李海峰，徐仁根，何玉林，陳志軍，張曉軍，李云鋼，張錦明

(1.江西省腫瘤醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，南昌 330029； 2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100853)

11C-膽堿(11C-Choline，11C-CH)在臨床診斷膀胱癌、尿路上皮癌和前列腺癌等方面有著良好應(yīng)用前景[1-6]。目前，臨床研究11C-CH的制備方法主要是C18柱固相合成法和液相合成法等[7-9]，液相合成法的合成時(shí)間較長(zhǎng)，步驟較繁瑣，合成效率較低[10]，不能滿足臨床需求；C18柱固相合成法操作簡(jiǎn)單，制備時(shí)間較短，已在臨床上推廣使用，取得較好的效果，但合成效率不理想[11]。文獻(xiàn)[12]使用LOOP環(huán)法合成11C-CH，LOOP環(huán)管徑較大，反應(yīng)不充分，管壁產(chǎn)品殘留多，合成效率有待提高。本研究對(duì)國(guó)產(chǎn)11C-多功能合成模塊進(jìn)行改進(jìn)，使用管徑較小、比表面積大的聚四氟乙烯LOOP環(huán)(1 mm×0.5 mm×2 m)，尋求在國(guó)產(chǎn)模塊上全自動(dòng)化LOOP環(huán)法合成11C-CH，與C-18柱固相法比較，實(shí)現(xiàn)合成方法簡(jiǎn)單可靠，合成效率高的目的。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

自動(dòng)化11C多功能合成模塊(PET-CM-3H-IT-Ⅰ)：派特(北京)科技有限公司；Endosafe-PTS細(xì)菌內(nèi)毒素快速檢測(cè)儀：USA Charles River公司；分析天平：AB104G型號(hào)，Switzerland Mettler Toledo公司；活度計(jì)：CRC-15R型，USA Capintec公司；分析型HPLC儀、Sep-PakC-18柱、CM柱：美國(guó)Waters公司；無(wú)菌濾膜：Merck Millipore 公司。

1.2 試劑

N,N-二甲基乙醇胺、57% HI、LiAlH4四氫呋喃溶液(1 mol/L)：USA Sigma Aldrich公司；濃硫酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇：AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0.9%生理鹽水：青島華仁藥業(yè)公司；滅菌注射用水：石家莊四藥有限公司；乙腈、丙酮：HPLC級(jí)，USA TEDIA公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 11C-CH3I的合成

參考文獻(xiàn)[10]，液相法制備11C-CH3I：HM-20加速器經(jīng)14N(P, ɑ)11C核反應(yīng)在回旋加速器內(nèi)產(chǎn)生11CO2，氮?dú)庾鳛檩d氣將11CO2傳送到11C-多功能合成模塊，傳送完畢，開啟自動(dòng)化程序，11CO2被N2載帶至反應(yīng)管與0.2 mL四氫鋰鋁的四氫呋喃溶液(1 mol/L)反應(yīng)，加熱并通入N2，除去THF，再加入0.3 mL 57%的氫碘酸，生成的11C-CH3I通入到LOOP環(huán)與前體反應(yīng)。

2.2 產(chǎn)品的制備與純化

前體N,N-二甲基乙醇胺裝于LOOP環(huán)中，11C-CH3I通入到LOOP環(huán)中與前體進(jìn)行反應(yīng)，室溫反應(yīng)1 min，用乙醇溶液將LOOP環(huán)內(nèi)反應(yīng)液帶至CM柱，經(jīng)滅菌注射用水清洗，再用生理鹽水將產(chǎn)品淋洗至無(wú)菌瓶中，自動(dòng)化合成系統(tǒng)圖示于圖1。

V6，V7，V8，V3，V14，V15，V4，V4_0，V2，V1，V9，V10，V13，V11，V11_1，V12—開關(guān)閥；R1，R2，R3，R4—核素活度計(jì)；T0—加熱；H1—注射圖1 11C-CH自動(dòng)化合成系統(tǒng)Fig.1 Auto systhesis of 11C-CH

