蔣 鵬，李家慶，郭競(jìng)選，趙 政，袁力行

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，國家農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展研究院/植物-土壤相互作用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

磷 (phosphorus，P) 是一種有限的、不可再生的礦質(zhì)元素，在生命遺傳繁衍 (DNA和RNA)、能量轉(zhuǎn)運(yùn) (ATP) 等過程中發(fā)揮著重要作用[1]。磷是作物生長所必需的大量元素之一。作物根系主要吸收無機(jī)磷酸鹽 (phosphate，Pi)。由于土壤磷具有低溶解度、低遷移率和高固定率的特征，土壤溶液中的Pi濃度僅為1～10 μmol/L[2-3]，而植物組織內(nèi)的Pi濃度一般達(dá)到5～20 mmol/L，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中需要施用磷肥來維持作物生長。磷礦資源是磷肥生產(chǎn)的原料，全球探明儲(chǔ)量可達(dá)6.9 × 1010t，其大部分集中在摩洛哥(USGS，2020)[4]。我國磷礦資源儲(chǔ)量約有 3.2 × 109t[4]，主要分布于云、貴、川、湘、鄂5省[5]，磷礦石P2O5的平均品位為16.85%[5-6]，存在資源集中、富礦及易選礦少等問題[7]。然而，農(nóng)業(yè)磷資源的過量投入?yún)s導(dǎo)致了全球農(nóng)田磷盈余，從1961年的2.3 × 106t增長到2013年的1.08 × 107t，僅有22%的磷投入最終被人類消費(fèi)[8]。大部分盈余磷進(jìn)入環(huán)境引起了水體富營養(yǎng)化[9-10]、土壤重金屬污染等問題[11-12]。為此，磷資源的可持續(xù)利用及其對(duì)糧食安全和環(huán)境安全的影響已經(jīng)引起世界各國的重視[13]。

為了解決磷的資源與環(huán)境問題，必須從整個(gè)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)磷流鏈條的角度創(chuàng)新磷資源可持續(xù)性管理[14]。其中，提高作物磷效率 (P efficiency，PE) 尤為重要，包括作物從土壤中獲取磷的效率 (PupE，P uptake efficiency) 和體內(nèi)磷的利用效率 (P utilization efficiency，PutE)[14-15]。植物根系進(jìn)化出多種形態(tài)和生理學(xué)策略來高效獲取土壤磷。磷高效吸收的理想根構(gòu)型 (root system architecture，RSA) 應(yīng)具有較淺的根基部生長角度、密集的側(cè)根分支和較長的根毛，從而通過增加淺層土壤的根表面積來提高PupE[16-17]。植物根系還可以通過增加質(zhì)子、有機(jī)酸陰離子和酸性磷酸酶分泌來提高土壤中難溶磷的利用率[18]。為了提高PutE，植物可將衰老葉片組織中豐富的線粒體與葉綠體中的核酸 (DNA和RNA) 分解進(jìn)行循環(huán)利用[19]，活化與再利用液泡中存儲(chǔ)的磷，以及減少磷向籽粒的分配等[20-21]。此外，植物磷的吸收利用通常伴隨著與氮、鈣等元素的相互作用[22-24]，調(diào)控植物對(duì)其它元素的吸收利用也能間接提高磷效率。

作物體內(nèi)60%～85%的磷儲(chǔ)存在成熟的籽粒中[25-26]，每年作物收獲帶走的磷約占全球農(nóng)田磷肥施用量的85%[27]，而動(dòng)物或人類消費(fèi)的磷僅有約10%能被再循環(huán)利用[28]。植酸 (肌醇-1,2,3,4,5,6-己磷酸，InsP6) 是磷在籽粒中的主要儲(chǔ)存形式，占籽?？偭椎?5%～80%[29-30]。植酸能夠螯合Fe2+、Zn2+等元素形成植酸鹽[31]。籽粒萌發(fā)過程中內(nèi)源植酸酶被激活，降解植酸鹽來釋放肌醇、磷和其他礦質(zhì)陽離子用于支撐幼苗生長[32]。然而，包括人類在內(nèi)的非反芻動(dòng)物均無法消化植酸鹽來獲取其螯合的Fe2+、Zn2+等有益微量元素[33-34]。這些植酸鹽隨動(dòng)物排泄物排出體外，進(jìn)入水體后加劇富營養(yǎng)化而造成環(huán)境污染[35]。畜牧業(yè)中通常向動(dòng)物飼料中添加磷補(bǔ)充劑[36]或外源植酸酶[35]來滿足動(dòng)物營養(yǎng)需求，但磷補(bǔ)充劑的添加無法從根本上解決高磷排泄物對(duì)環(huán)境的危害。添加植酸酶雖然能夠降解籽粒中富含的植酸，但費(fèi)用高昂。

