切強度（N·mm-2）和最大推出力（N）。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。所有數(shù)值以均數(shù)±標準差的形式表示，數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析及Bonferroni檢驗。

2 結果

2.1 材料表征

2.1.1 表面形貌 SEM（圖1）顯示：cp-Ti組表面相對光滑，呈淺凹坑狀；TiP-Ti組表面呈草樣結構，其中短纖維束隨機排列形成多孔結構。

圖1 2組表面形貌 SEMFig 1 The surface morphology of 2 groups SEM

2.1.2 表面厚度及表面粗糙度 掃描區(qū)域為5.0μm×5.0μm時，各組鈦片的AFM結果見圖2、表1。cp-Ti組鈦片表面平坦，光滑；TiP-Ti組鈦片表面呈現(xiàn)明顯的類山峰狀，粗糙度為58.65 nm，在納米尺寸上規(guī)律排列，提示樣品表面為納米級形態(tài)。結合圖1，TiP-Ti表面呈現(xiàn)為納米級的3D空間結構與微米級孔隙共存的仿生結構。

表1 2組種植體表面粗糙度指標比較Tab 1 The comparation of surface roughness of 2 groups

2.1.3 表面元素分析 采用XRD對植入材料表面的物相組成進行測量，結果見圖3。TiP-Ti組表面探測到典型的Ti特征峰，同時具有新的衍射峰Ti(HPO4)2·0.5 H2O和Ti3O5峰2種物相，證實磷元素成功摻入TiP-Ti表面。

圖3 TiP-Ti組XRD分析Fig 3 The results of XRD of TiP-Ti group

2.1.4 表面能檢測 靜態(tài)水接觸角實驗結果（圖4）表明，cp-Ti和TiP-Ti組表面靜態(tài)水接觸角（con‐tact angle，CA）分別為79°±5.3°和7°±2.6°（P＜0.05）。Ti P-Ti表面CA值較低，表明其具有較好的潤濕性，這可能有利于蛋白質黏附。

圖4 2組CA實驗Fig 4 CAexperiment of 2 groups

2.1.5 涂層與鈦基底結合強度檢測 TiP-Ti組涂層與鈦基底結合強度的檢測結果見圖5。定量分析結果用涂層首次開裂（Lc1）和完全剝脫（Lc2）時的力的值表示，結果顯示TiP-Ti組與鈦基底結合強度良好，這有利于涂層表面改性在體內發(fā)揮生物學作用。

圖5 TiP-Ti組劃痕實驗后材料表面SEM及定量分析Fig 5 SEM and quantitative analysis of the surface of the material after scratch experiment of Ti P-Ti group

2.2 體外實驗

2.2.1 細胞黏附能力 孵育2 h后，BMSCs在種植體表面上的黏附結果見圖6。cp-Ti組可見少量分散的呈球狀細胞，且有絲足結構。TiP-Ti組可見BMSCs分布更廣，細胞呈現(xiàn)橢圓形，細胞伸展較好，并伴有更清晰的細胞骨架（圖6A），且有明顯連接的偽足結構。黏附相關mRNA表達結果（圖6B）顯示，在TiP-Ti組材料表面，細胞黏附相關的蛋白表達量相對較多。這表明，BMSCs在TiPTi表面具有更好的黏附。

圖6 2組材料表面BMSCs的黏附情況Fig 6 Adhesion of BMSCs on the surface of 2 groups

2.2.2 細胞增殖 MTT結果（圖7）表明，與cp-Ti組相比，TiP-Ti組細胞活力增加（除第1天外，P＜0.05）。這表明，BMSCs在TiP-Ti表面具有更好的增殖能力。

圖7 2組MTT結果Fig 7 MTT assay of 2 groups

2.2.3 細胞分化 ALP活性測定結果（圖8）顯示，TiP-Ti組細胞ALP活性高于cp-Ti組（P＜0.05）。qRT-PCR檢測（圖9）顯示，TiP-Ti組Runx-2、Col-1、OPN、OCN mRNA表達水平均高于cp-Ti組（P＜0.05）。這表明，BMSCs在TiP-Ti表面表現(xiàn)出更好的成骨向分化。