2.3 合成效率的影響因素

2.3.1溶劑 使用11C-CH前體量100 uL，選擇丙酮、乙腈、乙醇各100 uL及無(wú)溶劑等不同的溶劑條件，比較其合成效率。

2.3.2前體用量 取11C-CH不同前體量(5～300 uL)裝于LOOP環(huán)中，通入在線生成的11C-CH3I，室溫反應(yīng)，尋求合適的前體量。

2.4 產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制

檢查產(chǎn)品外觀，精密pH試紙測(cè)試產(chǎn)品pH，使用Endosafe-PTS細(xì)菌內(nèi)毒素快速檢測(cè)儀檢測(cè)產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素，高效氣相儀檢測(cè)產(chǎn)品有機(jī)溶劑殘留，通過HPLC測(cè)量產(chǎn)品放化純度和比活度：分析產(chǎn)品11C-CH的分析柱為離子交換柱(150 mm×7.8 mm,pH=1～3)，流動(dòng)相硫酸溶液(pH=3.0,0.01 mmol/L)，流速1 mL/min。

3 結(jié)果與討論

3.1 堿量對(duì)11C-CH反應(yīng)的影響

前體N,N-二甲基乙醇胺本身提供堿催化，與11C-CH3I 反應(yīng)生成11C-CH鹽，可以被富集在CM柱上，再用乙醇、水清洗有機(jī)雜質(zhì)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)。整個(gè)合成過程沒有用到無(wú)機(jī)堿，無(wú)機(jī)堿的存在會(huì)破壞11C-CH鹽的生成而不易富集，因此，采用緩沖溶液調(diào)節(jié)產(chǎn)品pH。

3.2 溶劑

反應(yīng)溶劑對(duì)合成效率影響的結(jié)果列于表1。由表1結(jié)果可知，乙腈、丙酮、乙醇溶劑中的反應(yīng)效率均低于無(wú)溶劑，無(wú)溶劑反應(yīng)更適合LOOP環(huán)法合成11C-CH，本研究認(rèn)為丙酮、乙腈、乙醇不適合LOOP環(huán)法，合成11C-CH時(shí)選用無(wú)溶劑較好。

表1 溶劑對(duì)合成的影響Table 1 Effect of solvent on the synthesis

11C-CH的前體N,N-二甲基乙醇胺與11C-CH3I發(fā)生的是類似季銨鹽反應(yīng)，N,N-二甲基乙醇胺本身為液體且極性較強(qiáng)，既可以做堿催化，也可以做溶劑，反應(yīng)前體的濃度較高，更有利于取代反應(yīng)的進(jìn)行；加入不同的溶劑時(shí)，底物的反應(yīng)濃度減小，不利于反應(yīng)的進(jìn)行。本研究采用11C-CH的前體本身為溶劑的LOOP環(huán)法來(lái)制備11C-CH。

季銨鹽具有鹽的性質(zhì)，易溶于水而不易溶于非極性有機(jī)溶劑，而在加熱時(shí)易分解為叔胺和鹵代烷，熔點(diǎn)為270～272 ℃。季銨鹽與強(qiáng)堿如KOH、NaOH等作用得到含有季銨堿的平衡混合物。如果有醇類溶液，由于堿金屬的鹵化物難溶于醇，能將反應(yīng)進(jìn)行到底。季銨堿的堿性較強(qiáng)，不宜直接用于臨床研究。合成反應(yīng)中，11C-CH前體與11C-CH3I發(fā)生的是SN2反應(yīng)，受溶劑影響較大，溶劑極性越大，越有利于SN1反應(yīng)，而對(duì)SN2反應(yīng)不利。SN2反應(yīng)過程中，由原來(lái)電荷比較集中的親核試劑變成電荷比較分散的過渡態(tài)，溶劑極性的增加使電荷集中的親核試劑溶劑化，降低反應(yīng)效率。同時(shí)反應(yīng)物濃度越高越有利于反應(yīng)進(jìn)行，在這幾類反應(yīng)溶劑中，無(wú)溶劑反應(yīng)合成效率最高，因而，本研究選用無(wú)溶劑進(jìn)行反應(yīng)。