農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的磷流動(dòng)鏈條包括磷礦開采加工、磷肥生產(chǎn)、土壤磷過程、作物生產(chǎn)、畜禽養(yǎng)殖、人類消費(fèi)，及最終向環(huán)境的磷輸入等多個(gè)過程，將礦石中的磷逐步轉(zhuǎn)化為土壤磷、植物磷和動(dòng)物磷，以滿足人類的消費(fèi)需求。開發(fā)籽粒低植酸 (low grain phytate，LGP) 作物，可以通過降低籽粒植酸含量來解決植酸磷引起的營養(yǎng)問題，降低作物磷需求，減少磷向環(huán)境的排放，從而提升磷在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的循環(huán)利用效率，顯示出廣闊的應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值[37]。籽粒低植酸作物品種有兩種類型：一類品種的籽粒總磷基本不變，但植酸含量低，因此，大部分籽粒磷可以被動(dòng)物有效利用而導(dǎo)致“廢物磷”排放減少，并且籽粒中有益元素的生物有效性也較高，營養(yǎng)品質(zhì)好，降低了動(dòng)物飼料中磷補(bǔ)充劑等資源的額外投入；另一類品種的籽粒植酸和總磷含量均低，作物吸收的磷主要積累在秸稈中，這類品種既具有籽粒低植酸的優(yōu)點(diǎn)，又減少了籽粒收獲帶走的磷量，積累在秸稈中的磷還可通過秸稈還田來實(shí)現(xiàn)磷在農(nóng)田中的循環(huán)利用，降低了作物生產(chǎn)的磷資源需求 (圖1)。本文系統(tǒng)綜述作物籽粒中磷的來源、籽粒低植酸品種的遺傳改良途徑，剖析現(xiàn)有研究存在的不足，并對(duì)未來籽粒低植酸品種培育與應(yīng)用進(jìn)行展望。

1 植物籽粒磷的來源

植物體內(nèi)磷以無機(jī)磷酸鹽 (Pi) 和有機(jī)磷酸酯兩種形式存在。籽粒中Pi在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成植酸，并最終儲(chǔ)存在蛋白質(zhì)儲(chǔ)存液泡 (protein storage vacuole) 中[38]。盡管籽粒植酸含量在不同作物品種中存在差異，但它與籽?？偭字g的相關(guān)性通常 ≥ 95%[39]。磷在籽粒中的積累主要通過3個(gè)步驟完成：Pi從源器官運(yùn)輸?shù)阶蚜！⒆蚜＠肞i合成植酸以及合成植酸的轉(zhuǎn)運(yùn)與儲(chǔ)存。

Pi運(yùn)輸?shù)阶蚜Ｓ袃蓚€(gè)途徑，包括從葉片等營養(yǎng)器官中活化的Pi通過韌皮部運(yùn)輸?shù)阶蚜?，和從根系吸收的Pi通過木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)阶蚜?。因此，土壤Pi的供應(yīng)和植物組織的Pi濃度能夠顯著影響Pi從源器官到籽粒的運(yùn)輸過程[40]。目前在模式植物擬南芥中鑒定到一些關(guān)鍵基因，如AtPHT1;5[41]基因可能參與Pi向籽粒的韌皮部運(yùn)輸，AtSPDT[42]基因則通過介導(dǎo)Pi從木質(zhì)部向韌皮部的橫向轉(zhuǎn)運(yùn)來影響Pi向籽粒的分配；在水稻中也鑒定到參與木質(zhì)部Pi在莖節(jié)的橫向轉(zhuǎn)運(yùn)基因SPDT[21]、OsPHO1;1和OsPHO1;2[43]；另外，OsPHT1;8[44]基因可能參與穗軸中Pi向籽粒的運(yùn)輸。在籽粒內(nèi)部，OsPHT1;4[45]和OsPHT1;8基因參與了Pi向胚的轉(zhuǎn)運(yùn)，OsSULTR3;3[46]基因則可能在亞細(xì)胞水平介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中Pi向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)以合成植酸 (表1和圖2)。

圖2 影響籽粒植酸累積的關(guān)鍵基因 (以水稻為例)Fig. 2 Key genes involved in grain phytate accumulation (take rice as an example)

表1 籽粒低植酸品種的遺傳改良途徑Table 1 Pathways of genetic improvement for low grain phytate varieties