圖8 2組ALP檢測結果Fig 8 The ALP results of 2 groups

圖9 2組BMSCs成骨向分化相關基因的相對表達情況Fig 9 mRNA expression levels of Col-1,Runx-2,OPN,and OCN,detected by qRT-PCR of 2 groups

2.3 體內實驗

術后12周，大鼠創(chuàng)面均已實現(xiàn)愈合，Ti植入物均在骨內保持良好位置。

2.3.1 Micro-CT及組織學分析 Micro-CT檢測結果（圖10）表明，與cp-Ti組相比，TiP-Ti組BV/TV、%OI、Tb.N增加（P＜0.05），Tb.sp降低（P＜0.05）。形態(tài)計量學（圖11）表明，TiP-Ti組骨面積比、骨骼與植入物之間的接觸均高于cp-Ti組，表現(xiàn)出骨愈合效果。這表明，TiP-Ti誘導了與宿主組織的更牢固的界面結合。

圖10 2組micro-CT檢測結果Fig 10 The results of micro-CT of 2 groups

圖11 2組組織學分析Fig 11 Histological analysis of 2 groups

2.3.2 生物力學檢測 生物力學測試結果（表2）表明，TiP-Ti組種植體顯示出更強的機械穩(wěn)定性（P＜0.05）。TiP-Ti組剪切強度超過20 N·mm-2，是cp-Ti的2倍多；最大推出力為182.7 N，是cp-Ti的5倍多。

表2 2組生物力學測試結果比較Tab 2 Comparison of biomechanical test results of 2 groups

3 討論

3.1 微納米共存的仿生結構形成機制及特征

本研究利用特殊壓強下堿熱磷酸反應法（0.15 MPa，120℃）成功地在純鈦植入體表面制備了微納米共存的具備晶體相“磷”的表面仿生結構（TiP-Ti）。有部分學者探究了種植體表面3D結構改性的方法，試圖改善種植體骨結合能力。Sul[7]通過電化學微弧氧化，成功地將P陰離子摻入到了TiO2涂層（孔徑1.3～1.5μm）中，并且報道了該結構具有更強的骨結合效果，但是未提到體外細胞實驗的細節(jié)。Park等[8-9]采用堿熱反應處理鈦氧化物表面，獲得了具有微米級的粗糙形貌，該形貌具有較強的MC3T4-E1細胞附著力、活力和成骨細胞基因表達。本實驗經(jīng)0.15 MPa、120℃特殊溫度壓強下處理獲得了具有晶體相“磷”的微/納米級共存的仿生混合涂層。XRD結果顯示，TiP-Ti表面化學元素主要以Ti(HPO4)2·0.5H2O/Ti3O5晶體相存在。制備該涂層過程中，采用了較低濃度的H3PO4及較高濃度的H2O2，因此溶解的Ti4+與更豐富的H2O2反應形成穩(wěn)定的Ti2O3，與TiO2進一步反應形成Ti3O5[10]，Ti3O5與磷酸根或磷酸氫根離子之間的進一步相互作用形成Ti(HPO4)2·0.5H2O/Ti3O5化合物[11]。這也意味著摻入的P元素呈現(xiàn)高度結晶態(tài)。

SEM觀察表明，TiP-Ti涂層表面形態(tài)呈規(guī)律排列的微米結構，其中短纖維束隨機排列形成多孔結構。AFM觀察到的規(guī)律排列納米級結構，可以證實該涂層為納米級的3D空間結構與微米級孔隙共存的仿生結構。生物材料的表面潤濕性在蛋白質吸附中起著重要作用，進而對細胞的黏附和增殖產生顯著影響[12]。通過靜態(tài)水接觸角實驗來檢測植入材料表面的表面能，結果表明，TiP-Ti表面CA值較低，表明其具有較好的潤濕性，這可能有利于蛋白的黏附。表面劃痕實驗結果顯示，涂層首次開裂和完全剝脫時的力分別為18.5 N和25.8 N，這與文獻[13]報道的涂層改性的表面結合強度結果相符，證實本研究涂層改性與鈦基底結合強度較好，這也為該植入體表面改性技術將來的應用打下了基礎。

