李 建，溫伯泉，郭士兵，王 巖

(1.開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院麻醉科，河北 唐山 063100；2.唐山市中心醫(yī)院麻醉科，河北 唐山 063000)

骨折創(chuàng)傷部位局部免疫細胞會增加并分泌白細胞介素(IL)17等細胞因子，參與骨組織形成，增加成骨細胞的活性，促進骨折部位愈合[1]。辛伐他汀的主要功能是抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，從而起到降低血脂的作用，在臨床上主要被用于治療高膽固醇血癥和冠心病等，其也可以顯著促進骨質(zhì)疏松引起的骨折愈合[2]。本研究將通過不同劑量辛伐他汀干預(yù)大鼠肋骨骨折模型，探討不同劑量辛伐他汀對大鼠骨折后不同時間免疫細胞及炎癥因子釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD公司)；4 ℃冰箱(合肥美菱股份有限公司)；SC-3610型低速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；pectraMax190型酶標儀(美國MD公司)；一次性使用微量采血管(20 μl，泰州市宇杰醫(yī)療器械有限公司)。

1.1.2 藥品與試劑：乙醚購自天津市申泰化學(xué)試劑有限公司；辛伐他汀(S6196，5 mg)購于美國Sigma公司；Rat 腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(RAB0479)和Rat IL-17 ELISA試劑盒(RAB1906)購于美國Sigma公司；PE Anti-CD8(ab95526，50 μl)和APC Anti-CD4(ab256309，100 μl)購于美國Abcam公司。

1.1.3 實驗動物：8～10周齡雄性SPF級SD大鼠，由北京維通利華實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肋骨骨折模型的建立：60只8～10周齡雄性SD大鼠于SPF級鼠房飼養(yǎng)，室溫調(diào)節(jié)在(25±2)℃，相對濕度為40%～65%，12 h/12 h晝夜交替照明，自由攝取食物和飲用水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為三組，即對照組和辛伐他汀低、高劑量組(5、10 mg/kg)，每組20只[3]。以10%水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉，大鼠取俯臥位，常規(guī)剪毛后碘伏消毒，鋪無菌巾，沿肋骨走形作斜行切口(長約1 cm)切開背部皮膚，肌肉，暴露第6肋骨，銳性剝離肋間肌肉，距脊柱約1.5 cm處用眼科剪剪斷，復(fù)位，分層縫合。第2周和第4周，小動物X光活體成像系統(tǒng)下拍攝X線片觀察骨折對位及愈合情況[4]。以二甲基亞砜溶解稀釋辛伐他汀，按以下方式給藥，高劑量組大鼠灌胃10 mg/(kg·d)，1日1次，給藥4周；低劑量組大鼠灌胃5 mg/(kg·d)，1日1次，給藥4周；對照組大鼠給于等量二甲基亞砜，1日1次，給藥4周。每周大鼠眼眶采血，備用。

1.2.2 流式細胞技術(shù)檢測大鼠血液CD4、CD8抗體：大鼠眼眶取血后，紅細胞裂解血液，1 500 r/min，離心半徑13.5 cm，離心5 min，磷酸緩沖液(PBS)重懸外周血單個核細胞，將配好的CD4、CD8抗體加入106細胞中，4 ℃避光孵育30 min，以2 ml PBS清洗后，采用流式細胞術(shù)檢測細胞亞型及細胞比例[5]。

1.2.3 ELISA法檢測外周血細胞因子：采用ELISA檢測試劑盒檢測血清樣本中TNF-α、IL-17含量，每組設(shè)置3個復(fù)孔，操作步驟嚴格按照說明書進行[6]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同劑量辛伐他汀干預(yù)對大鼠肋骨骨折的影響

三組大鼠在給藥2周后骨折線均較明顯，骨折處骨痂明顯，包繞于骨折區(qū)域，骨皮質(zhì)不連續(xù)；與對照組相比，辛伐他汀低劑量組、高劑量組大鼠均形成骨痂。給藥4周后，辛伐他汀低劑量組和高劑量組大鼠骨折部位高密度影像，骨皮質(zhì)較連續(xù)，骨折線幾乎不可見，殘留骨痂少，生長較連續(xù)，見圖1。