Pi運(yùn)輸?shù)阶蚜：螅诩?xì)胞質(zhì)基質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成植酸，包括非脂質(zhì)依賴性途徑和脂質(zhì)依賴性途徑兩種不同的途徑，均以肌醇作為反應(yīng)底物。6-磷酸葡萄糖 (glucose 6-phosphate) 首先在肌醇-3-磷酸合酶(myo-inositol-3-phosphate synthase，MIPS) 作用下轉(zhuǎn)化成肌醇-3-磷酸 [Ins (3) P1]，肌醇-3-磷酸水解酶[Ins(3) P1- monophosphatase，IMP] 進(jìn)一步催化肌醇-3-磷酸生成肌醇。植物組織中常見的脂質(zhì)依賴性途徑是以磷脂酰肌醇 (phosphatidylinositol，PtdIns) 為前體，由肌醇在磷脂酰肌醇合酶 (phosphatidylinositol synthase) 的催化下合成，磷脂酰肌醇在磷脂酶 C(phospholipase C，PLC) 水解作用下生成肌醇-1,4,5-三磷酸[myo-inositol-1,4,5-trisphosphate，Ins (1,4,5)P3]，經(jīng)過多步磷酸化生成植酸。而非脂質(zhì)依賴性途徑在植物籽粒植酸合成中占主導(dǎo)地位，該途徑中肌醇在肌醇激酶 (myo-inositol kinase，MIK) 的催化下生成肌醇-3-磷酸，然后再經(jīng)過多個(gè)激酶的順序磷酸化形成植酸，涉及MIPS、ITPK、IPK1等關(guān)鍵酶。植酸生物合成途徑以及相關(guān)酶的作用機(jī)制非常復(fù)雜，還需要深入研究[62]。

合成后的植酸在籽粒中進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)并儲(chǔ)存。不同谷物中的植酸含量和分布不同，如玉米中植酸主要儲(chǔ)存于胚和盾片中，小麥、大麥和水稻中80%的植酸儲(chǔ)存于糊粉層和麩皮中，只有小部分植酸儲(chǔ)存在胚中[63]；豆科作物中95%以上的籽粒植酸在子葉中積累[64]；擬南芥中植酸則主要儲(chǔ)存在胚中[65]。在水稻中，籽粒發(fā)育過程中胚的植酸含量始終較低，但調(diào)控植酸合成最后一步的OsIPK1基因在胚和糊粉層中表達(dá)最高，因此推測(cè)胚中合成的植酸立即被運(yùn)輸?shù)胶蹖又校蛘咧菜嶂辉诤蹖雍蛠喓蹖又斜缓铣蒣66]。目前鑒定到ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (ATP-binding cassette transporter) 家族成員中的MRP (multidrugresistance-associated protein) 蛋白可能參與了籽粒中植酸的轉(zhuǎn)運(yùn)與儲(chǔ)存過程[67]。

2 籽粒低植酸品種的遺傳改良途徑

降低Pi從源器官向籽粒的分配，阻斷植酸的生物合成或轉(zhuǎn)運(yùn)儲(chǔ)藏，都能顯著降低籽粒的植酸含量，是籽粒低植酸品種遺傳改良的主要途徑。低植酸突變體材料是籽粒低植酸品種遺傳改良的種質(zhì)基礎(chǔ)。研究早期，利用物理、化學(xué)誘變或插入突變等方法構(gòu)建作物突變體庫，科學(xué)家直接篩選獲得一些低植酸突變體材料，并利用這些遺傳資源分離克隆到控制籽粒植酸累積的關(guān)鍵基因。另外，隨著籽粒植酸磷積累途徑分子機(jī)制的解析，通過反義、RNAi干擾等技術(shù)下調(diào)關(guān)鍵基因表達(dá)，或采用T-DNA插入、CRISPR/Cas9靶向敲除基因，也能創(chuàng)制相應(yīng)的低植酸突變體。利用上述正向或反向遺傳學(xué)手段，在許多作物種類中都取得了很好研究進(jìn)展，具體匯總在表1中。

2.1 阻斷Pi轉(zhuǎn)運(yùn)途徑—減少無機(jī)磷向籽粒的運(yùn)輸

減少Pi從源器官向籽粒的運(yùn)輸與分配是降低籽粒植酸含量最直接的途徑，傾向于產(chǎn)生籽粒植酸低且總磷也低的品種。目前，已經(jīng)在SULTR3、PHO1、PHT1家族中克隆出參與Pi向籽粒運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵基因成員。它們?cè)谥参矬w內(nèi)的時(shí)空表達(dá)模式并不相同，相關(guān)低植酸突變體的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)也有很大差異。

