王文平，熊英梅，陳賽浙，侯強(qiáng)川，劉忠軍，郭 壯,

（1.湖北文理學(xué)院，湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北襄陽(yáng) 441053；2.湖北堯治河楚翁泉酒業(yè)有限公司，湖北襄陽(yáng) 441600；3.襄陽(yáng)市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北襄陽(yáng) 441053）

米酒曲通常是在特定的生態(tài)環(huán)境內(nèi)，用成曲在開(kāi)放體系中培養(yǎng)生產(chǎn)而成，含有豐富的微生物種類和酶系[1]。米酒曲在米酒發(fā)酵過(guò)程中起發(fā)酵和糖化生香作用，并最終決定了成品酒的產(chǎn)率和品質(zhì)風(fēng)味[2]。米酒曲中主要存在霉菌、酵母菌和細(xì)菌3個(gè)微生物類群，其中霉菌可降解淀粉和發(fā)酵糖類等物質(zhì)，酵母菌可將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成酒精，而細(xì)菌則賦予米酒獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)[3]。按照傳統(tǒng)方式制作的米酒曲受“母種”質(zhì)量的影響較大，加之季節(jié)氣候、生產(chǎn)和地理環(huán)境等綜合因素的影響，故而米酒曲的質(zhì)量參差不齊，且容易混入產(chǎn)毒性的菌株[4]。蔡海鶯等[5]通過(guò)對(duì)12種甜米酒酒曲細(xì)菌類群進(jìn)行分離鑒定和測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其含有大量芽孢桿菌（Bacillus）、少量的病原菌和腐敗菌。

近年來(lái)，以MiSeq等第二代高通量測(cè)序技術(shù)為代表的分子生物學(xué)手段被廣泛應(yīng)用于米酒[6]、泡菜[7]和臭豆腐[8]等發(fā)酵食品微生物群落結(jié)構(gòu)的解析中，在非優(yōu)勢(shì)和不可培養(yǎng)微生物類群檢測(cè)方面具有較大優(yōu)勢(shì)，有效彌補(bǔ)了傳統(tǒng)純培養(yǎng)方式的不足。本研究以采集自廣西壯族自治區(qū)南寧市和湖北省孝感市的米酒曲為研究對(duì)象，在采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用BugBase軟件對(duì)其細(xì)菌類群的表型進(jìn)行分析，以期為后續(xù)米酒品質(zhì)和安全性的提升提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

廣西壯族自治區(qū)南寧市米酒曲樣本 分別采集自淡村農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（108°31′E，22°78′N）、瑯東農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（108°38′E，22°82′N）、仙 葫 農(nóng) 貿(mào) 市 場(chǎng)（108°44′E，22°81′N）；湖北省孝感市米酒曲樣本 分別采集自大東門(mén)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（113°92′E，30°92′N）、嚴(yán)橋市場(chǎng)（113°94′E，30°94′N）。每個(gè)地區(qū)采集米酒曲樣本10個(gè)，合計(jì)采集20個(gè)；所有米酒曲樣本均以糯米為原料制作而成，部分樣本中含有辣蓼草等中草藥；基因組提取試劑盒 德國(guó)QIAGEN公司；Fast-Pfu Fly DNA Polymerase、FastPfu Fly DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTPs Mix 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

vetiri梯度基因擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI公司；MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Nano Drop公司；R930機(jī)架式服務(wù)器 美國(guó)DELL公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 宏基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增及Illumina高通量測(cè)序 取1.0 g研磨碎的米酒曲樣本使用DNA提取試劑盒進(jìn)行宏基因組DNA提取，按照Wang等[9]方法進(jìn)行16S rRNA V3~V4區(qū)擴(kuò)增，合格的PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用MiSeq PE300平臺(tái)測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 參照Wang等[10]的方法對(duì)序列進(jìn)行拼接和質(zhì)控，使用QIIME（v1.9.1）平臺(tái)[11]對(duì)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多樣性評(píng)價(jià)，使用PyNAST[12]將序列對(duì)齊，使用UCLUST兩步法建立操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU）[13]，使用SILVE數(shù)據(jù)庫(kù)[14]、Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)[15]和RDP（Ribosomal Database Project，Release 11.5）數(shù)據(jù)庫(kù)[16]確定細(xì)菌分類學(xué)地位。

1.2.3 核酸登錄號(hào) 本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫(kù)，ID號(hào)為mgp97489。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用R軟件的ggpubr包和ggplot2包繪制香農(nóng)指數(shù)（Shannon Index）、辛普森指數(shù)（Simpson Index）和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)（Observed Species）的小提琴圖，使用柱形圖評(píng)估米酒曲中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)和屬的相對(duì)含量及其分布，采用威爾科克森符號(hào)秩（Wilcoxon）檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，基于加權(quán)和非加權(quán)距離主坐標(biāo)分析多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）解析2個(gè)地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群的β多樣性，使用R軟件的UpSetR包基于OTU水平分析不同樣本間OTU的分布，將OTU矩陣與樣本的分類信息上傳至BugBase網(wǎng)站（https://bugbase.cs.umn.edu/）進(jìn)行表型預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群α和β多樣性的比較分析