圖1 不同劑量辛伐他汀干預(yù)對大鼠肋骨骨折的影響Fig 1 Effects of different doses of simvastatin on rib fracture in rats

2.2 不同劑量辛伐他汀干預(yù)對肋骨骨折大鼠T細胞的影響

給藥第1、2周，辛伐他汀高劑量組、低劑量組大鼠CD4+、CD8+T淋巴細胞含量與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且具有CD4+、CD8+T淋巴細胞含量升高的趨勢；給藥第3、4周，辛伐他汀高劑量組、低劑量組大鼠CD4+、CD8+T淋巴細胞含量低于對照組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；辛伐他汀低劑量組與高劑量組大鼠間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同劑量辛伐他汀干預(yù)對肋骨骨折大鼠T淋巴細胞含量的影響Tab 1 Effects of different doses of simvastatin on T cells in rats with rib fracture

2.3 不同劑量辛伐他汀干預(yù)對肋骨骨折大鼠CD4+/CD8+比值的影響

與對照組相比，辛伐他汀高劑量組、低劑量組大鼠的CD4+/CD8+比值在治療第1、2周顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 不同劑量辛伐他汀干預(yù)對肋骨骨折大鼠CD4+/CD8+T細胞比例的影響Tab 2 Effects of different doses of simvastatin on the ratio of CD4+/CD8+ T cells in rats with rib fracture

2.4 不同劑量辛伐他汀干預(yù)對肋骨骨折大鼠外周血TNF-α、IL-17水平的影響

相對于對照組，辛伐他汀高劑量組、低劑量組大鼠在給藥第1、2周的TNF-α、IL-17水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.001)，高劑量組、低劑量組大鼠之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；辛伐他汀高劑量組和低劑量組在治療第3周和第4周的TNF-α、IL-17水平高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高劑量組大鼠的TNF-α、IL-17水平低于低劑量組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 辛伐他汀干預(yù)對肋骨骨折大鼠外周血TNF-α、IL-17水平的影響Tab 3 Effects of different doses of simvastatin on the levels of TNF-α and IL-17 in peripheral blood of rats

3 討論

近年來，隨著生活水平的提高，肥胖、糖尿病等慢性疾病引發(fā)骨結(jié)構(gòu)破壞的比例逐漸升高，其結(jié)果會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥等疾病，約有10%～20%由此發(fā)生的骨折會出現(xiàn)延期愈合或不愈合的現(xiàn)象，嚴重影響患者的健康。外力創(chuàng)傷致骨折后，骨組織斷端間會發(fā)生組織修復(fù)的過程，最終在成骨細胞與破骨細胞的動態(tài)平衡以及周圍組織細胞的營養(yǎng)支持下恢復(fù)正常的結(jié)構(gòu)和生理學(xué)功能。骨折愈合的機制較為復(fù)雜，涉及的細胞和反應(yīng)階段較多，骨組織愈合時間較長，且各階段參與的細胞與因子釋放均有所不同。骨免疫學(xué)說于21世紀初提出，通過闡明骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間的信號分子，轉(zhuǎn)錄因子以及受體的交叉機制，來描述免疫與骨骼的復(fù)雜關(guān)系。骨免疫學(xué)包括骨和免疫系統(tǒng)交叉調(diào)節(jié)的所有方面，包括各種細胞類型、信號通路、細胞因子和趨化因子，包括在穩(wěn)態(tài)和致病條件下骨細胞對免疫細胞的主動調(diào)節(jié)，這些都是研究如何控制骨和免疫相關(guān)疾病的核心部分[7-10]。研究結(jié)果表明，在實驗鼠的骨折部位免疫細胞會增加并產(chǎn)生IL-17，增加參與骨組織形成的造骨細胞的活性，從而促進骨折部位愈合[11]。干擾實驗鼠骨折部位形成免疫細胞及其生成的IL-17細胞因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗鼠的骨折愈合出現(xiàn)延遲。