3.3 前體用量

前體用量對(duì)11C-CH效率的影響示于圖2。11C-CH的前體本身既可以做堿催化，也可以做溶劑，11C-CH的前體量過小，N,N-二甲基乙醇胺不能有效的捕獲11C-CH3I，不利于反應(yīng)進(jìn)行；本研究使用的LOOP環(huán)可容納的體積為1.2 mL左右，11C-CH的前體量過大，并不會(huì)提升合成效率，而且有可能部分前體隨著氮?dú)饬鬟M(jìn)入廢液，造成前體浪費(fèi)。本研究的反應(yīng)為類似季銨鹽的反應(yīng)，其合成效率與前體濃度呈正相關(guān)，提高前體濃度可提升合成效率；但前體量過大會(huì)造成化學(xué)純度降低，同時(shí)浪費(fèi)前體。為了保證合成效率、控制產(chǎn)品中前體含量，同時(shí)降低成本，選擇11C-CH前體用量60～150 uL為宜。

圖2 前體量對(duì)11C-CH合成效率的影響Fig.2 Effect of the precursor on the synthesis efficiency of 11C-CH

3.4 自動(dòng)化合成及質(zhì)量控制

優(yōu)化11C-CH自動(dòng)化合成條件為：自動(dòng)合成器LOOP環(huán)中裝有60～150 uL的11C-CH前體N,N-二甲基乙醇胺，通入11C-CH3I，LOOP環(huán)處放射性計(jì)數(shù)穩(wěn)定后，室溫靜置反應(yīng)；打開V9、V13，用8 mL乙醇溶液將LOOP環(huán)內(nèi)的反應(yīng)液帶至CM柱，打開V10、V13，用10 mL水清洗產(chǎn)品，最后打開V11、V12，用8 mL生理鹽水將產(chǎn)品從CM柱上洗脫，經(jīng)無(wú)菌濾膜進(jìn)入收集瓶中。11C-CO2傳至LOOP環(huán)后，開啟自動(dòng)合成程序，從11C-CO2到取代反應(yīng)、純化至終產(chǎn)品，總計(jì)用時(shí)10 min。對(duì)產(chǎn)品抽檢進(jìn)行質(zhì)量控制，終產(chǎn)品的外觀、pH、HPLC檢測(cè)放化純度、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)、氣相色譜儀檢測(cè)溶劑殘留等質(zhì)量控制結(jié)果均符合靜脈注射要求，并與C18柱固相法進(jìn)行比較，結(jié)果列于表2。

3.5 LOOP環(huán)法與C18柱固相法的比較

目前，臨床上制備11C-CH的方法主要是C18柱固相合成法和液相合成法。1984年Diksic等[13]報(bào)道了11C-膽堿的合成，利用N,N-二甲基乙醇胺在100 ℃加熱條件下與11C-CH3I反應(yīng)5 min，再用陽(yáng)離子交換樹脂純化，經(jīng)高壓液相色譜(HPLC)純化后得到11C-膽堿。產(chǎn)品需經(jīng)加熱反應(yīng)、HPLC純化后使用，此合成方法操作繁雜，不便于臨床推廣使用。Hara等[9]對(duì)Diksic制備方法進(jìn)行了改進(jìn)，合成過程仍需要加熱反應(yīng)、HPLC純化得到11C-膽堿，不能滿足臨床需求。

