湯 霆，顧 暉，張柏銀，唐吉偉

(湖南省腦科醫(yī)院麻醉手術(shù)科，湖南 長沙 410011)

腎缺血再灌注損傷可以導(dǎo)致原發(fā)性移植腎功能障礙，并且是腎移植早期失敗的主要原因[1]。因此，進(jìn)一步深入研究腎缺血再灌注損傷的機制，對于臨床上腎移植損傷的防治和相關(guān)理論研究有著重要意義。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬在改善腎缺血再灌注損傷的病理過程中極為重要[2]。傳統(tǒng)中藥丹參具有活血化瘀的功效，其主要有效成分為丹參酮ⅡA，丹參酮ⅡA被廣泛應(yīng)用于臨床，對腎缺血再灌注損傷有一定的保護作用[3]。右美托咪定為腎移植過程中常用的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥，研究結(jié)果顯示，其在缺血再灌注損傷中具有一定的器官保護作用[4-6]。但丹參酮ⅡA聯(lián)合右美托咪定的抗腎缺血再灌注效應(yīng)是否增強尚不清楚。本研究旨在探討丹參酮聯(lián)合右美托咪定通過單磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)/Unc-51樣自噬激活激酶1(ULK1)通路介導(dǎo)的自噬減輕腎缺血再灌注損傷的作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 儀器

DT2000型計算機圖像采集分析系統(tǒng)(日本尼康公司);MS-TS型電子天平(中國上海第二天平儀器廠);3 cm無創(chuàng)動脈夾(上海醫(yī)療器械有限公司);H500型電子顯微鏡(日本日立公司);SD1型全自動生化測定儀(瑞士羅氏公司)。

1.2 藥品與試劑

丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，規(guī)格為每支2 ml∶10 mg，批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字H31022558)；鹽酸右美托咪定注射液[江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格為每支2 ml∶200 μg(按右美托咪定計)，批號為191011BP，批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字H20090248]；2%戊巴比妥鈉(0.015 ml/kg，湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗室配制)；抗β-actin兔多克隆抗體[圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司]；白細(xì)胞介素(IL)10酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)；AMPK一抗[圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司]；ULK1一抗[圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司]；腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)；IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)。

2 方法

2.1 動物模型及分組

SPF級健康Wistar大鼠50只，體重200～250 g(湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供)，隨機均分為五組：A組(丹參酮ⅡA+右美托咪定)、B組(右美托咪定)、C組(丹參酮ⅡA)、D組(缺血再灌注模型)和E組(假手術(shù)組)。五組大鼠稱重后，采用苯巴比妥鈉65 mg/kg腹腔注射麻醉后制備大鼠急性腎缺血再灌注損傷模型。A、B、C和D組大鼠用無損傷血管夾阻斷雙側(cè)腎蒂45 min，如果腎臟顏色先由鮮紅色變蒼白，再轉(zhuǎn)為暗紅色，則表明腎血管夾閉成功，同時用超聲探頭監(jiān)測腎動脈血流情況。A、B和C組大鼠分別在缺血前30 min經(jīng)腹腔注射丹參酮ⅡA注射液+右美托咪定25 μg/kg、右美托咪定25 μg/kg和丹參酮ⅡA注射液。D、E組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液。再灌注24 h后，取五組大鼠的腎組織和血標(biāo)本。本研究方案已得到湖南省腦科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 病理切片觀察：經(jīng)過脫水，石蠟包埋處理后，將腎組織切片3～4 μm，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下400倍觀察，得出病理學(xué)結(jié)果。

