顧熾明，李 越，李銀水，謝立華，沈欣杰，李小勇，秦 璐，廖 星

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，湖北武漢 430062）

磷是植物生長必需的礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用磷肥能顯著提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，對世界糧食增產(chǎn)起到重要作用[1]。根據(jù)相關(guān)報道，由于磷素容易被土壤固定，形成難溶性的磷酸鹽，導(dǎo)致其生物有效性降低，作物對磷肥的利用率降低[2]，我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中磷肥的利用率大約為15%左右[3]。為了滿足日益增長的人口對糧食的需求，生產(chǎn)中常通過多施肥來解決土壤缺磷和提高作物單產(chǎn)。但大量施用磷肥，不但增加了生產(chǎn)成本，而且長期施用磷肥，使得PO43-離子與土壤中的Fe、Al 等金屬離子結(jié)合，形成不能被植物吸收的絡(luò)合物，這既降低了磷肥的利用率，又容易造成環(huán)境污染[4]。

中國農(nóng)田土壤全磷含量不低，但有效磷含量偏低，農(nóng)田土壤生物有效態(tài)磷素缺乏現(xiàn)象十分普遍[5]。磷在土壤中的大量累積與其生物有效性低是土壤磷素養(yǎng)分的主要特征，已成為限制土壤生產(chǎn)力及威脅水體環(huán)境安全的主要因子之一。如何提高磷素的有效性進而促進作物對磷素的吸收利用效率，是我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展面臨的重大科學(xué)問題[6-8]。近年來我國冬閑田的面積逐年增加，化肥使用導(dǎo)致的環(huán)境問題以及耕地質(zhì)量下降問題日益突出，綠肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的推廣和應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注[9]。種植符合輪作制度習(xí)慣的冬季綠肥，不僅可以緩解南方部分省份“稻-稻-油”三熟制帶來的季節(jié)緊張，降低冬閑田面積，有效利用冬閑田的光、溫、水、土資源，同時生產(chǎn)大量優(yōu)質(zhì)有機肥，翻壓還田后還可達到改善土壤磷素養(yǎng)分的生物有效性，增強土壤磷素供應(yīng)能力的目的。

研究表明應(yīng)用綠肥可以顯著提高作物對土壤磷素養(yǎng)分的吸收利用。這主要是因為綠肥腐解過程中會產(chǎn)生大量有機酸陰離子，有機酸陰離子一方面可以促進土壤礦物風(fēng)化和土壤形成，另一方面降低土壤對磷素的固持，提高土壤養(yǎng)分的溶解度和有效性，對土壤難溶性磷素的活化有很好的促進作用[10-13]。莊正等[14]研究發(fā)現(xiàn)有機酸陰離子如草酸陰離子可有效提高紅壤中磷素的生物有效性。有機酸對難溶性磷酸鹽的影響與其對各種金屬的絡(luò)合能力有關(guān)[15]，有機酸陰離子廣泛存在于土壤中，對土壤的結(jié)構(gòu)肥效和營養(yǎng)元素的生物可利用性起到了決定性作用[16]。綠肥還田后腐解，植物根系的分泌物或土壤有機質(zhì)分解和微生物代謝的產(chǎn)物中均含有多種有機酸陰離子。同時，由于綠肥腐解過程中為微生物提供大量的碳源和氮源，使得微生物活性較高，微生物群落結(jié)構(gòu)也較豐富，因此對土壤磷素的生物活化作用也很強烈，進而提高土壤磷素有效性。Egle等[17]研究發(fā)現(xiàn)羽扇豆在不同缺磷條件下根系釋放的有機酸陰離子主要為蘋果酸和琥珀酸陰離子。Zhang等[18]的研究表明肥田蘿卜在缺磷條件下蘋果酸和琥珀酸陰離子的釋放量分別增加了15和60倍。此外，缺磷脅迫還能促進紫云英分泌蘋果酸、草酸和琥珀酸等有機酸陰離子，顯著增加對難溶性磷的活化效果[19]。然而，目前有關(guān)綠肥影響土壤磷素有效性的研究，多集中在上述研究綠肥根系分泌有機酸陰離子對土壤磷素有效性的影響，關(guān)于不同綠肥翻壓腐解過程中對土壤中難溶態(tài)磷 (磷酸鋁和磷酸鐵) 活化的影響差異及其影響機理還有待進一步研究。本試驗選取常見的6種綠肥作物為供試材料，通過室內(nèi)模擬試驗方法，研究綠肥翻壓還田后腐解過程釋放的有機酸組分差異，同時對不同綠肥腐解液對酸性土壤難溶性磷素(磷酸鋁和磷酸鐵) 的活化能力進行了定量化分析，并分析了不同綠肥腐解液有機酸組分差異與其磷活化能力高低之間的相關(guān)關(guān)系，本研究可為綠肥在我國的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為6種綠肥作物，包括雙低甘藍型油菜綠肥 (品種為自主選育品種‘中油肥1號’，簡稱雙低甘，DLR)，雙高甘藍型油菜綠肥 (品種為自主選育品系，簡稱雙高甘，DHR)，芥菜型油菜綠肥(品種為自主選育品系，簡稱芥油，BJ)，紫云英 (品種為‘余江大葉’，MV)，二月蘭 (品種為市售種，OV)，肥田蘿卜 (品種為自主選育品系‘RS003’，簡稱肥蘿，R)。所有試驗材料均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所江西省進賢試驗基地稻綠肥輪作試驗的綠肥小區(qū)，所有綠肥作物的施肥水平和管理措施一致，于3月底在不同綠肥作物盛花期取全株樣。供試磷酸鋁 (A l P O4，A l-P) 和磷酸鐵(FePO4·2H2O，F(xiàn)e-P) 均為分析純化學(xué)試劑，生產(chǎn)廠家為上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗測定項目與方法

