徐 嚴(yán)，譚李梅，駱夏輝，楊 亞，唐志敏，周 閏，蔡建國

（郴州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院郴州分院，423000）

‘由良’蜜橘為日本選育的品種，系‘宮川’特早熟芽變，2006 年引入國內(nèi)試驗研究[1]，在浙江省永嘉、寧海等地栽培表現(xiàn)良好，極具發(fā)展前景[2-3]。湖南省郴州市“東江湖蜜橘”為地理標(biāo)志產(chǎn)品，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民致富的支柱產(chǎn)業(yè)之一[4]。東江湖蜜橘主栽柑橘品種為‘宮川’，由于品種老化等問題導(dǎo)致效益降低，引進(jìn)特早熟‘由良’蜜橘是提高“東江湖蜜橘”品質(zhì)的有效途徑。

長期無性繁殖及頻繁的區(qū)域調(diào)運(yùn)苗木使柑橘易感染病毒和類病毒病害，對柑橘產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失且尚無有效的防治藥劑。近年來，柑橘黃龍病的蔓延十分嚴(yán)重，培育和栽植無病毒苗木是防控黃龍病的關(guān)鍵措施之一。珠心苗培育和莖尖培養(yǎng)存在童期長、果實品質(zhì)不穩(wěn)定等問題，且柑橘成年態(tài)植株的莖尖難以直接誘導(dǎo)分化成完整植株。Murashige提出莖尖微芽嫁接技術(shù)，并證實可脫除柑橘病毒病。研究表明[5-6]，莖尖嫁接技術(shù)是目前脫除柑橘病毒和類病毒最有效的方法，可成功脫除黃龍病、衰退病、裂皮病等多種病害。

從田間直接采取柑橘莖尖受季節(jié)影響較大，莖段組織培養(yǎng)是獲得莖尖的重要途徑之一，但柑橘成年態(tài)莖段組培過程中污染率高、芽體增殖分化低等問題制約了相關(guān)技術(shù)的發(fā)展[7]。優(yōu)化柑橘成年態(tài)莖段消毒和培養(yǎng)方法，對提高莖尖嫁接脫毒效率，為柑橘無病毒苗木繁育提供技術(shù)支撐具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的外植體采自郴州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所果樹基地柑橘園，供試品種‘由良’蜜橘，砧木為枳，樹齡3 年。莖尖微芽嫁接的砧木種子為保存在實驗室的‘卡里佐’枳橙種子。

1.2 試驗處理與方法

1.2.1 砧木種子處理和試管砧木培養(yǎng)

挑選飽滿、無傷痕的種子，在室內(nèi)用無菌水沖洗干凈后，剝?nèi)ネ夥N皮并保濕，將種子倒入滅菌培養(yǎng)皿中。在超凈工作臺上加入75%酒精消毒30 s，再用1%NaClO 和吐溫20 消毒20 min，然后用無菌水沖洗種子3 次。用3 種方式進(jìn)行種子處理：剝除內(nèi)種皮、劃破內(nèi)種皮、直接播種。處理完成后，用鑷子輕輕夾住種子并送入裝有MS 固體培養(yǎng)基的試管里，每管1～2 粒種子，放入27 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，14 d 后統(tǒng)計種子污染率和萌芽率。砧木長到10～15 cm 時，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外植體采集

（1）單芽莖段的采集。2020 年6 月5 日（晴天）10：00，剪取無病蟲害、半木質(zhì)化枝條，裝入潔凈的塑料袋內(nèi)帶回實驗室，將枝條上的葉片剪去，自來水沖洗后用1%洗衣粉溶液浸泡2 h，再沖洗20 min，剪成2 cm 左右的單芽莖段，放入干凈的培養(yǎng)瓶中用無菌水浸泡保濕。

（2）多芽莖段的采集。于6 月15 日（晴天）10：00，從培養(yǎng)室內(nèi)剪取1 年生的無病蟲害、半木質(zhì)化枝條，裝入潔凈的塑料袋內(nèi)帶回實驗室，將枝條上的葉片剪去，自來水沖洗后用1%洗衣粉溶液浸泡2 h，再沖洗20 min，剪成帶有3 個腋芽的莖段，放入干凈的培養(yǎng)瓶中用無菌水浸泡保濕。