2.2.2 細(xì)胞凋亡檢測：細(xì)胞凋亡用TUNEL法檢測。將3 μm厚度的腎組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟后，分別用核苷酸、TDT酶混合液、辣根過氧化物酶和蛋白酶K標(biāo)二抗孵育，DAB顯色。陰性對照組是沒有TDT酶的基液。細(xì)胞核呈棕黃色顆粒或棕褐色為TUNEL陽性反應(yīng)。隨機抽取每張切片的5個高倍視野(400倍)，統(tǒng)計凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式計算凋亡指數(shù)(AI)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.2.3 AMPK和ULK1蛋白表達(dá)的檢測：取腎組織標(biāo)本0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，加入組織裂解液，離心20 min(6 000 r/min，離心半徑10 cm)，設(shè)定4 ℃、10 000 g，用上清液進(jìn)行蛋白定量檢測；接著進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜中；最后使用含5%脫脂乳的TBST溶液在室溫(25 ℃)密封保存1 h，分別加入抗ULK1一抗和抗AMPK過夜，維持4 ℃，TBST洗膜3次各5 min，加入上述二抗室溫孵育1 h，將抗β-actin兔多克隆抗體作為對照，在Smart Chemi ECL下顯影并分析灰度值(ImageJ2X軟件)，以目的蛋白條帶與對照(β-actin)蛋白條帶的灰度值比值來反映ULK1和AMPK蛋白的表達(dá)水平。

2.2.4 細(xì)胞因子水平測定：將血標(biāo)本2 ml于室溫下靜置30 min，離心5 min(6 000 r/min，離心半徑10 cm)，留血清。參照說明書，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清TNF-α、IL-6和IL-10水平。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 腎組織病理學(xué)改變

A組大鼠腎小管擴張程度和腎小管上皮細(xì)胞腫脹程度均不明顯，腎小球改變不明顯；B組大鼠腎小球擴張程度輕，腎小管上皮細(xì)胞腫脹程度輕，腎小管擴張程度為中度；C組大鼠腎組織病理學(xué)改變與A組類似；D組大鼠腎組織則有明顯病理變化，可見腎組織切片標(biāo)本部分有凝固性壞死、脫落，光學(xué)顯微鏡下可見腎小球部分壞死，腎小管上皮細(xì)胞高度腫脹、變性，腎小管明顯擴張，管壁增厚，管腔狹窄；E組大鼠腎組織在光學(xué)顯微鏡下可見腎小管排列整齊，間質(zhì)無充血水腫，見圖1。

A.A組；B.B組；C.C組；D.D組；E.E組A.group A;B.group B;C.group C;D.group D;E.group E圖1 五組大鼠腎組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果Fig 1 HE staining of renal tissue of rats in five groups

3.2 細(xì)胞凋亡情況

A、B、C、D和E組大鼠細(xì)胞的AI分別為(16.87±3.82)、(18.34±4.28)、(18.61±3.62)、(34.75±6.03)和(2.78±0.51)。E組大鼠細(xì)胞凋亡不明顯；D組大鼠可見大量的凋亡細(xì)胞和嚴(yán)重的組織損傷；A組大鼠的組織損傷較輕，僅見散在的凋亡細(xì)胞；B、C組大鼠組織損傷輕微，可見少量的凋亡細(xì)胞。與E組比較，A、B、C和D組大鼠細(xì)胞的AI明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與D組比較，A、B和C組大鼠細(xì)胞的AI明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TUNEL法檢測的五組大鼠細(xì)胞凋亡情況見圖2。

A.A組；B.B組；C.C組；D.D組；E.E組A.group A;B.group B;C.group C;D.group D;E.group E圖2 TUNEL法檢測的五組大鼠細(xì)胞凋亡情況Fig 2 Cell apoptosis detected by TUNEL method in five groups

3.3 AMPK和ULK1蛋白表達(dá)

與D組比較，A組大鼠腎組織中的AMPK及ULK1表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且A組大鼠腎組織中的AMPK和ULK1表達(dá)較B、C組少(P<0.05)；與E組比較，A組大鼠腎組織中的AMPK和ULK1表達(dá)較多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫印跡法檢測的五組大鼠腎組織中AMPK、ULK1蛋白表達(dá)情況見表1、圖3。

圖3 免疫印跡法檢測的五組大鼠AMPK、ULK1蛋白表達(dá)情況Fig 3 AMPK and ULK1 protein expression detected by Western blot in five groups

表1 五組大鼠腎組織中AMPK、ULK1蛋白表達(dá)比較Tab 1 Comparison of AMPK and ULK1 protein expression in renal tissues of five groups of