1.2.1 土壤浸提液的制備 土壤浸提液制備所用的土壤取自綠肥作物取樣地的冬閑小區(qū)0—20 cm土層，土壤類型為磚紅壤。取10 g新鮮土壤于燒杯中，加入50 mL純水，用玻璃棒攪拌5 min 過濾取上清液，現(xiàn)制現(xiàn)用。

1.2.2 綠肥作物腐解液的制備及有機酸組分的檢測 將新鮮綠肥植株樣品用去離子水洗凈，切成1～3 cm的小段，混勻后取100 g裝入1 L廣口玻璃瓶中。向每個瓶中加1 mL土壤浸提液，然后放置于背陰室外環(huán)境中進行腐解。統(tǒng)一腐解45天后，加入1000 mL去離子水，并加入適量百里酚 (0.1 g/L) 抑制微生物活動，震蕩5 min后過濾得到100 g/L的腐解液，腐解液經(jīng)低溫 (溫度控制在10℃) 干燥儀濃縮至100 mL (濃縮10倍)，放置超低溫冰箱保存以供進行Al-P 和Fe-P 活化試驗和有機酸檢測。

取5 mL上述濃縮腐解液于10 mL離心管中，在10000 r/min離心5 min，除去菌絲體，取稀釋適當(dāng)倍數(shù)的上清液1 mL于離心管中，加入0. 05 mL 硫酸 (72%) 酸解 30 min，10000 r/min離心3 min除去硫酸鈣，上清液過0. 22 μm濾膜即得含有游離酸的待測液。用安捷倫1260高效液相色譜儀，配制二極管陣列檢測器，測定腐解液濃縮液中10種有機酸組分的含量 (草酸、酒石酸、乙酸、丙二酸、蘋果酸、乳酸、馬來酸、富馬酸、檸檬酸、琥珀酸)。色譜條件：Spursil C18 色譜柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)。流速：0.8 mL/min；上樣量：20 μL。流動相：25 mmol/L磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)pH=2.5。檢測波長為210 nm[20]。