本研究采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)20個(gè)米酒曲樣本進(jìn)行測(cè)序，共得到高質(zhì)量序列686478條，平均每個(gè)樣本34324條。香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)是評(píng)價(jià)α多樣性的重要指標(biāo)。兩個(gè)地區(qū)米酒曲樣本的α多樣性結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，南寧地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群的香農(nóng)指數(shù)顯著低于孝感地區(qū)（P<0.05），但兩者的辛普森指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)并無(wú)顯著性差異（P>0.05）。由此可見(jiàn)，南寧地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群的多樣性偏低。

圖1 不同地區(qū)米酒曲香農(nóng)指數(shù)（A）、辛普森指數(shù)（B）和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)（C）α多樣性指標(biāo)比較分析Fig.1 Comparative analysis of α diversity indexes including Shannon index (A), Simpson index (B) and the number of observed species (C) of rice wine koji from different regions

本研究進(jìn)一步對(duì)2個(gè)地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群的β多樣性進(jìn)行了解析，結(jié)果如圖2所示。

由圖2A可知，雖然2個(gè)地區(qū)的米酒曲樣本在空間排布上存在部分交疊現(xiàn)象，但整體呈現(xiàn)分離趨勢(shì)，經(jīng)MANOVA檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2個(gè)地區(qū)米酒曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著（P<0.05）。由圖2B可知，雖然2個(gè)地區(qū)樣本在空間排布上亦呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢(shì)，其中南寧地區(qū)樣本聚集為三簇，而孝感地區(qū)聚集為兩簇，但經(jīng)MANOVA檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者差異并不顯著（P>0.05）。由此可見(jiàn)，2個(gè)地區(qū)米酒曲蘊(yùn)含細(xì)菌類群的種類具有相似性，但其豐度可能存在一定差異。鑒于上述分析結(jié)果，本研究進(jìn)一步在分類學(xué)地位“門(mén)”和“屬”水平上對(duì)2個(gè)地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群進(jìn)行了比較分析。

圖2 基于加權(quán)（A）和非加權(quán)（B）UniFrac距離的主坐標(biāo)分析Fig.2 Principal coordinate analysis based on weighted (A) and unweighted (B) UniFrac distance

2.2 不同地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群門(mén)、屬結(jié)構(gòu)分析

南寧和孝感地區(qū)米酒曲相對(duì)含量大于1.0%細(xì)菌門(mén)的構(gòu)成如圖3所示。

由圖3可知，南寧地區(qū)米酒曲中平均相對(duì)含量>1.0%的細(xì)菌門(mén)為Firmicutes（厚壁菌門(mén)，94.58%）和Proteobacteria（變形菌門(mén)，5.14%），孝感地區(qū)為Firmicutes（厚壁菌門(mén)，83.01%）、Proteobacteria（變形菌門(mén)，15.15%）和Cyanobacteria（藍(lán)細(xì)菌，1.07%）。由圖3可知，兩個(gè)地區(qū)的米酒曲樣本中隸屬于Firmicutes和Proteobacteria的細(xì)菌類群含量差異顯著（P<0.05）。相對(duì)含量>1.0%的細(xì)菌屬及其顯著性分析如圖4所示。

圖3 不同地區(qū)米酒曲相對(duì)含量>1.0%的細(xì)菌門(mén)及顯著性分析Fig.3 Bacterial phyla with relative abundance >1.0% of rice wine koji from different regions and their significance analysis

由圖4可知，南寧地區(qū)米酒曲中平均相對(duì)含量>1.0%的細(xì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus（乳桿菌屬，62.03%）、Weissella（魏斯氏菌屬，16.29%）、Lactococcus（乳球菌屬，9.74%）、Pediococcus（片球菌屬，2.64%）、Leuconostoc（明串珠菌屬，2.36%）、Salmonella（沙門(mén)氏菌屬，2.28%）和Gluconobacter（葡糖桿菌屬，1.45%），孝感地區(qū)米酒曲為Weissella（魏斯氏菌屬，50.14%）、Lactococcus（乳球菌屬，15.42%）、Lactobacillus（乳桿菌屬、5.08%）、Pediococcus（片球菌屬，4.55%）、Leuconostoc（明串珠菌屬，3.07%）、Enterobacter（腸桿菌屬，2.88%）、Macrococcus（巨型球菌屬，2.86%）、Staphylococcus（葡萄球菌屬，2.08%）、Acinetobacter（不動(dòng)桿菌屬，1.43%）、Salmonella（沙門(mén)氏菌屬，1.41%）和Acetobacter（醋酸桿菌屬，1.11%）。由此可見(jiàn)，南寧地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群以Lactobacillus為主，而孝感地區(qū)以Weissella為主，經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述兩個(gè)屬在不同地區(qū)米酒曲中的相對(duì)含量差異均極顯著（P<0.001）。除此之外，孝感地區(qū)米酒曲中Enterobacter的相對(duì)含量高度顯著偏高（P<0.01）。由此可見(jiàn)，雖然同一細(xì)菌屬在兩個(gè)地區(qū)米酒曲中均存在，但其相對(duì)含量存在較大差異，這也與圖2得到的結(jié)論一致。