（3）直接采取莖尖。于6 月25 日（晴天）10：00，采取長2～3 cm 的嫩芽（帶2～3 片嫩葉），用濕潤棉花進(jìn)行保濕后帶回實驗室，在實驗室內(nèi)去除嫩葉，放入無菌培養(yǎng)皿中用無菌水保濕。

1.2.3 外植體消毒和培養(yǎng)

（1）單芽莖段的消毒。采用5 種方法對柑橘單芽莖段進(jìn)行消毒處理，即方法A：采用1%NaClO消毒20 min→無菌水沖洗5 次；方法B：采用3%NaClO 消毒20 min→無菌水沖洗5 次；方法C：采用5%NaClO 消毒20 min→無菌水沖洗5 次；方法D：采用1%NaClO 消毒20 min→無菌水沖洗5次；方法E：用1%NaClO 消毒25 min→無菌水沖洗5 次。每種方法均先用75%酒精處理30 s，其中方法A、B、C 從田間采樣，方法D、E 從培養(yǎng)室采樣。

（2）多芽莖段的消毒。在超凈工作臺上進(jìn)行消毒處理。先用75%酒精浸泡30 s，經(jīng)無菌蒸餾水沖洗后，放入1%NaClO 中消毒20 min，最后用無菌水沖洗3～5 次。

（3）田間采集的莖尖消毒。在超凈工作臺上進(jìn)行消毒處理。先用75%酒精浸泡30 s，經(jīng)無菌蒸餾水沖洗后，放入0.3%NaClO 中消毒5 min，最后用無菌水沖洗3～5 次。

莖段消毒后放入MS 固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基添加30.0 g/L 蔗糖和7.5 g/L 瓊脂。培養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃，光暗周期16 h/8 h。每處理3 次重復(fù)，培養(yǎng)15 d 后統(tǒng)計萌芽率、污染率等。

1.2.4 單芽莖段離體培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)

不同單芽莖段的培養(yǎng)基均以MS 為基本培養(yǎng)基，附加6-BA（濃度0.5、1.0、1.5 mg/L）和IBA（濃度0、0.05、0.1 mg/L）的不同濃度組合，每個濃度組合培養(yǎng)20 個單芽莖段，重復(fù)3 次。30 d 后觀察記載萌芽數(shù)量。培養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃，光暗周期16 h/8 h。

1.2.5 莖尖微芽嫁接及培養(yǎng)

在解剖鏡下剝?nèi)『?～4 個葉原基的莖尖嫁接于試管砧木苗上，放入MS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃，光暗周期16 h/8 h，光照強(qiáng)度為1 000～2 000 lx。每處理3 次重復(fù)，培養(yǎng)15 d 后統(tǒng)計腋芽數(shù)、出芽數(shù)、可用芽數(shù)，計算增殖倍數(shù)和利用率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007 和SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式試管播種對砧木種子萌發(fā)的影響

由表1 可知，內(nèi)種皮不同處理間的污染率具有顯著性差異，內(nèi)種皮剝除面積越大種子污染率越高，其中直接播種的污染率為17.5%，劃破內(nèi)種皮的污染率為32.5%，剝除內(nèi)種皮的污染率達(dá)75.0%。剝除內(nèi)種皮和劃破內(nèi)種皮的萌芽率均顯著高于直接播種，為60.0%，直接播種的萌芽率僅為32.5%。由于最終目的是獲得無污染的萌芽種子，故劃破內(nèi)種皮是砧木種子試管播種處理的理想方式。

表1 不同處理方式對砧木種子在14 d 萌發(fā)的影響

2.2 成年態(tài)莖段消毒方法的篩選

由表2 可知，不同消毒試劑、消毒時間及采樣地點對‘由良’蜜橘成年態(tài)莖段的消毒效果均有影響。從田間采集的外植體中，NaClO 的濃度越高污染率越低，褐化率越高，且均具有顯著差異。其中，1%NaClO 的污染率最高，為35.0%，褐化率最低，為45.0%；5%NaClO 的污染率最低，為5.0%，褐化率最高，為90.0%。試驗中發(fā)現(xiàn)，成活的成年態(tài)莖段初期均可萌芽，但由于污染和褐化等原因?qū)е潞笃跓o法繼續(xù)生長，隨著NaClO 濃度的升高萌芽率隨之降低，其中1%NaClO 的萌芽率最高，為20.0%。