1.2.3 綠肥腐解液對難溶性磷的活化 難溶性磷的活化試驗參考蘭忠明等[19]的方法，稱取0.0500 g磷酸鋁AlPO4、磷酸鐵FePO4·2H2O分別放入50 mL塑料離心管中，用純水淋洗3次AlPO4和FePO4·2H2O，以去除AlPO4和FePO4·2H2O表面附著的易溶態(tài)磷。然后加入濃縮腐解液6 mL，連續(xù)震蕩2 h后過濾，采用鉬藍比色法測定上清液磷濃度 (P1)，以去離子水、不加難溶性磷酸鹽的腐解液為對照，同樣條件下進行震蕩、過濾后采用鉬銻抗比色法測定濾液中磷素含量 (CK)。以P1值減去腐解液磷素含量，再減去CK值即為綠肥腐解物質(zhì)對難溶性磷酸鹽的活化量。根據(jù)試驗中100 g綠肥制得的腐解液對Al-P、Fe-P的活化量換算得出1 t該綠肥腐解產(chǎn)生的腐解液對Al-P和Fe-P的活化量，活化量計量的物質(zhì)形態(tài)是P2O5。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計及作圖采用 Microsoft Excel 2016 和R語言 (version 3.4.2) 軟件，方差分析采用SPSS Statistics 17，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以4次重復(fù)的平均值表示，采用 LSD 法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同綠肥作物腐解液中有機酸組分差異

綠肥腐解后會產(chǎn)生多種有機酸陰離子，不同綠肥作物腐解產(chǎn)生的有機酸組分存在差異。本研究中6種綠肥腐解液中的有機酸組分含量如表1所示。二月蘭腐解液中10種有機酸組分總量最高，其次為肥田蘿卜、雙低甘藍型油菜和芥菜型油菜，雙高甘藍型油菜和紫云英腐解后腐解液中較低。從有機酸組分種類來看，酒石酸和丙二酸在供試綠肥腐解液中的含量較高，檸檬酸、琥珀酸和蘋果酸陰離子的含量居中，馬來酸和富馬酸的含量偏低。

表1 綠肥腐解液中各有機酸組分含量 (μg/L)Table 1 The contents of organic acids in the decomposed liquids of green manure crops

供試6種綠肥腐解液中各有機酸組分占10種有機酸組分總量的比例差異明顯 (表2)，在6種綠肥腐解液中，酒石酸和丙二酸均占有較高的比重，占到10種主要有機酸總量的15%以上，馬來酸和富馬酸占比最低，不到10種主要有機酸總量的1%。另外，不同綠肥間比較發(fā)現(xiàn)芥菜型油菜腐解液中檸檬酸和蘋果酸占比較高，甘藍型雙高油菜的草酸和檸檬酸占比較高，甘藍型雙低油菜的乳酸和琥珀酸占比較高；二月蘭的蘋果酸和乳酸占比較高，草酸較低；肥田蘿卜的酒石酸占比較高，檸檬酸、琥珀酸占比居中，乙酸占比較低；紫云英的檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸的占比較高。

表2 不同綠肥作物腐解液中的有機酸組分占總和比例 (%)Table 2 The proportion of organic acid components in the decomposed liquid of different green manure crops

2.2 綠肥腐解液對難溶性磷的活化效果

綠肥腐解液對難溶性P (Al-P、Fe-P) 的活化量如圖1所示。肥田蘿卜腐解液對Fe-P的活化能力強于對Al-P，而其他綠肥活化Al-P的能力強于Fe-P。芥菜型油菜、雙高甘藍型油菜和紫云英腐解液對Al-P的活化能力強于雙低甘藍型油菜、肥田蘿卜和二月蘭。6種綠肥作物中肥田蘿卜活化Fe-P的能力最強，二月蘭最弱，其他綠肥對Fe-P的活化能力差異不顯著。肥田蘿卜、芥菜型油菜和紫云英對難溶性磷素的活化總量均高于其他綠肥。供試綠肥作物中肥田蘿卜對難溶性磷組分Al-P和Fe-P的活化總量最高，理論上可達到0.6～1.2 kg/t，芥菜型油菜和紫云英次之，約為0.6～1.0 kg/t，二月蘭的活化總量最低，約為0.2～0.6 kg/t。

圖1 綠肥腐解液對Al-P和Fe-P的活化能力Fig. 1 Activation of Al-P and Fe-P by decomposed liquids of green manure crops