2.1.1 SULTR 3 (硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，sulfate transporter) 近年來，在水稻和擬南芥中均鑒定到SULTR3;4基因參與Pi由木質(zhì)部向籽粒的運(yùn)輸過程。SULTR3;4基因編碼的SPDT (SULTR-like phosphorus distribution transporter) 蛋白定位于質(zhì)膜上，介導(dǎo)H+/Pi的同向轉(zhuǎn)運(yùn)，而不參與轉(zhuǎn)運(yùn)硫。Yamaji等[21]研究發(fā)現(xiàn)，水稻籽粒灌漿期間，SPDT基因在旗葉與穗部相連的莖節(jié)(node I) 處大量表達(dá)，受低磷脅迫誘導(dǎo)。它介導(dǎo)了根系吸收的Pi從莖節(jié)木質(zhì)部向韌皮部轉(zhuǎn)移，尤其是Pi從擴(kuò)大維管束 (enlarged vascular bundles，EVBs)向與穗部相連的分散維管束 (diffuse vascular bundles，DVBs) 轉(zhuǎn)移，從而將Pi優(yōu)先分配到籽粒。Ding等[42]在擬南芥中也鑒定到類似功能的AtSPDT基因，介導(dǎo)了Pi從木質(zhì)部經(jīng)維管形成層向韌皮部的橫向轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)Pi向新生葉及籽粒的優(yōu)先分配。由于擬南芥的維管系統(tǒng)不同于水稻，根系吸收的Pi通過蒸騰作用向上運(yùn)輸?shù)侥举|(zhì)部后，是由位于不同器官分枝點(diǎn)的木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中的AtSPDT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將其從木質(zhì)部卸載，再經(jīng)由維管形成層和伴胞/韌皮部薄壁細(xì)胞中的AtSPDT進(jìn)一步向韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)，最后運(yùn)輸?shù)阶蚜！?/p>

在野生型水稻中，地上部總磷的64.5%向籽粒分配，而在spdt突變體中則降低到42.5%～44.0%。由于整株總磷含量沒有顯著改變，突變體秸稈的磷含量由35%增至57%。因此，spdt籽粒磷含量下降主要是抑制SPDT介導(dǎo)Pi向籽粒分配所造成的。籽粒總磷降低約20%，但并不影響突變體的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量，而秸稈中增加的磷累積可通過秸稈還田來循環(huán)利用，因此能節(jié)約20%的磷肥投入。突變體的籽粒植酸濃度比野生型降低25%～32%，但不影響籽粒發(fā)芽率及其早期萌發(fā)，F(xiàn)e2+、Zn2+的生物有效性得到增強(qiáng)，還降低了植酸磷向環(huán)境排放的風(fēng)險(xiǎn)。通過抑制SPDT基因介導(dǎo)的Pi向籽粒分配的過程，可顯著降低籽粒植酸磷含量。不影響作物產(chǎn)量，減少了作物磷需求，提高了籽粒品質(zhì)，是遺傳改良的最好靶標(biāo)。

水稻中還有另外一個(gè)SULTR3家族成員OsSULTR3;3，其突變體ossultr3;3的籽粒植酸濃度顯著降低35.2%～43.9%，總磷濃度相應(yīng)下降18.9%～27.5%[46]。OsSULTR3;3基因在發(fā)育籽粒的維管束中表達(dá)，其編碼蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。異源表達(dá)體系沒有檢測(cè)到OsSULTR3;3蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肌醇等植酸前體、磷酸鹽或硫酸鹽的活性，但不排除在植物中具有相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。OsSULTR3;3基因只對(duì)植酸合成后期步驟有影響，基因突變會(huì)導(dǎo)致編碼IPK1、ITPK激酶的基因表達(dá)水平改變。鑒于InsP3到InsP6的轉(zhuǎn)化發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[65]，OsSULTR3;3基因可能參與Pi向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而為植酸合成提供原料。此外，突變體總硫、硫酸鹽以及糖醇、生物胺和游離脂肪酸等營養(yǎng)相關(guān)代謝物的濃度上升，說明該基因還可能參與植物組織內(nèi)部磷酸鹽和硫酸鹽穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)及信號(hào)傳導(dǎo)過程。Zhou等[68]發(fā)現(xiàn)ossultr3;3突變體與商業(yè)栽培種的雜交后代，可以穩(wěn)定觀察到籽粒植酸降低和代謝物增加的表型。因此，遺傳操作OsSULTR3;3既能降低籽粒植酸，還能增強(qiáng)籽粒營養(yǎng)，也是有效的改良途徑之一。

大麥lpa1-1突變體作為最早進(jìn)行商業(yè)化育種的籽粒低總磷類型的LGP品種[69-70]，籽粒植酸含量降低約50%，總磷降低15%～20%[71]，并且能夠特異性降低胚乳30%的總磷[72]，具有良好的田間表現(xiàn)[73]。有意思的是，導(dǎo)致lpa1-1突變體表型的大麥HvST也編碼了一個(gè)SULTR3家族成員，有可能參與植酸合成原料Pi的轉(zhuǎn)運(yùn)，但具體機(jī)制還有待研究[47,74]。