3.2 微納米共存的仿生結構對BMSCs生物學行為的影響

本研究結果表明，TiP-Ti表面BMSCs的黏附、增殖與分化高于cp-Ti。在TiP-Ti表面的細胞表現(xiàn)出更明顯連接的偽足，這與其較高的F-actin表達一致。F-actin免疫熒光顯示，黏附在TiP-Ti上的細胞具有更強的熒光強度，顯示出更清晰的細胞骨架結構（圖6A）。細胞黏附情況與潤濕性檢測結果一致（圖4），即TiP-Ti＞cp-Ti，證明了材料表面形態(tài)和潤濕性會直接影響到細胞黏附情況[14-16]。另外，qRT-PCR檢測黏附相關的mRNA結果證實，TiP-Ti表面的細胞整合素β1和Vinculin表達較強。

細胞在鈦片表面培養(yǎng)1、3、5、7、9 d，TiPTi組細胞的增殖率明顯高于cp-Ti組（P＜0.05），這與細胞在TiP-Ti表面具有良好的黏附形態(tài)一致。

間充質干細胞沿成骨細胞譜系的分化是植入物骨結合的關鍵[17]，且該過程受植入物材料表征的影響[9]。磷改性的Ti植入體可以促進BMSCs的分化[9,18]。研究[19-20]顯示，與無定形狀態(tài)的磷酸鹽相比，結晶態(tài)磷酸鹽更有利于BMSCs的分化和骨沉積。然而到目前為止，尚未有研究比較過BM‐SCs在由Ti、Ti氧化物和Ti磷酸鹽組成的材料表面上的分化情況。由于植入物表面黏附的細胞通過激活的相關局部信號從而調控植入體周圍的破骨細胞的活動和骨沉積，因此植入體的表面形貌對BMSCs的成骨向分化也有一定影響[21]。ALP活性測定結果顯示，TiP-Ti組ALP活性顯著高于cp-Ti組（P＜0.05）。mRNA表達水平結果顯示，與cp-Ti組相比，TiP-Ti組中Col-1和Runx-2的表達水平顯著上調，證實TiP-Ti對成骨早期階段有較強的促進作用，這與早期的ALP分析、CLSM觀察結果相符。另一方面，OPN和OCN的mRNA表達水平也顯示，TiP-Ti組表現(xiàn)出較好的促進細胞成骨向分化能力。

3.3 微納米共存的仿生結構對骨結合的影響

體外和體內研究均顯示，TiP-Ti在細胞增殖、黏附、分化以及促進植入物骨結合方面具有較佳的性能。這可能是由植入物表面化學作用（摻有結晶TiP的Ti氧化物）、微/納米級共存的仿生表面形態(tài)以及表面良好親水性的綜合作用所致。另外，在松質骨中存在微米級的孔隙不僅提供了血液循環(huán)和營養(yǎng)供給的途徑，且與新生骨之間形成機械鎖嵌結構，有助于增強生物力學穩(wěn)定性[22]。多孔排列結構可以在一定程度上促進細胞黏附[23]。研究還證實，微米/納米級共存結構可以迅速激活局部免疫反應，刺激細胞跨膜蛋白的黏附和細胞的早期黏附[8,24]，并促進羥磷灰石的沉積和成骨細胞的增殖[25]。

綜上，本研究在Ti植入物表面制備了具有晶體相“磷”的微/納米級共存的仿生混合涂層，以增強其骨結合性能。此外，具有微/納米級共存的TiP-Ti在體外和體內均表現(xiàn)出優(yōu)良的促成骨性能。結果表明，本研究中生產的雜化涂層的表面化學組成及表面形貌均對細胞生物學行為具有明顯的影響，繼而影響植入物的骨結合及生物力學穩(wěn)定性，是一種具有應用前景的植入體表面改性。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。