表2 不同消毒方法對‘由良’蜜橘成年態(tài)單芽莖段消毒效果的影響

為了提高消毒效果，增加萌芽率，將試材從田間轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室培養(yǎng)，在培養(yǎng)室中抽梢，保持干凈的培養(yǎng)環(huán)境，避免枝條感染過多真菌或細(xì)菌。試驗結(jié)果表明，從培養(yǎng)室采集的成年態(tài)莖段用1%NaClO消毒時間為20 min 和25 min 的污染率一樣，但褐化率降低。消毒20 min 的萌芽率達(dá)到70.0%，比從田間采樣高50 個百分點，差異達(dá)顯著水平（表2）。

綜上所述，NaClO 濃度越高莖段污染率越低，褐化率越高，萌芽率越低，且從培養(yǎng)室采集的莖段污染率、褐化率都顯著低于田間采集的，萌芽率顯著高于田間采集的，即從培養(yǎng)室采集的成年態(tài)莖段用1%NaClO 消毒20 min 的消毒效果最好，污染率為20.0%，褐化率為10.0%，萌芽率達(dá)70.0%（表2）。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對莖段離體培養(yǎng)的影響

為了獲得更多的莖尖數(shù)量，提高‘由良’蜜橘脫毒效率，以MS 為基本培養(yǎng)基，添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比，分析不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)單芽莖段的效果，并同時觀察不同培養(yǎng)基條件下莖尖數(shù)量是否有差異。由表3 可以看出，6-BA 為0.5 mg/L、IBA 為0 時萌芽率最高，達(dá)95.5%，但增殖倍數(shù)最低；6-BA為1.0 mg/L、IBA 為0.05 mg/L 時萌芽率次之，為91.6%，但增殖倍數(shù)最大，達(dá)3.0。綜合來看，6-BA為1.0 mg/L、IBA 為0.05 mg/L 時，對‘由良’單芽莖段離體培養(yǎng)的效果最好。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對單芽莖段離體培養(yǎng) 的影響

2.4 莖尖來源對微芽嫁接增殖倍數(shù)和利用率的影響

在莖段培養(yǎng)的增殖過程中，單芽莖段多存在部分不定芽不具莖尖無法進(jìn)行脫毒試驗。單芽莖段和多芽莖段的不定芽的生長速度均不一致，反復(fù)拿出莖段取出莖尖的過程會增加污染率，導(dǎo)致后續(xù)得到的莖尖無法利用。因此，對不同莖尖來源的增殖倍數(shù)和利用率做了對比，其中，單芽莖段使用最佳培養(yǎng)基MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L IBA 培養(yǎng)，多芽莖段使用MS 基本培養(yǎng)基培養(yǎng)。試驗結(jié)果表明（表4），從培養(yǎng)室直接采取莖尖進(jìn)行后續(xù)試驗無法增殖，多芽莖段的不定芽再生增殖倍數(shù)為2.2，單芽莖段的不定芽再生增殖倍數(shù)最大，可達(dá)3.0，顯著高于多芽莖段的不定芽。但多芽莖段不定芽利用率顯著高于單芽莖段不定芽利用率，達(dá)81.8%。同時，在外植體數(shù)量相同的情況下，由于腋芽數(shù)量的差異會影響獲得的可用芽數(shù)量，多芽莖段產(chǎn)生的不定芽數(shù)量顯著高于單芽莖段。綜上所述，使用多芽莖段產(chǎn)生不定芽的方式來獲得莖尖進(jìn)行脫毒試驗的方法最優(yōu)。