2.1.2 PHO1 (磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，phosphate transporter)研究發(fā)現(xiàn)水稻OsPHO1;1和OsPHO1;2基因也參與Pi向籽粒的分配過程。它們編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同屬于PHO1家族，介導(dǎo)Pi的跨質(zhì)膜流入過程[43]。在成熟期，OsPHO1;1和OsPHO1;2基因在莖節(jié) (node I) 處有較高的表達(dá)，其中OsPHO1;1基因主要在DVBs的韌皮部表達(dá)，而OsPHO1;2基因主要在EVBs的木質(zhì)部表達(dá)。OsPHO1;2負(fù)責(zé)將Pi從EVBs的木質(zhì)部中卸載，而OsPHO1;1則將Pi裝載到DVBs的韌皮部后再運(yùn)輸?shù)阶蚜?。敲除OsPHO1;2基因會(huì)減少Pi向籽粒的分配，與野生型相比籽粒磷濃度降低約44%～50%，但并不影響其他礦質(zhì)元素的分配。與敲除OsPHO1;2基因相比，敲除OsPHO1;1基因?qū)λ綪i向籽粒分配的影響較小。此外，OsPHO1;1基因在穎果的胚珠維管束和內(nèi)珠皮的外層，OsPHO1;2基因在穎果的胚珠維管束和珠心表皮也有表達(dá)，推測(cè)它們可能也參與了Pi從母體組織向籽粒發(fā)育的子代組織的傳遞。這一假設(shè)也在擬南芥的PHO1同源基因研究中得到驗(yàn)證[75]。然而，ospho1;1和ospho1;2突變體與野生型的株高和穗數(shù)相比均有下降，籽粒明顯變小且萌發(fā)延遲，ospho1;2突變體的千粒重僅為野生型的52%～58%。因此，對(duì)PHO1基因的遺傳操作會(huì)導(dǎo)致作物產(chǎn)生不良的農(nóng)藝表現(xiàn)，用于培育低植酸品種的價(jià)值不大。

2.1.3 PHT1 (磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，phosphate transporter)研究發(fā)現(xiàn)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHT1家族成員參與了衰老組織中活化出的Pi向籽粒的再轉(zhuǎn)移過程。AtPHT1;5基因在擬南芥衰老葉片的維管束韌皮部中高度表達(dá)，負(fù)責(zé)Pi從衰老葉片到庫器官的轉(zhuǎn)移。過表達(dá)AtPHT1;5可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因株系的籽粒Pi濃度提高兩倍[41]。OsPHT1;4[45]和OsPHT1;8[44]基因在水稻籽粒發(fā)育過程中也有高表達(dá)，但二者功能并不冗余。OsPHT1;4基因在胚中的表達(dá)量是胚乳和穗軸的10倍[45]，可能介導(dǎo)Pi從其他組織向籽粒胚的轉(zhuǎn)運(yùn)[76]。OsPHT1;4基因功能缺失會(huì)導(dǎo)致籽粒中22%～32%的植酸濃度和胚中21%～24%的總磷含量下降，胚乳總磷含量不受影響。參與植酸合成的MIPS合酶和IPK1激酶基因的表達(dá)也顯著降低，并造成胚的縮小。過表達(dá)OsPHT1;4基因則導(dǎo)致胚和胚乳中總磷和植酸濃度增加，植酸合成相關(guān)酶的基因表達(dá)也被上調(diào)。OsPHT1;4基因的功能缺失會(huì)導(dǎo)致穗莖稈較弱，結(jié)實(shí)率比野生型降低50%～58%，產(chǎn)量和千粒重也相應(yīng)減少，籽粒萌發(fā)和根系伸長均受到抑制[45]。OsPHT1;8基因可能參與Pi從穗軸向籽粒的運(yùn)輸，以及從胚乳向胚的運(yùn)輸。缺失OsPHT1;8基因?qū)е峦蛔凅w穗軸中總磷含量增加30%，灌漿期籽粒中總磷降低30%，結(jié)實(shí)率降低[44]。OsPHT1;4和OsPHT1;8基因在水稻體內(nèi)有著復(fù)雜的生物學(xué)功能，基因缺失突變體有不良農(nóng)藝表現(xiàn)。然而，選擇性沉默胚乳中的OsPHT1;8基因則導(dǎo)致胚中總磷含量下降40%～50%，但不影響胚乳中的磷含量，對(duì)千粒重和結(jié)實(shí)率影響也較小[77]，成為一種可能的籽粒低植酸性狀的改良途徑。

2.2 阻斷植酸合成途徑—控制Pi合成植酸

作物籽粒中的植酸主要是通過非脂質(zhì)依賴性途徑合成，涉及MIPS、ITPK、IPK1等關(guān)鍵酶。降低這些關(guān)鍵酶的表達(dá)及活性，傾向于產(chǎn)生籽粒低植酸、總磷不變的作物品種。