圖4 不同地區(qū)米酒曲相對(duì)含量>1.0%的細(xì)菌屬及顯著性分析Fig.4 Bacterial genera with relative abundance >1.0% of rice wine koji from different regions and their significance analysis

乳酸菌能夠產(chǎn)生乳酸菌素等物質(zhì)，在米酒的發(fā)酵過(guò)程中能夠抑制雜菌的生長(zhǎng)[17]。米酒酸味的主要來(lái)源是乳酸菌產(chǎn)生的乳酸，而乳酸和乙醇反應(yīng)生成酯類是米酒主要的風(fēng)味來(lái)源，同時(shí)在乳酸菌的代謝過(guò)程中產(chǎn)生乙酰和雙乙酰，賦予米酒特殊的風(fēng)味[18]。Jiao等[19]采用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)對(duì)米酒細(xì)菌類群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，參與發(fā)酵的乳酸菌多樣性越高則米酒的感官特性酒越好，因而在米酒發(fā)酵過(guò)程中提高乳酸菌的多樣性有利于提高米酒的感官品質(zhì)。Lactobacillus和Weissella均為乳酸菌，向凡舒研究指出Lactobacillus fermentum（發(fā)酵乳桿菌）、Lactobacillus agilis（能動(dòng)乳桿菌）和Lactococcus lactis（乳酸乳球菌）為湖北省孝感地區(qū)米酒中優(yōu)勢(shì)乳酸菌，Weissella cibaria（食竇魏斯氏乳酸菌）、Lactobacillus johnsonii（約漢遜氏乳桿菌）和Lactobacillus brevis（短乳桿菌）為四川省成都地區(qū)米酒中優(yōu)勢(shì)乳酸菌，不同地區(qū)米酒中乳酸菌的類群存在一定的差異[20]。由此可見(jiàn)，米酒和米酒曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群均為乳酸菌，乳酸菌的類群構(gòu)成對(duì)米酒的風(fēng)味品質(zhì)形成影響較大。

2.3 基于OTU水平不同地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群分析

經(jīng)過(guò)100%和97%相似度進(jìn)行OTU劃分后共得到3366個(gè)OTU，樣本中的OTU分布結(jié)果如圖5所示。

圖5 OTU在不同樣本中的分布Fig.5 Distribution of OTUs in different samples

本研究發(fā)現(xiàn)僅有1個(gè)OTU在所有米酒曲樣本中均存在，隸屬于Weissella，其在南寧和孝感地區(qū)米酒曲中的平均相對(duì)含量分別為1.35%和8.77%，地區(qū)之間差異并不顯著（P>0.05）；有2個(gè)OTU在19個(gè)樣本中存在，分別隸屬于Staphylococcus和Pediococcus，累計(jì)平均相對(duì)含量為3.16%；有6個(gè)OTU在18個(gè)樣本中存在，隸屬于Lactobacillus、棒形桿菌屬（Clavibacter）和Weissella，累計(jì)平均相對(duì)含量為34.09%。有1085個(gè)OTU僅存在一個(gè)樣本中，包含序列條數(shù)僅有13419條，僅占所有序列條數(shù)的2.00%，但并沒(méi)有OTU僅存在某一地區(qū)所有米酒曲中。由此可見(jiàn)，南寧和孝感地區(qū)的米酒曲雖然各自含有少量獨(dú)特的細(xì)菌類群，但更多的是共有大量的細(xì)菌類群。

2.4 不同地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群表型結(jié)果分析

將OTU矩陣與樣本的分類信息上傳至BugBase網(wǎng)站進(jìn)行表型預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，南寧地區(qū)米酒曲中革蘭氏陽(yáng)性菌含量高度顯著高于孝感地區(qū)（P<0.01），而在氧化脅迫耐受、生物膜形成、革蘭氏陰性以及兼性厭氧方面呈現(xiàn)出高度顯著的相反趨勢(shì)（P<0.01）。雖然兩個(gè)地區(qū)米酒曲中均存在一定數(shù)量的致病菌，但是南寧地區(qū)米酒曲中致病菌的致病潛力要高度顯著低于孝感地區(qū)（P<0.01）。農(nóng)戶家自制的米酒曲方式較為傳統(tǒng)，且制作方式較為開(kāi)放，環(huán)境中的病原菌或其他微生物混入米酒曲之中可能造成米酒曲的污染，因而對(duì)米酒曲的制作方式進(jìn)行規(guī)范化，保持環(huán)境衛(wèi)生和篩選優(yōu)良特性的發(fā)酵菌株對(duì)于提升米酒的品質(zhì)和安全性均具有積極意義。

3 結(jié)論

南寧地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群以Lactobacillus為主，而孝感地區(qū)以Weissella為主，且南寧地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群的多樣性偏低。雖然南寧和孝感地區(qū)米酒曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯的差異，但這種差異主要是由于同一細(xì)菌類群在2個(gè)地區(qū)樣本中的含量不同導(dǎo)致的，每個(gè)地區(qū)米酒曲中并不含有太多獨(dú)特的細(xì)菌類群。