2.3 綠肥腐解液中不同有機酸組分含量與難溶性磷素活化能力的相關(guān)性

綠肥作物腐解液中有機酸組分含量與其對難溶性磷活化能力的相關(guān)性分析結(jié)果(圖2)顯示，Al-P的活化量與綠肥作物植株腐解液中檸檬酸、蘋果酸、草酸含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在2018和2019年分別達到 0.50、0.86、0.82 和 0.86、0.61、0.81；與綠肥腐解液中丙二酸含量均呈現(xiàn)負相關(guān)，與其他有機酸相關(guān)性不顯著。Fe-P的活化量與綠肥腐解液中酒石酸含量呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在2018和2019年分別達到0.60和0.79，與其他有機酸組分的相關(guān)性不顯著。

圖2 綠肥腐解液中有機酸組分含量與其對難溶性磷活化能力的相關(guān)性分析Fig. 2 Correlation analysis between the organic acid contents in the decomposed liquid of different green manures and its ability to activate insoluble phosphorus

3 討論

3.1 不同綠肥腐解液中有機酸組分的差異

有機殘體腐解釋放的相對分子質(zhì)量 ＜ 500的含羧基化合物，如檸檬酸、草酸、蘋果酸、酒石酸等有機酸陰離子，這些有機酸陰離子是土壤中廣泛存在的一類非?；顫姷奈镔|(zhì)。植物殘體腐爛或植物分泌的草酸和蘋果酸等有機酸是土壤磷素活化的關(guān)鍵因素之一[10,16,21]，綠肥翻壓還田后的腐解過程中會向土壤中釋放有機酸陰離子，主要包括腐殖酸和低分子量有機酸陰離子兩部分[22-24]。目前關(guān)于有機酸組分種類的相關(guān)研究主要集中在不同植物根系分泌物中有機酸組分差異方面，直接對不同綠肥腐解產(chǎn)生有機酸陰離子差異的研究還很少見，且少量有關(guān)綠肥作物的應(yīng)用過程中產(chǎn)生的有機酸對土壤難溶性磷素的活化方面的研究，大多停留在定性描述階段。非洲酸性低磷土壤上的研究結(jié)果表明，磷高效基因型大豆與玉米輪作并翻壓，通過大豆殘體中的磷吸收再利用以及豆科綠肥根系分泌的有機酸陰離子，尤其是檸檬酸，能夠解吸土壤固持的磷，使之成為有效態(tài)磷供作物吸收利用，因此顯著提高了玉米產(chǎn)量和磷素吸收量[11,25]。一般在缺磷環(huán)境中植物根系會分泌有機酸陰離子，且不同植物分泌的有機酸種類不同。羽扇豆在不同缺磷條件下可通過根系釋放的蘋果酸和琥珀酸活化土壤難溶性磷素[17]；紫云英和蘿卜通過根系分泌蘋果酸、草酸和琥珀酸等有機酸陰離子，顯著增加對難溶性磷的活化效果[18-19]。

微生物在分解植物殘體時會分泌有機酸陰離子，不同綠肥腐解產(chǎn)生的有機酸種類和量存在差異的主要原因是不同綠肥碳氮比存在差異，微生物獲得的碳源和氮源存在差異，從而影響了微生物分泌有機酸陰離子的過程，包括菌根菌的侵染、微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)等[26-29]。另外，不同綠肥腐解產(chǎn)生有機酸的過程中發(fā)揮主要功能的微生物群組和功能基因的調(diào)控有所差異[30]，導(dǎo)致了綠肥腐解過程中產(chǎn)生的有機組分種類或量的差異[31]。目前針對相關(guān)微生物功能基因表達及微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究還較少，需要進一步開展相關(guān)研究。