2.2.1 MIPS (肌醇-3-磷酸合酶，myo-inositol-3-phosphate synthase) 植酸合成的首要步驟是MIPS催化6-磷酸葡萄糖生成Ins (3) P1，該反應(yīng)也是生物體內(nèi)肌醇的唯一從頭來源[78]。不同植物基因組中的MIPS基因數(shù)量不同，如水稻有兩個(gè)MIPS基因，大豆有4個(gè)MIPS基因，它們?cè)谧蚜０l(fā)育階段各有一個(gè)MIPS基因特異性高表達(dá)[47,79-82]。MIPS基因最早由Dean-Johnson等[83]通過遺傳互補(bǔ)從釀酒酵母中克隆。Kuwano等[84]通過反義RNA來降低編碼MIPS合酶的RINO1基因表達(dá)，獲得籽粒植酸含量下降、但總磷含量沒有降低的水稻突變體。雖然敲除MIPS基因可以顯著降低籽粒植酸含量，但通常會(huì)對(duì)籽粒萌發(fā)、幼苗生長和產(chǎn)量造成不良影響。Keller等[48]利用反義RNA抑制馬鈴薯中StIPS基因的表達(dá)水平至野生型水平的20%以下，籽粒肌醇含量明顯降低，但會(huì)導(dǎo)致葉片形態(tài)改變、早熟衰老及整體塊莖產(chǎn)量下降。

有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)籽粒MIPS基因進(jìn)行特異性沉默似乎可以避免敲除基因帶來的相關(guān)缺陷。Kuwano等[49]采用籽粒特異性啟動(dòng)子oleosin18，反義下調(diào)了水稻RINO1基因表達(dá)，籽粒植酸含量減少了68%，但對(duì)籽粒干重、發(fā)芽或植株生長沒有產(chǎn)生負(fù)面影響，Ali等[50]利用RNAi技術(shù)沉默水稻RINO1基因表達(dá)也取得了類似的效果。在大豆中使用籽粒特異性啟動(dòng)子vicilin下調(diào)GmMIPS1基因的表達(dá)，也不會(huì)影響其他組織的肌醇代謝[85]，Kumar等[51]利用vicilin靶向破壞大豆籽粒中GmMIPS1基因的表達(dá)，突變株系的籽粒中分別觀察到38.75%和41.34%植酸含量的降低，礦質(zhì)元素Fe2+、Ca2+的含量顯著增加，表明特異性沉默MIPS基因來實(shí)現(xiàn)籽粒低植酸性狀遺傳改良切實(shí)可行。

2.2.2 ITPK (肌醇三/四磷酸激酶，inositol tris/tetrakisphosphate kinase) ITPK激酶屬于ATPGRASP折疊蛋白家族 (ATP-grasp fold protein)。在肌醇形成與代謝中間過程中，ITPK激酶催化的肌醇磷酸鹽的持續(xù)磷酸化過程研究最多。通過可逆賴氨酸乙?；梢哉{(diào)控ITPK1激酶，進(jìn)而抑制肌醇的更高磷酸化，降低細(xì)胞中的植酸含量[86]。目前在擬南芥[87-88]和大豆[89]中分別鑒定到4種不同的ITPK激酶，其中大豆GmITPK3在籽粒發(fā)育早期有較高表達(dá)。在水稻中鑒定到6個(gè)ITPK激酶[62]，其中OsITP5/6K-4和OsITP5/6K-6基因在籽粒胚中特異性表達(dá)。盡管水稻OsITP5/6K-6基因的突變可以有效抑制水稻籽粒的植酸合成，卻會(huì)顯著影響植株的生長和繁殖[53]。Kim等[52]篩選水稻TILLING (targeting of induced local lesions IN genomes) 庫鑒定到4個(gè)低植酸突變體，其中兩個(gè)目標(biāo)基因?qū)儆贗TPK基因家族，其突變導(dǎo)致籽粒中植酸含量分別減少46%和68%，其中減少46%植酸含量的突變株系的農(nóng)藝性狀無顯著變化。目前在玉米中只鑒定到一個(gè)編碼ITPK激酶的基因ZmIPK，且在胚中特異性表達(dá)，該基因的突變可以降低玉米籽粒30%～50%的植酸含量且總磷不變，籽粒干重有部分下降但不會(huì)影響功能[32,54]。最近，Sashidhar等[55]在多倍體油菜中尋找到15個(gè)ITPK同源基因，通過CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了兩個(gè)ITPK基因三重突變體bnitpk1。其籽粒植酸含量顯著降低27.2%～35.3%，同時(shí)Pi含量增加，總磷基本保持不變，并沒有表現(xiàn)出產(chǎn)量和種子活力等農(nóng)藝性狀的缺陷。因此，在不同作物中敲除關(guān)鍵酶ITPK的編碼基因可以降低籽粒植酸含量，但對(duì)農(nóng)藝性狀的影響在不同作物種類中存在較大差異，該途徑的應(yīng)用還需更深入的研究。