辛伐他汀為羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，除了作為調(diào)節(jié)血脂藥調(diào)節(jié)膽固醇以外，還具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，并通過提高成骨細胞活性和抑制破骨細胞的激活，影響骨的合成與代謝[12]。本研究通過不同劑量辛伐他汀干預(yù)大鼠骨折模型，探討辛伐他汀對骨折后大鼠獲得性免疫細胞的影響，X光活體成像結(jié)果表明，辛伐他汀對骨折愈合有促進作用，同時對早期CD4+、CD8+T淋巴細胞含量均具有顯著的提高效果。提示辛伐他汀可增強骨折早期機體免疫狀態(tài)，促進機體應(yīng)對外界感染做出及時響應(yīng)，有助于骨折的恢復(fù)。CD4+、CD8+T淋巴細胞占人T淋巴細胞的1%～2%，但在一些疾病中其比例會發(fā)生顯著變化。CD4+/CD8+的比值為免疫調(diào)節(jié)的一項指標，在人類中正常值約1.4～2.0，若其比值>2.0或<1.4，表明細胞免疫功能紊亂，因此，CD4+/CD8+比值能夠直接反映人體免疫功能[13-16]。本研究結(jié)果表明，辛伐他汀給藥后第1、2周，辛伐他汀低劑量組和高劑量組大鼠均出現(xiàn)CD4+、CD8+T淋巴細胞含量顯著增加的現(xiàn)象，同時CD4+/CD8+比值顯著升高，而辛伐他汀低劑量組與高劑量組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示辛伐他汀有助于骨折早期免疫系統(tǒng)狀態(tài)的平衡，可提高整體免疫系統(tǒng)功能。

TNF主要由活化的巨噬細胞、自然殺傷細胞及T淋巴細胞產(chǎn)生，骨折后外周血TNF-α水平會發(fā)生顯著變化，在骨折前期會顯著升高，而在骨折后期開始降低，其機制與刺激成骨細胞與破骨細胞平衡，激活免疫系統(tǒng)功能，增強組織修復(fù)密切相關(guān)[10]。本研究通過檢測大鼠外周血TNF-α水平發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀干預(yù)會顯著提高早期外周血TNF-α水平，并且在低劑量時即可發(fā)生顯著的變化，同時在干預(yù)后期，其水平依然高于對照組，提示辛伐他汀可以促進骨折后免疫系統(tǒng)的激活以及早期骨組織修復(fù)應(yīng)答，進而有利于骨折創(chuàng)傷的恢復(fù)。

IL-17由CD4+T淋巴細胞分泌，是炎癥反應(yīng)的早期啟動因子，可以通過促進釋放前炎癥細胞因子來放大炎癥反應(yīng)，能夠誘導(dǎo)上皮細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞合成分泌IL-6、IL-8、粒細胞集落刺激因子和前列腺素E2，促進細胞間黏附分子的表達；IL-17與受體結(jié)合后，可通過促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑和核因子κB途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用[17-18]。Th17細胞能夠分泌產(chǎn)生IL-17 A、IL-17F、IL-6以及TNF-α等，上述細胞因子可以集體動員、募集及活化中性粒細胞。Th17細胞產(chǎn)生的IL-17能有效介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng),并且在骨丟失中發(fā)揮重要作用[19-20]。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，給藥后第1、2周辛伐他汀低劑量組和高劑量組大鼠均出現(xiàn)IL-17水平顯著升高的現(xiàn)象，提示辛伐他汀在早期炎癥反應(yīng)過程中，發(fā)揮了促進炎癥因子釋放的作用，可增強炎癥因子誘導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，有利于組織修復(fù)和抗感染能力，促進早期骨骼修復(fù)。

綜上所述，辛伐他汀對大鼠骨折早期免疫細胞平衡產(chǎn)生影響，并增加骨折早期免疫細胞因子TNF-α和IL-17釋放，促進早期骨骼愈合。