3.2 不同綠肥腐解產(chǎn)生的有機酸差異與其磷活化能力間的關(guān)系

我國南方紅壤一般偏酸性，且含有大量Al2+、Fe3+，磷肥施入土壤后很快以Al-P、Fe-P的形式被固定，從而導(dǎo)致紅壤供磷能力較低[32]。大量研究表明，在酸性土壤中施用有機肥可以提高土壤中有機酸陰離子含量，從而減少土壤對磷素的吸附和固持，同時還能降低土壤對磷素的吸附K值[33-34]，提高土壤磷素水平，促進作物對磷的吸收利用，進而增加作物產(chǎn)量[11-13]，而且這一現(xiàn)象與其腐解過程中產(chǎn)生的有機酸有關(guān)[25]。綠肥在翻壓后腐解的過程中產(chǎn)生的有機酸通過絡(luò)合溶解、還原、酸溶等作用，將土壤中難以被植物利用的無效態(tài)磷素活化為有效態(tài)磷素[35-37]。因此，綠肥腐解過程產(chǎn)生的有機酸種類和量會直接影響土壤磷素含量以及供磷能力。本研究中不同綠肥對難溶性磷素的活化能力存在差異，其中肥田蘿卜、芥菜型油菜和紫云英對難溶性磷素Al-P和Fe-P的活化能力較強。兩種難溶性磷素活化總量大小依次為肥田蘿卜 ＞ 芥菜型油菜、紫云英 ＞ 雙高甘藍型油菜 ＞ 雙低甘藍型油菜 ＞ 二月蘭，這與不同綠肥腐解后腐解液中的有機酸組分差異有關(guān)。

不同種類有機酸陰離子對土壤中難溶性磷素的活化能力不同，因而不同綠肥翻壓還田對土壤中難溶性磷素的活化效果不同。在有機酸陰離子濃度較低的條件下，檸檬酸和草酸對磷礦粉的解磷效果最好，由于綠肥腐解釋放到土壤中或植物根際中有機酸濃度較低，所以有機酸對難溶性磷的解磷效果主要受到有機酸陰離子種類的限制[5]。低分子量有機酸陰離子對土壤無機磷的活化，主要是促進了土壤中有效性低的無機磷形態(tài)向有效性較高的形態(tài)轉(zhuǎn)化，并且這個過程與有機酸的種類密切相關(guān)[38]。Bloan等[39]對蘋果酸、檸檬酸等7種有機酸陰離子的研究結(jié)果表明，活化土壤難溶性磷素的能力依次為檸檬酸 ＞草酸 ＞ 酒石酸 ＞ 蘋果酸 ＞ 乙酸、琥珀酸、乳酸。本研究中通過對不同綠肥作物腐解液對難溶性磷素的活化量進行換算后發(fā)現(xiàn)，理論上1 t肥田蘿卜、紫云英、芥菜型油菜、雙高甘藍型油菜、雙低甘藍型油菜和二月蘭綠肥經(jīng)過1個月的腐解，產(chǎn)生的腐解液活化Al-P和Fe-P可分別產(chǎn)生約為0.9、0.8、0.8、0.7、0.5和0.4 kg生物有效態(tài)磷素。6種綠肥作物中肥田蘿卜植株腐解液對Al-P、Fe-P的活化總量最大，其次為紫云英和芥菜型油菜綠肥。分析供試綠肥腐解液對難溶性磷活化能力與其腐解液中不同有機酸組分含量的相關(guān)性，結(jié)果表明綠肥作物腐解液活化磷素能力高低與其腐解產(chǎn)生的檸檬酸、蘋果酸、草酸和酒石酸陰離子存在正相關(guān)關(guān)系，說明綠肥腐解液對難溶性磷素的活化作用主要取決于有機酸組分中的某幾種組分，而非這些有機酸組分總和的高低。這一結(jié)果與上述研究中的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

與Al-P和Fe-P的活化密切相關(guān)的是有機酸中含有較高的檸檬酸、草酸、蘋果酸和酒石酸。供試6種綠肥作物的腐解液分泌的10種有機酸的總含量及各有機酸組分的占比差異很大，二月蘭雖然有機酸總量高，但是檸檬酸、草酸和酒石酸比例均較低。肥田蘿卜腐解液中的酒石酸含量及其占比高于其他綠肥，且檸檬酸和琥珀酸占比較高，對Fe-P的活化能力強。芥菜型油菜和紫云英腐解液中草酸、檸檬酸和琥珀酸占比高于其他綠肥，對Al-P的活化能力強。供試6種綠肥中以肥田蘿卜腐解液的活化能力最強，芥菜型油菜和紫云英的活化能力次之。