2.2.3 IPK1 (肌醇-五磷酸二激酶，inositolpentakisphosphate 2-kinase) 植酸生物合成的最終步驟是IPK1激酶催化Ins (1,3,4,5,6) P5轉(zhuǎn)化為InsP6。Sun等[90]在玉米中鑒定到ZmIPK1A和ZmIPK1B為兩個(gè)相似的旁系同源基因，ZmIPK1B基因在根中表達(dá)，而ZmIPK1A基因在幼穗、籽粒的胚乳和胚中等部位均有表達(dá)。水稻的IPK1基因在籽粒發(fā)育早期的糊粉層中表達(dá)最高[62]。擬南芥中至少有兩個(gè)IPK1基因表達(dá)，其中AtIPK1基因在發(fā)育階段的花蕾、角果等部位表達(dá)[91]。AtIPK1和AtIPK2β基因雙突變體的籽粒植酸含量降低83%，Pi含量增加10倍，且籽粒產(chǎn)量不受影響[56]。

擬南芥中的AtIPK1基因的突變雖然可以降低籽粒植酸含量，但會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)磷酸鹽穩(wěn)態(tài)的紊亂，導(dǎo)致磷酸鹽的過度積累[92]。植酸參與細(xì)胞核的mRNA輸出過程，AtIPK1基因突變會(huì)導(dǎo)致mRNA輸出不足，Lee等[93]發(fā)現(xiàn)Gle1蛋白是調(diào)控植酸在植株生長和繁殖中功能的重要因子，gle1基因突變的擬南芥表現(xiàn)出對(duì)植酸的敏感性增強(qiáng)，可以彌補(bǔ)AtIPK1基因突變的缺陷，顯著提高突變體的營養(yǎng)生長和籽粒產(chǎn)量，為從遺傳操作植酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑培育低植酸作物品種提供了可能。Ali等[57]使用啟動(dòng)子oleosin18特異性沉默籽粒IPK1基因的表達(dá)，突變體水稻的籽粒植酸含量顯著降低，Pi含量增加，胚乳的鐵含量為野生型的1.8倍，并且對(duì)籽粒萌發(fā)等農(nóng)藝性狀沒有產(chǎn)生負(fù)面影響。Vincent等[58]通過挖掘作物優(yōu)良的等位變異，對(duì)大豆6號(hào)染色體與14號(hào)染色體的IPK1基因進(jìn)行基因型和籽粒磷表型間的關(guān)聯(lián)分析，培育出兩個(gè)位點(diǎn)上均有突變的籽粒低植酸品種，籽粒萌發(fā)和田間出苗率等性狀均無顯著降低，并表現(xiàn)出極低的植酸水平與適宜的Pi水平。圍繞植酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，特異性沉默籽粒IPK1基因及挖掘優(yōu)良等位變異等為遺傳改良籽粒低植酸品種提供了可行途徑。

2.3 阻斷植酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑—控制籽粒的植酸含量

植酸在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過肌醇的順序磷酸化合成后，在由ABC型的MRP蛋白介導(dǎo)下跨膜運(yùn)輸與區(qū)室化，并最終儲(chǔ)存在液泡中。也有研究認(rèn)為，MRP蛋白是通過調(diào)控植酸合成原料Pi的供應(yīng)來參與調(diào)節(jié)植酸水平[67,94-95]。對(duì)植酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)行阻斷，植酸將無法轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡內(nèi)存儲(chǔ)，因而在細(xì)胞質(zhì)被磷酸酶降解，從而使植酸含量減少、Pi含量增加，傾向于產(chǎn)生籽粒低植酸、總磷不變的品種。Shi等[59]利用籽粒特異性啟動(dòng)子globoulin-1靶向沉默玉米胚中編碼MRP4蛋白的基因，突變體籽粒的植酸含量下降32%～75%，總磷基本保持不變，籽粒發(fā)育未受影響。在大豆中對(duì)同源基因進(jìn)行沉默也得到相似效果。

然而，T-DNA插入缺失水稻OsMRP5基因，雖然顯著降低了籽粒的植酸含量，但是子代出現(xiàn)純合致死現(xiàn)象[66]。大豆中MRP蛋白的功能缺失也可能會(huì)對(duì)作物生長發(fā)育造成不良影響。Neelam等[96]對(duì)低植酸大豆品系 (攜帶一個(gè)MIPS和兩個(gè)MRP基因突變)與正常品系的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了差異表達(dá)和功能富集分析，發(fā)現(xiàn)突變體籽粒的細(xì)胞壁合成相關(guān)基因提前表達(dá)，而光合作用相關(guān)基因在發(fā)育后期表達(dá)降低，可能會(huì)對(duì)籽粒的產(chǎn)量和發(fā)育造成負(fù)面影響。Bhati等[61]利用RNAi技術(shù)沉默小麥TaABCC13基因的表達(dá)，籽粒的植酸含量雖然降低22%～34%，但小麥的穗發(fā)育不良、籽粒灌漿減少，并且TaABCC13基因參與小麥的側(cè)根發(fā)生和重金屬解毒。MRP基因在植物體內(nèi)有著復(fù)雜的生物學(xué)功能，還不能簡(jiǎn)單通過敲除或沉默該基因的表達(dá)來進(jìn)行籽粒低植酸性狀的遺傳改良。