表4 莖尖來源對微芽嫁接增殖倍數(shù)和利用率的影響

3 討論與結(jié)論

雖然利用成年態(tài)組織培養(yǎng)已經(jīng)有一定的培養(yǎng)體系，但外部細(xì)菌、真菌和內(nèi)生菌較多，導(dǎo)致污染率高和褐化率高的問題一直存在。利用脫除內(nèi)外種皮的方法減少萌發(fā)阻力，是加快萌芽速度的有效方法。吳思夢等[8]研究表明，剝除內(nèi)外種皮使用不同消毒方法的污染率最高為5.6%。本研究在實際操作過程中發(fā)現(xiàn)，在超凈工作臺上剝除內(nèi)種皮需要較長時間，可能由于人為操作不當(dāng)，污染率增加。從試驗結(jié)果能看出，劃破內(nèi)種皮的方式可以大幅減少操作時間，降低污染率。陳國華等[9]發(fā)現(xiàn)，0.1%HgCl2消毒效果比10%NaClO 溶液好，最高成活率可達(dá)86.09%。由于升汞的安全系數(shù)不高，本研究還是采用NaClO 消毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NaClO 濃度達(dá)到5%時，褐化率高達(dá)90.0%，萌芽率僅為5.0%，可能是由于采集的莖段成熟度不一致，與陳澤雄等[10]發(fā)現(xiàn)不同成熟度的材料消毒效果不同的研究結(jié)果相一致。很多研究表明，不同季節(jié)、不同天氣取樣會影響污染率[8,11]。本研究選擇在晴天干燥的環(huán)境下取樣，以降低污染率，但試驗進(jìn)程非常緩慢?？紤]到田間環(huán)境微生物眾多，故在培養(yǎng)室中直接培養(yǎng)原材料能控制環(huán)境條件，結(jié)果也表明在干凈的環(huán)境條件下生長的外植體污染率均只有20.0%，且使用1%NaClO 消毒時培養(yǎng)室內(nèi)生長的外植體較室外生長的外植體污染率顯著降低。

將莖尖嫁接在無毒砧木上解決了發(fā)根難、生長慢等問題，應(yīng)用十分廣泛。由于田間采集接穗受季節(jié)、天氣影響較大，多數(shù)研究者利用組織培養(yǎng)獲得莖尖進(jìn)行脫毒。前人多對莖段先進(jìn)行初代培養(yǎng)再進(jìn)行繼代培養(yǎng)以獲得莖尖，劉月[12]的研究結(jié)果表明，6-BA 的濃度越高，誘導(dǎo)率越高，但超過1.0 mg/L 時可能會導(dǎo)致愈傷組織增加、不定芽質(zhì)量降低。本研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)成功后側(cè)芽會陸續(xù)冒出，可直接增殖來獲得莖尖加快脫毒效率，但不同的植物生長調(diào)節(jié)劑水平下不定芽的粗壯程度不同。6-BA 濃度為1.0 mg/L、IBA 為0.05 mg/L 時，對‘由良’單芽莖段離體培養(yǎng)效果最好，萌芽率為91.6%，增殖倍數(shù)為3.0。

陳毅群等[13]、李麗[14]的研究表明，采集田間接穗進(jìn)行微芽嫁接受季節(jié)影響較大，夏季萌發(fā)率最高，春秋季萌芽率顯著低于夏季，利用誘導(dǎo)不定芽進(jìn)行微芽嫁接的萌發(fā)率不受季節(jié)影響且顯著高于田間芽。本試驗通過培養(yǎng)室培養(yǎng)原材料，控制溫濕度讓植株處于最佳抽梢環(huán)境條件，也可避免接穗受季節(jié)影響導(dǎo)致萌發(fā)率不高的現(xiàn)象，但結(jié)果表明脫毒使用的莖尖在萌芽1 周左右采集脫毒效率最高，無法在短期內(nèi)將植株上所有莖尖全部利用上，而通過莖段培養(yǎng)，可以分批次獲取莖尖。試驗結(jié)果表明，使用多芽莖段培養(yǎng)的不定芽利用率最高，達(dá)81.8%。

莖尖嫁接技術(shù)是目前使用最廣泛的柑橘脫毒技術(shù)，此前多在莖尖大小、嫁接方法上研究以提高脫毒率，本研究主要利用組織培養(yǎng)獲得莖尖，以打破季節(jié)限制加快脫毒效率。在前人基礎(chǔ)上對種子、成年態(tài)莖段消毒方法和培養(yǎng)方法及莖尖來源進(jìn)行研究，在一定程度上增加了獲取莖尖的數(shù)量和質(zhì)量。