3.4 組織因子水平

與E組比較，A、B、C和D組大鼠的炎癥指標(biāo)(IL-10、IL-6和TNF-α)水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與B、C和D組比較，A組大鼠的IL-6、TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 五組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平比較Tab 2 Comparison of serum levels of TNF-α,IL-6 and IL-10 among five groups of

4 討論

傳統(tǒng)中藥丹參通過獨特的辨證治療和多靶點機制發(fā)揮護腎、改善氣滯血瘀的功效?，F(xiàn)代對丹參有較多的藥理學(xué)研究。丹參酮是丹參的主要成分，丹參酮ⅡA注射液被廣泛應(yīng)用于臨床，并且不良反應(yīng)少。有研究結(jié)果認(rèn)為，術(shù)前積極應(yīng)用丹參酮ⅡA注射液可提高血清超氧化物歧化酶和血清谷胱甘肽過氧化物酶活性，有效改善術(shù)后腎缺血再灌注損傷，其機制是減少了缺血再灌注過程中產(chǎn)生的氧自由基從而減輕組織細(xì)胞的損傷[7]。缺血再灌注損傷屬于西醫(yī)的概念，在中醫(yī)的范疇中并沒有提及，但從中醫(yī)學(xué)角度來看，人的精神活動由五臟精氣化生和充養(yǎng)，存儲精氣，若精氣不足，則腎虛，缺血即所謂氣血虧虛，腎精虧損。缺血再灌注后，因腎精氣不足，氣血的運行受阻，血瘀氣滯。丹參具有活血化瘀之功效。五臟藏精氣而不泄，以藏為貴。氣血運行通暢，則氣血滿盈，腎精得藏而復(fù)其功用。眾多研究結(jié)果表明，丹參在腦、心肌及腎缺血再灌注損傷等方面均有較好的療效[8-13]?？梢姷⒃诨钛鐾ńj(luò)方面發(fā)揮著重要作用，使臟得藏，腑得通，各得其用。

自噬是一種維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞完整性的“自我進(jìn)食”過程。以微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)Ⅰ/Ⅱ和Beclin1的變化為特征的自噬功能障礙參與了各種腎損傷[14]。通常通過測定自噬標(biāo)志性指標(biāo)來檢測所有活細(xì)胞中自噬的動態(tài)過程，除了上述2個指標(biāo)外，還包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1、AMPK和ULK1復(fù)合物[15]。據(jù)文獻(xiàn)報道，活化的AMPK可磷酸化ULK1，ULK1作為調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵分子，可提高FUNDC1與LC3結(jié)合的效率[16]。提示AMPK可能通過上游啟始蛋白ULK1的調(diào)節(jié)作用從而發(fā)揮細(xì)胞自噬功能。自噬與細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系。在某些情況下，上調(diào)自噬能抑制細(xì)胞調(diào)亡[17]；而抑制自噬則能導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡[18]。相關(guān)研究結(jié)果揭示了自噬與炎癥因子的關(guān)系，細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和分泌在某種程度上受自噬的直接影響[19]。以上研究結(jié)果表明，自噬作用可能減輕炎癥因子的釋放，從而減輕腎缺血再灌注損傷。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎缺血再灌注導(dǎo)致自噬關(guān)鍵分子AMPK和ULK1表達(dá)升高，IL-6、TNF-α表達(dá)增強，IL-10表達(dá)輕度升高；丹參酮ⅡA聯(lián)合右美托咪定降低了AMPK和ULK1的表達(dá)及其磷酸化，抑制了炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)，同時大幅增加了抗炎因子IL-10的表達(dá)。由此推斷，腎缺血再灌注時，使用丹參酮ⅡA聯(lián)合右美托咪定對腎功能有保護作用，可能是通過調(diào)控AMPK/ULK1信號通路，進(jìn)而調(diào)控炎癥相關(guān)因子(TNF-α、IL-6和IL-10)的表達(dá)水平，減輕組織一系列連鎖炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，從而減少腎組織病理學(xué)改變，最終緩解腎功能損害。