3 展望

培育籽粒低植酸品種是解決農(nóng)業(yè)磷資源、環(huán)境及動(dòng)物/人類營養(yǎng)問題的關(guān)鍵。較外源植酸酶添加等手段[97]，它仍是解決籽粒植酸磷問題的優(yōu)選方案。本文綜述提出的調(diào)控植酸磷積累關(guān)鍵基因可以作為未來育種的潛在靶標(biāo)。目前亟待解決的問題是，籽粒低植酸表現(xiàn)會(huì)伴隨產(chǎn)量下降、種子萌發(fā)率低等不良農(nóng)藝性狀，尤其是遺傳操作植酸合成途徑相關(guān)基因。未來可從3個(gè)方向著手，突破制約籽粒低植酸品種培育及應(yīng)用的瓶頸。

3.1 特異性修飾籽粒中關(guān)鍵基因的表達(dá)

植酸和其前體肌醇、肌醇磷酸鹽及衍生物肌醇焦磷酸鹽 (InsP7，InsP8) 行使著重要功能，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物和非生物脅迫的響應(yīng)、膜運(yùn)輸及光形態(tài)建成等[98]，針對(duì)肌醇代謝途徑的擾動(dòng)都可能會(huì)影響籽粒和植株的發(fā)育[99]。未來的研究應(yīng)該深入關(guān)鍵基因?qū)χ参锷L發(fā)育具體的調(diào)控功能，通過對(duì)籽粒中關(guān)鍵基因的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行定向修飾，而不影響植物其他組織中的肌醇代謝，尋找低植酸性狀與植物正常發(fā)育的平衡點(diǎn)。如前文所述，利用水稻和大豆的籽粒特異性啟動(dòng)子oleosin18[49]和vicilin[51]沉默植酸合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，既能調(diào)控植酸的合成又不造成籽粒的發(fā)育缺陷。

3.2 發(fā)掘優(yōu)良等位變異，結(jié)合新型基因編輯技術(shù)予以應(yīng)用

利用遺傳多樣性種質(zhì)資源，高通量分析籽粒植酸磷累積表型，找到能夠平衡低植酸和產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀的遺傳材料。隨后利用全基因組關(guān)聯(lián)或候選基因關(guān)聯(lián)等策略，挖掘作物基因組內(nèi)優(yōu)良的等位變異，這在低植酸大豆育種中已經(jīng)取得良好進(jìn)展[64]。通過傳統(tǒng)育種如雜交，可將低植酸性狀與籽粒高萌發(fā)率等農(nóng)藝性狀相結(jié)合[100]，能顯著提高田間出苗率[101]，但是存在后代性狀分離的缺陷。Rosso等[102]利用分子標(biāo)記輔助育種開發(fā)了針對(duì)大豆GmMIPS1基因的良好遺傳標(biāo)記，利用該技術(shù)可以將優(yōu)良等位變異導(dǎo)入到高產(chǎn)品種中予以應(yīng)用。近年來，以CRISPR/Cas9為代表的新型基因編輯技術(shù)發(fā)展迅猛，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、插入和替換，具有育種周期短、編輯效率高等優(yōu)勢(shì)[103]。在新型基因編輯技術(shù)的幫助下，可以精準(zhǔn)引入關(guān)鍵基因及優(yōu)良等位變異，大大加快籽粒低植酸品種的育種。

3.3 針對(duì)籽粒低植酸品種的磷營養(yǎng)管理

一般認(rèn)為，維持作物籽粒的正常萌發(fā)和幼苗的早期生長只需要籽粒磷濃度高于1 mg/g即可，剩余的大部分籽粒磷并不是種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育所必需[104]。但相較于野生型，籽粒低植酸品種對(duì)外源磷營養(yǎng)的供應(yīng)更為敏感[105]，是造成現(xiàn)存的低植酸品種籽粒的萌發(fā)和活力比野生型低的重要原因。因此，可以通過田間磷營養(yǎng)管理來提高低植酸品種籽粒的萌發(fā)率，如播種時(shí)增施種子啟動(dòng)磷肥或種子包膜，為籽粒低植酸品種進(jìn)行針對(duì)性的田間農(nóng)藝管理，這也是未來的研究重點(diǎn)。