Pascali等[8]采用C18柱固相合成法制備11C-膽堿，前體藥N,N-二甲基乙醇胺與11C-CH3I在C18柱上反應(yīng)，再將粗產(chǎn)品吸附在離子交換柱CM柱上，進(jìn)行簡(jiǎn)單純化得到11C-膽堿。此C18柱固相合成法簡(jiǎn)化了繁瑣的合成過程，減少加熱反應(yīng)、HPLC純化等步驟，有利于臨床推廣使用，但其自動(dòng)化程度不高，增加了合成時(shí)間。張錦明等[10，14]在Pascali C18柱固相合成法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，將前體N,N-二甲基乙醇胺預(yù)裝于C18柱上，省去再裝載步驟，同時(shí)將注射器加淋洗液方法改成以氮?dú)饬鳛閯?dòng)力，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化合成11C-膽堿，更有利于臨床應(yīng)用，但合成效率一般。何山震等[11]通過優(yōu)化標(biāo)記的反應(yīng)條件，以提高標(biāo)記產(chǎn)率和生產(chǎn)的穩(wěn)定性，但合成產(chǎn)率有待提高。龍婷婷等[15]經(jīng)過工藝優(yōu)化，使用自制的Light C18 柱，使11C-膽堿的標(biāo)記產(chǎn)率得到較大提升，具有一定的臨床意義，在臨床推廣使用過程中，應(yīng)保證自制的Light C18 柱安全性。高志麒等[16]將PET-CS-Ⅰ合成模塊小型化，使其體積縮小80%，合成模塊運(yùn)行穩(wěn)定，合成效率和質(zhì)量同原模塊無(wú)差，且縮短傳輸管道后，管道內(nèi)殘留減少，而改造后模塊比較專一化，不利于開發(fā)更多放射性藥物合成的用途。張政偉等[8]嘗試LOOP環(huán)法合成11C-CH，其自制LOOP環(huán)管徑較大，反應(yīng)不充分，管壁產(chǎn)品殘留多，合成效率受到影響。

本研究使用LOOP環(huán)法合成11C-CH，尋求一種簡(jiǎn)單可靠、合成效率高、全自動(dòng)合成11C-膽堿的方法。先對(duì)國(guó)產(chǎn)11C-多功能合成模塊進(jìn)行改進(jìn)，使用的LOOP環(huán)材料為聚四氟乙烯。本研究?jī)?yōu)化了11C-CH的LOOP環(huán)法合成條件，并與常用的C18柱固相合成法進(jìn)行比較，其合成效率明顯提高，結(jié)果示于圖3；兩種方法合成結(jié)果具體比較列于表3。

表3 11C-CH的合成結(jié)果Table 3 Results of synthesis of 11C-CH

改進(jìn)后的LOOP 環(huán)法制備11C-CH，可有效提高合成效率，保證產(chǎn)品質(zhì)量：1) LOOP 環(huán)法制備11C-CH過程中，LOOP 環(huán)可以重復(fù)、多次使用，同時(shí)減少了Sep-PakC-18柱的使用量，降低生產(chǎn)藥物合成成本；2) LOOP環(huán)，管徑較小，比表面積大，有利于11C-CH3I與前體充分反應(yīng)，同時(shí)管壁產(chǎn)品殘留較少，合成效率提高，產(chǎn)品的產(chǎn)量大大提高；3) LOOP 環(huán)法還應(yīng)用于制備11C-乙酸鹽、11C-蛋氨酸、11C-carfentanil等藥物的研究，擴(kuò)展了制備方法使用范圍。

LOOP 環(huán)法制備11C-CH也有一定的局限性，產(chǎn)品制備后需要對(duì)LOOP環(huán)進(jìn)行及時(shí)清洗，管壁殘留反應(yīng)液可能會(huì)影響下次產(chǎn)品合成效率；LOOP環(huán)最佳重復(fù)使用次數(shù)也有待研究。

4 結(jié)論

本研究采用LOOP環(huán)法合成11C-CH，并優(yōu)化了11C-CH的合成條件。采用前體N,N-二甲基乙醇胺本身做反應(yīng)溶劑，同時(shí)提供堿催化，反應(yīng)前體的濃度較高，更有利于取代反應(yīng)的進(jìn)行；確定11C-CH前體的使用量為60～150 uL；與文獻(xiàn)報(bào)道的LOOP環(huán)法及C18柱固相合成法相比，本研究的LOOP環(huán)法合成產(chǎn)量有較大提高；縮短了制備終產(chǎn)品所需的時(shí)間；減少了C-18柱的使用量，LOOP環(huán)可以重復(fù)、多次利用，降低了生產(chǎn)成本；LOOP 環(huán)法還應(yīng)用于11C-乙酸鹽、11C-蛋氨酸等藥物研究，擴(kuò)展了制備方法使用范圍；LOOP環(huán)法制備11C-CH的合成效率提高至(72.16±2.96)%(n=19,11C-CH3I未校正效率)；優(yōu)化條件后合成的11C-CH質(zhì)量控制結(jié)果符合靜脈注射要求。